Селективный Истощение микроглии от мозжечка ЗК культур, используя L-лейцина

Резюме

Microglia can influence neurons and other glia in culture by various non-cell autonomous mechanisms. Here, we present a protocol to selectively deplete microglia from primary neuronal cultures. This method has the potential to elucidate the role of microglial-neuronal interactions, with implications for neurodegenerative conditions where neuroinflammation is a hallmark feature.

Аннотация

Microglia, the resident immunocompetent cells of the CNS, play multifaceted roles in modulating and controlling neuronal function, as well as mediating innate immunity. Primary rodent cell culture models have greatly advanced our understanding of neuronal-glial interactions, but only recently have methods to specifically eliminate microglia from mixed cultures been utilized. One such technique – described here – is the use of L-leucine methyl ester, a lysomotropic agent that is internalized by macrophages and microglia, wherein it causes lysosomal disruption and subsequent apoptosis^13,14. Experiments using L-leucine methyl ester have the power to identify the contribution of microglia to the surrounding cellular environment under diverse culture conditions. Using a protocol optimized in our laboratory, we describe how to eliminate microglia from P5 rodent cerebellar granule cell culture. This approach allows one to assess the relative impact of microglia on experimental data, as well as determine whether microglia are playing a neuroprotective or neurotoxic role in culture models of neurological conditions, such as stroke, Alzheimer’s or Parkinson’s disease.

Введение

Человеческий мозг содержит оценкам, 85 миллиардов нейронов и дальнейшие 85 миллиардов без нервных клеток глии в том числе ^1. Для большей части последних 100 лет неврологи, ориентированных преимущественно на нейронной популяции клеток, полагая, глиальные клетки, чтобы быть немного больше, чем пассивные поддерживающих клеток, которые представили структурную поддержку для нейронов - отсюда греческого этимологии "глии 'в переводе с английского, как "клей". Однако в последнее время, становится все более очевидным, что нейронные-глиальных взаимодействий может быть гораздо более фундаментальное значение для основных аспектов нейробиологии, нейрофизиологии и генезиса и прогрессирования многих нейродегенеративных заболеваний. Мозжечка ЗК (CGCs), наиболее распространенным однородная нейронная населения в человеческом мозге, доминировать в мозжечок и составляют более 90% своих клеточных составляющих. Следовательно, эти клетки широко используются в пробирке в качестве модельной системы для тон изучению развития нейронов, функции и патологии ^2-6.

Тем не менее, CGC культуры по-прежнему содержат микроглии и других глии в возможно значительных пропорциях. В результате, данные, отображающие CGC предположительно прямые нейрональные ответов на различных обработок клеток на самом деле может возникнуть - в частично или полностью - от косвенного вторичной реакции соседних глии в культуре. Для оценки этого, мы селективно элиминируют микроглии от CGC нейрональных культур с помощью L-лейцина метилового сложного эфира (LME). LME является lysomotropic агент первоначально использовались выборочно уничтожать макрофагов ^7, и с тех пор используется также выборочно разрушают микроглии от нервных, астроцитов и глиальных культур смешанных ^8,9,10. ЛБМ интернализуется макрофагами и микроглии, в котором он вызывает нарушение лизосом и последующее апоптоз ^13,14. Макрофаги и микроглии характерно богаты лизосом, заставляя их быть particulaжелезная дорога уязвимы при воздействии лечения LME. Этот протокол обеспечивает мощный, но простой и легкий способ удостовериться вклад микроглии в экспериментах с использованием CGC и другие нейронные системы / глиальные культуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты, описанные здесь, были выполнены в соответствии с Соединенным Королевством животных (научные процедуры) Закона 1986 года.

1. Подготовка инструментов, медиакультуры и блюда

1. Приготовьте два из нержавеющей стали лаборатории рассекает ножницы и два из нержавеющей стали лабораторные щипцы. Автоклав все инструменты и место в культуре капот O / N в ультрафиолетовом свете (УФ) светом для стерилизации.
2. Сделать 500 мл минимальной необходимой медиа (MEM) культуральной среды (10% фетальной бычьей сыворотки [FBS], 20 мМ KCl, 25 мМ NaHCO _3, 30 мМ D-глюкозы, 2 мМ L-глутамина, 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина и 6 мкг / мл ампициллина) и фильтр стерилизуют. Хранить при 4 ° С в течение месяца.
3. Подготовка 24-луночные культуры, содержащие 14 мм, толщиной 1 номер покровные. Автоклав покровные и пальто в 100 мг / л поли-D-лизина (PDL), как описано ранее ^3. УФ-свет стерилизации O / N.

2. Подготовка CGC культуры Solutions

1. Готовят раствор "А" (100 мл) в автоклаве, обработанной УФ-светом, стерильной дН ₂ O, содержащий 250 мг глюкозы, 300 мг бычьего сывороточного альбумина [BSA] 955 мг в забуференном фосфатом солевом растворе PBS [] (Са ²⁺ и Mg ⁺ бесплатно), и 1 мл 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O.
2. Готовят раствор 'В' (10 мл), содержащий 1 мл 5 мг / мл трипсина, разведенного в 9 мл раствора А.
3. Подготовка 'C' решение (10 мл), содержащие 1000 единиц ДНКазы, 0,5 мг ингибитора трипсина сои, 100 мкл 3,8% MgSO ₄ · 7H ₂ O, разбавленные до 10 мл раствора А.
4. Готовят раствор 'D' (20 мл), содержащий 3,2 мл раствора С, разбавленного до 20 мл раствора А.
5. Подготовка сбалансированный солевой раствор (EBSS) решение BSA / Эрла, содержащий EBSS, 25 мМ NaHCO _3, 3 мМ MgSO ₄ · 7H ₂ O, и4% БСА, рН 7,4, как описано ранее ^3.
6. Подготовьте LME добавлением чистой LME в 5 мл культуральной среды МЕМ, чтобы получить конечную концентрацию 150 мМ LME, возвращают раствор до рН 7,4 с помощью рН-метр настольный, и фильтр стерилизуют с помощью 28 мм полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм шприца фильтр.

3. Культивирование CGCs

1. Соберите мозжечка от 4-7-дневных крысят, как описано ранее ^3. Сразу же в чашку Петри, содержащую 5 мл раствора А на льду.
2. Вылейте излишки раствора из мозжечка и место ткани в блюдо крышкой Петри.
3. Чоп ткани мелко с хорошо пылал лезвием по крайней мере в трех различных направлениях.
4. Добавить нарезанный ткани в раствор Б (ополоснуть чашку Петри с раствором, чтобы обеспечить ограниченную ткани теряется) и поместить в водяную баню при 37 ° С в течение 5 мин. Слегка встряхнуть каждую пару минут.
5. Добавить решение D (20 мл) в пробирку, чтобы нейтрализовать трипсина, встряхнуть и центаrifuge на 65 мкг в течение 5 мин.
6. Вылейте супернатант.
7. Ресуспендируют в 4 мл раствора C. растирают а (примерно в 10 раз каждый) с тремя Flamed стеклянных пипеток уменьшением диаметра, пока суспензия не является как можно более однородным.
8. Медленно и осторожно добавить несколько капель этого гомогената на вершине BSA / EBSS. Если он начинает тонуть через BSA / EBSS, растереть все больше и / или добавить немного больше раствора C. Гомогенат должны сидеть в слое на верхней части BSA / EBSS. Не трясти. Спин на 100 мкг в течение 5 мин.
9. Удалить супернатант и ресуспендируют осадок (мягкие) в 1 мл среды МЕМ.
10. Граф клеток с использованием гемоцитометра и пластины на 800000 клеток / покровное в 500 мкл среды МЕМ. Место в инкубаторе при 37 ° С с 6% СО _2.
11. Изменить среды на следующий день (24-36 ч после подготовки). Сделать раствор среде МЕМ, содержащей 10 мкМ ингибитора клеточного цикла Арабинофуранозил цитидина (AraC).
    1. Для каждогопокровное, сохраняют 250 мкл старой среды в свежем 24-луночного планшета, аспирация остальное, добавить 250 мкл нормальной среде МЕМ и аспирации это мыть клетки, затем добавить 250 мкл среды старой обратно в клетки и верхней вверх 250 мкл AraC среде, содержащей.
       Примечание: Клетки могут быть использованы из 6 дней в пробирке (DIV).

4. Выборочное разрушающие микроглии (Исполняется на 6 DIV)

1. Добавить чистого LME 5 мл отдельной аликвоте среде МЕМ с получением конечной концентрации 150 мМ LME.
2. Вернуться решение до рН 7,4 и фильтр стерилизуют с помощью 28 мм полиэфирсульфон (PES) 0,2 мкм шприц фильтр.
3. Разбавленным раствором до концентрации 50 мм (2 х LME) в среде МЕМ и место в водяной бане при 37 ° ^С в течение 10 мин вместе с нормальной среде МЕМ для контрольных культурах.
4. Удалить половину (250 мкл) в среду MEM от CGC культур и сохраняют при 37 ° С.
5. Лечить клеткис среды МЕМ, содержащей 2 х LME (250 мкл), т.е. разбавляют 1: 1 дает концентрацию а 25 мм, или с подогретого MEM среде без LME (250 мкл) в контрольных культурах.
6. Инкубируйте клетки при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 6% CO ₂ в течение 1 часа.
7. Промывают клетки дважды в свежей предварительно нагретой среде МЕМ, чтобы удалить LME-содержащей среде, а затем заменить удерживается культуральную среду и равный объем свежего подогретого MEM среде в соответствующие лунки.
8. Возвращение культуры в инкубатор (увлажненный с 6% CO ₂ при 37 ° С) и оставить на 24 часов перед дальнейшей обработкой.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Способность этого метода избирательного устранения микроглии от CGC и / или смешанных культур опирается на последующее способности следователя точно определить и дифференцировать микроглии от окружающих их клеток. Это может быть достигнуто с использованием микроглии конкретных прои?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Наиболее важные шаги для обеспечения успешного селективное удаление микроглии от CGC и / или смешанных культур являются: 1) поддержание стерильной и здоровый CGC культуры; 2) Фильтр стерилизации LME-среде, содержащей и возвращение раствора до рН 7,4; 3) ведение нераспределенной CGC массовой инфо...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps	Sigma-Aldrich	F4142	The curved end facilitates removal of the cerebellum
Micro-dissecting scissors	Sigma-Aldrich	S3146	Straight, sharp point facilitates rodent P4-7 dissection
L-leucine methyl ester hydrochloride	Sigma-Aldrich	7517-19-3
EBSS solution	Sigma-Aldrich	E7510-500 ml
Poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	27964-99-4	Coat coverslips 1 day before use
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
DNase	Sigma-Aldrich	D5025
Soybean trypsin inhibitor	Sigma-Aldrich	T6414
Mouse anti-ED1 antibody	Abcam	ab31630