Ферромагнитный Bare Metal Стент для эндотелиальных клеток Capture и удержания

Резюме

Наши цели были разрабатываем, производим и проверить ферромагнитных стентов для захвата эндотелия клеток. Десять стенты были испытаны на разрыв и более 10 стентов были испытаны при задержке магнетизма. Наконец, 10 стентов были испытаны в пробирке и более 8 стенты были имплантированы в 4 свиней, чтобы показать захват и удержание клеток.

Аннотация

Быстрое эндотелиализацию сердечно-сосудистых стентов необходимо для снижения тромбоза стента и избежать анти-тромбоцитов терапии, которые могут уменьшить риск кровотечений. Возможность использования магнитных сил, чтобы захватить и удержать эндотелиальные клетки вырост (EOC), меченные супер парамагнитные наночастицы оксида железа (Spion) было показано ранее. Но этот метод требует разработки механически функциональной стента из магнитного материала и биологически совместимого с последующим в пробирке и в естественных испытаний, чтобы доказать, быстрое эндотелиализацию. Мы разработали слабоферромагнитное стент из 2205 дуплексной нержавеющей стали с использованием системы автоматизированного проектирования (САПР) и его дизайн был доработан с помощью конечно-элементного анализа (FEA). Окончательный дизайн стента выставлены основной нагрузки ниже предела разрушения материала во время механического обжатия и расширения. Сто стенты были изготовлены и подмножество из них используется для механических испытаний в отставкеained измерения магнитного поля, в-пробирке исследования захвата клеток и в естественных имплантации исследований. Десять стенты были испытаны для развертывания, чтобы убедиться, если они понесли опрессовки и расширение цикл без сбоев. Еще 10 стентов были намагничены с помощью сильной неодимовый магнит и их сохранил магнитное поле было измерено. Стенты показал, что сохраняется магнетизм было достаточно, чтобы захватить Spion-меченого EOC в наших в пробирке исследований. Spion меченных захвата и удержания ЕОК была проверена в крупных животных моделях имплантации стента 1 намагниченной и 1 не-намагниченной стента управления в каждом из 4 свиней. Стентированной артерии эксплантировали через 7 дней и анализировали гистологически. В слабомагнитные стенты, разработанные в этом исследовании, были способны привлекать и удерживать Spion меченных эндотелиальные клетки, которые могут способствовать быстрому заживлению.

Введение

Patients implanted with vascular stents manufactured from thrombogenic materials like stainless steel, cobalt chromium, and platinum chromium – both bare metal stents (BMS) and drug eluting stents (DES) – need anti-platelet therapy to prevent thrombus formation. BMS heal rapidly, but are subject to late stage restenosis due to incomplete healing. DES require long term anti-platelet therapy due to delayed healing. Anti-platelet therapy administered to avoid thrombosis as a result of incomplete or delayed healing leads to increased bleeding risk and may not be suitable for certain patients^1,2. An ideal stent will heal completely and quickly thus avoiding long-term anti-platelet therapy and late stage restenosis. This complete healing can only be achieved if the stent is rapidly coated with a monolayer of endothelial cells after implantation. Coating the stents with biocompatible materials such as gold or other biopolymers has been shown to improve thrombo-resistance, but none of these techniques achieved ideal blood compatibility as may be possible by coating with endothelial cells^3,4.

A stent can be coated with endothelial cells post implantation by attracting circulating progenitor cells. This self-seeding technique can be achieved by utilizing ligands and antibodies. But this technique is limited by the low number of circulating endothelial progenitor cells. A promising strategy is to deliver cells directly to the stent immediately following implantation during a short period of blood flow occlusion^3,5. This strategy requires a technique for rapidly capturing cells and retaining them on the stent even after restoring blood flow. We have developed a technique in which a magnetic stent is used to attract and retain magnetically-labeled endothelial cells delivered post implantation. To achieve this, a functional BMS with sufficient magnetic properties to capture and retain magnetically-labeled endothelial cells is required⁶.

In this paper, we discuss the methods for designing, manufacturing, and testing a 2205 stainless steel stent. The stents were designed using CAD and FEA. The manufactured stents were magnetized using a neodymium magnet and the retained magnetic field was measured using a magneto-resistance microsensor probe. We then tested the stents for magnetically-labeled cell capture in a culture dish during our in-vitro experiments. Finally, the stents were tested in-vivo by implanting magnetic and non-magnetic stents in 4 pigs and histologically analyzing the stented arteries.

протокол

Все исследования на животных были одобрены Уходу за животными и использованию комитета (IACUC) в клинике Майо.

1. Разработка и анализ в 2205 из нержавеющей стали стента

1. Проектирование голый металл стента, используя CAD
   1. Сделать экструдированного полый цилиндр, выбрав на "экструдированный хозяин / базовой 'особенность с толщиной стенки, равной толщине стент стойки.
   2. Разработка шаблона стента на другом эскиза плоскости, касательной к цилиндру экструдированного. Сделать ширину развертки в соответствии с окружностью экструдируемого полого цилиндра.
   3. Перевести плоский шаблон дизайна на полого цилиндра с помощью функции обтекания.
   4. Сохраните участие в его родном формате, а также в формате ACIS, чтобы быть экспортированы для ВЭД.
2. Анализ методом конечных элементов для моделей стентов
   1. Импорт твердой геометрии, сохраненные в формате ACIS в части модуля ВЭД программного обеспечения для дальнейших Analysесть.
   2. Модель 2 аналитические цилиндров коаксиально стента в части по моделированию программного обеспечения FEA. Наружный цилиндр имеет исходный диаметр больше, чем диаметр стента, чтобы имитировать щипцы и внутренний цилиндр имеет начальную диаметр 1 мм, чтобы имитировать воздушный шар инфляции.
   3. Двойной щелчок на дереве пункта "экземпляры" сборочного модельер собрать сказанное части в относительных позиций.
   4. Используйте модуль сетки программного обеспечения ВЭД, указать тип элемента как 20-узловой элемент с шестигранной уменьшенной интеграции, указать размер элемента, и сетка стента.
   5. Укажите качения жесткие контактные пары между стента и двух цилиндров, соответственно, в "свойствах взаимодействия" в дереве модели.
   6. Связать упругопластическая поведение напряженно-деформированного 2205 нержавеющей стали модели стента.
   7. Определить граничные условия, чтобы, во-первых обжимной наружный цилиндр до 1 мм, имитирующее CRimping стента. Удалить наружный цилиндр для имитации релаксацию извитой стента. Expand внутренний цилиндр 3 мм, чтобы имитировать расширение и, наконец, удалить внутренний цилиндр для имитации отдачи стента.
   8. Определить параметры моделирования, включая число процессоров и объем оперативной памяти, выделенных в «анализ» модели дерева пункта и запустить симуляцию.
   9. После завершения моделирования, открыть файл результата (filename.odb) и пост-обработки результатов для изучения основных штаммов и итеративно улучшить дизайн стента для достижения главной деформации 20%, которое меньше предела разрушения материала ,

2. Стент Изготовление и тестирование для обжима и расширения

1. Стент изготовление
   1. Получите 2205 труб из нержавеющей стали от пистолета бурения и точности шлифования цельного материала на точность обработки компании, такие как Precision Products действий в Pioneer,ОЙ.
   2. Передача точность наземных труб и плоский дизайн рисунок стента в компании стента резки, таких как Laserage Technology Corporation в Уокиган, штат Иллинойс для лазерной резки и электрополировки.
   3. Пассивации поверхности с помощью стентов электрополированные погружением их в сильной кислотой (50% HCl) в течение 10 мин с последующим основанием (10% _NaHCO 3) еще 10 мин. ВНИМАНИЕ: обрабатывать химикатами с надлежащего защитного оборудования и под вытяжкой. Наконец, мыть стентов с этиловым спиртом и деионизированной воды. Этот процесс называется кислотного травления.
2. Тестирование выпускаемой стента для опрессовки и расширения
   1. Обжимные стента на воздушном шаре в Trifold использованием ручного обжима инструмент. Держите стента и буклетов шар в обжимного инструмента. Нажмите ручку радиально деформировать стент обжимаемого на воздушном шаре.
   2. Осмотрите гофрированной стента, используя микроскоп для равномерного обжатия и каких-либо признаков отказа в структуре должнымпластической деформации.
   3. Expand его проектируемого диаметром 3 мм с помощью давления в Trifold баллон с водой. Проверьте расширенные стентов для микроскопических трещин и единой расширения.

3. Характеристика Стент для Нераспределенная магнитном поле

Примечание: цилиндрический магнит 2 дюйма диаметром и 1 дюйм высоты был использован в данном исследовании. Полюса магнита выстраиваются вдоль оси. Поверхностная плотность магнитного потока магнита составляет примерно 1 Т.

1. Намагнитить стентов диаметрально или аксиально с помощью сильной неодимовый магнит. Держите стента близко к сильным магнитом в течение приблизительно 1 мин для намагничивания.
2. Держите стента на одном из плоских граней с диаметром вдоль силовых линий магнитного поля, которые будут намагниченных диаметрально или держат стента рядом с цилиндрической поверхностью с осью, направленной вдоль силовых линий магнитного поля, чтобы намагнитить его оси. Нераспределенная магнитного Fielд стента оказалась стабильной в течение по крайней мере 24 ч, но с использованием стента, как можно скорее после намагничивания.
3. Установите стентов индивидуально на стеклянные оправки и затем смонтировать стеклянные оправки в точности патрона магнитного зондирования прибора. Магнитный зонд микросенсор может быть точно расположены близко к стента, не касаясь поверхности, используя XYZ этапы сборки магнитного зондирования приспособления (рисунок 4).
4. Измерьте базовой чтение магнитной микросенсора далеко от стента и затем измерить магнитное поле удерживается на поверхности стента путем размещения зонда, используя этапы XYZ магнитного зондирования прибора.

4. Магнитные Исследования сотовый Захват

1. Получение клеток, мечение Spion и окрашивания флуоресцентным красителем
   1. Вывести эндотелиальные клетки вырост (EOC) из свиной периферической крови, как описано в ^5,7. Культура в колбе Т-75 Untiл примерно 80% сливной (5x10 8x10 ^{6 до 6 клеток).}
   2. Обобщить SPIONs как диаметр магнетита 10 нм (Fe _{3 O 4)} ядра, окруженного 50 нм поли (молочная-со-гликолевой кислоты) (PLGA) оболочки, как описано в ^8,9.
   3. Инкубируйте полученный КРВ с Spion в концентрации 200 мкг / мл клеточной культуральной среды в течение 16 ч при 37 ^{о С.}
   4. Аспирируйте клеточную культуральную среду осторожно. Осторожно промыть клетки добавлением 10 мл фосфатно-солевом буфере (PBS) в колбу, качалки и аспирации PBS.
   5. Пятно клеток с флуоресцентным красителем (CM-DiI) для визуализации в ходе экспериментов. Это делается в соответствии с инструкциями изготовителя, добавив краситель 10 мл среды культуры клеток при концентрации 5 мкл / мл и инкубацию с клетками в течение 30 мин при 37 ° С.
   6. Промыть клетки с PBS, как на стадии 4.1.4 и инкубируют с 3 мл 0,25 раствора трипсина% ЭДТА в течение 5 мин при 37 ° С доподнимать клетки из колбы.
   7. Передача клеточной суспензии в 15 мл коническую пробирку, довершение с PBS, и центрифугируют при 500 х г в течение 5 мин, с образованием осадка клеток.
   8. Повторное приостановить осадок клеток в PBS при концентрации 1-2x10 ⁶ клеток / мл и тщательно перемешать с помощью пипетки и из конической трубе несколько раз.
2. В-клеточных пробирке исследования
   1. Спроектировать и изготовить (например, 3D печать) простой приспособление для удержания стента чуть выше поверхности покровным стеклом.
   2. Размагнитьте стент с использованием электромагнитного degausser или намагнитить стента диаметрально или аксиально с помощью сильной неодимовый магнит.
   3. Внесите Spion меченных EOC приостановлено в PBS в блюдо с аксиально намагниченных или диаметрально намагниченные или не намагниченных стентов управления. Изображение стенты с EOC приостановлено в PBS немедленно флуоресценции с использованием перевернутой флуоресцентного микроскопа.

5. В естественных условиях исследования животных

1. Имплантация стента
   1. Нарисуйте периферической крови от 4 здоровых свиней Йоркшир - взвешивание приблизительно 50 кг - 3 недели до имплантации стента, соответственно, и культура ЕОК, как описано в ^5,7.
   2. Администрирование анти-тромбоцитов лечение, начиная за 3 дня до операции (аспирин 325 мг и клопидогрела 75 мг в день).
   3. В день имплантации стента, обезболить свиньи с внутримышечного Telazol, ксилазином и атропин (5 / 2-3 / 0,05 мг / кг соответственно), как указано в соответствующих руководящих принципов институциональных уходу за животными и использовать.
   4. Интубация и поместить свинью на ингаляции 1-2,5% изофлуран анестезии.
   5. Бритье шеи область брюшной свиньи и проводить процедуру в целом стерильных условиях.
   6. Имплантат 1 намагничивается и 1 не-намагниченной стент в правой коронарной артерии (RCA), используя стандартную технику катетеризации сердца.
      1. Catheterization животных должны выполняться квалифицированным интервенционной кардиолога. Доступ к правой сонной артерии с 9 французской оболочкой.
      2. Иглу целевой коронарной артерии и вводят йодированной контрастного вещества для получения изображения флюороскопические.
      3. Поставьте 0,014 дюйма стандартный проводник коронарной артерии в. Авансовые шар и стента с помощью этого проводник и развернуть стента в 3-3,5 мм диаметром судна.
   7. Закрывают кровоток в проксимальных RCA к имплантированных стентов с использованием избыточного проволоки баллона и доставить примерно 2х10 ⁶ аутологичных КРВ меченного Spion суспендировали в 4 мл PBS через центральный катетер в течение 2 мин.
   8. Восстановление кровотока в RCA через 2 мин дополнительного окклюзии.
   9. Перевести животное в комнате восстановления и внимательно следить за животное, пока он не очнулся.
   10. Продолжайте вводить анти-тромбоцитов лечение (аспирин 325 мг и клопидогрела 75 мг) не создавать оперативно, пока жертвы.
2. Стент эксплантов и гистология
   1. Усыпить животным через 7 дней после операции сначала обезболивающее животное, как описано ранее, а затем ввести внутривенно смертельную дозу фенобарбитала натрия (100 мг / кг), как за действующими нормами и правилами институциональных уходу и использованию животных.
   2. Хирургическим урожай стентированной артериальных сегментов. Исправление эксплантированной артерии в 10% формалине буфера в течение как минимум 30 мин. Оставьте образцы в буфере формалина для дальнейшего гистологического анализа.
   3. Аутсорсинг установленного образца к объектам, способных выполнять гистологию с металлических стентов. В этот обработки, образцы встраивать в метилметакрилата, поперечное сечение вида и анализировали гистологически при помощи технологии окраски Мэллори берлинской лазурью пятно на железных частиц.

Результаты

Итеративный конструкция стента на основании FEA (рис 1) показал, стент, который может обжима и расширения с главной деформации 20%, который меньше, чем 30% предельной деформации. Обжимной и тест расширение (Рисунок 2) не показали никаких признаков разрушения. Фотографии ?...

Обсуждение

Мы разработали магнитную стента, который может функционировать в качестве голой металлических стентов и может привлечь Spion меченных эндотелиальные клетки. В предыдущих исследованиях с участием магнитных стентов, исследователи использовали никель покрытием коммерческие стенты и кат...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2205 Stainless steel	Carpenter Technology Corporation		Round bar stock material
Abaqus	Dassault systems		Software
Atropine			Prescription drug.
Clopidogrel			Commercial name: Plavix. Prescription drug.
CM-DiI	Life Technologies	V-22888	Molecular Probes, Eugene, OR
Endothelial growth medium-2	Lonza	CC-3162
Hand Held Crimping tool	Blockwise engineering	M1-RMC
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma Aldrich	MFCD00011324	CAUTION: wear proptective equipment and handle under fume hood
Isoflurane anesthesia	Piramal Critical Care, Inc.
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	MFCD00003568
NdFeB magnet 2" Dia x 1" thick	Amazing magnets	D1000P	Axially magnetized disc magnet with poles on flat faces
Over-The-Wire trifold balloon			Any commercially available OTW trifold balloon can be used
Phosphate buffered saline	Life Technologies	10010-023	Commonly known as PBS
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma Aldrich	MFCD00003528
Sodium pentobarbital	Zoetis		Commercial Name: Sleepaway (26%), FatalPlus, Beuthanasi.  Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
SolidWorks	Dassault systems		Software
SpinTJ-020 micro sensor	MicroMagneitcs Sensible Solutions		Long probe STJ-020 microsensor
SPION	Mayo Clinic		Nanoparticles synthesized internally (Ref: Lee, S. J. et al. Nanoparticles of magnetic ferric oxides encapsulated with poly(D,L latide-co-glycolide) and their applications to magnetic resonance imaging contrast agent. J Magn Magn Mater 272, 2432-2433, doi:DOI 10.1016/j.jmmm.2003.12.416 (2004))
Telazol	Zoetis		Controlled substance to be ordered only by licensed veternarian
Trypsin EDTA	Life Technologies	25200-056	Gibco, Grand Island, NY
Xylazine	Bayer Animal Health		Commercial name: Rompun. Controlled sunstance to be ordered only by a licensed veternarian