JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Bacterial pyomelanin production results in increased resistance to oxidative stress and virulence. We report on techniques that can be used to determine inhibition of pyomelanin production and assay the resulting increase in sensitivity to oxidative stress in bacteria, as well as determine antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC).

Аннотация

Pyomelanin is an extracellular red-brown pigment produced by several bacterial and fungal species. This pigment is derived from the tyrosine catabolism pathway and contributes to increased oxidative stress resistance. Pyomelanin production in Pseudomonas aeruginosa is reduced in a dose dependent manner through treatment with 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). We describe a titration method using multiple concentrations of NTBC to determine the concentration of drug that will reduce or abolish pyomelanin production in bacteria. The titration method has an easily quantifiable outcome, a visible reduction in pigment production with increasing drug concentrations. We also describe a microtiter plate method to assay antibiotic minimum inhibitory concentration (MIC) in bacteria. This method uses a minimum of resources and can easily be scaled up to test multiple antibiotics in one microtiter plate for one strain of bacteria. The MIC assay can be adapted to test the affects of non-antibiotic compounds on bacterial growth at specific concentrations. Finally, we describe a method for testing bacterial sensitivity to oxidative stress by incorporating H2O2 into agar plates and spotting multiple dilutions of bacteria onto the plates. Sensitivity to oxidative stress is indicated by reductions in colony number and size for the different dilutions on plates containing H2O2 compared to a no H2O2 control. The oxidative stress spot plate assay uses a minimum of resources and low concentrations of H2O2. Importantly, it also has good reproducibility. This spot plate assay could be adapted to test bacterial sensitivity to various compounds by incorporating the compounds in agar plates and characterizing the resulting bacterial growth.

Введение

Pseudomonas aeruginosa is a Gram negative bacterium that produces a variety of pigments including pyomelanin, a red-brown pigment that helps provide protection from oxidative stress1-4 and binds a variety of compounds, including aminoglycoside antibiotics5-7. Pyomelanin production is caused by a defect in the tyrosine catabolism pathway4,8, either through deletions or mutations of the gene encoding homogentisate 1,2-dioxygenase (HmgA)1,9 or through imbalances in the various enzymes in the pathway10. Homogentisate accumulates due to inactivation of HmgA, and is secreted and oxidized to form pyomelanin11. Production of pyomelanin can be abolished or reduced in a dose dependent manner through treatment with the herbicide 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)12, which inhibits 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (Hpd) in the tyrosine catabolism pathway13. Hpd is required for the formation of homogentisate, and therefore pyomelanin11.

We describe in detail three techniques that were important in our studies of NTBC treatment of pyomelanin producing strains of P. aeruginosa. These techniques include titration of NTBC to determine the concentrations that will abolish or reduce pyomelanin production in laboratory and clinical pyomelanin producing strains, determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) of antibiotics when bacteria are treated with NTBC, and the resulting sensitivity to oxidative stress with NTBC treatment.

The titration assay we developed serves two purposes. First, the assay will allow the user to determine if NTBC can abolish or reduce pyomelanin production in the bacterium being studied and at which concentrations. This will allow the user to determine sensitivity to NTBC, since different strains of bacteria may have different sensitivities to this compound, as observed in P. aeruginosa12. Second, the NTBC titration assay will allow the user to determine the appropriate concentration of NTBC to use in subsequent assays, such as antibiotic MIC and oxidative stress response assays, if the goal is to abolish or reduce pyomelanin production and determine the effects of pigment reduction.

The titration assay works because a visible difference in pyomelanin production can be seen in strains treated with NTBC and the differences in pyomelanin production are dose dependent12. Additionally, this technique can be applied to the study of other compounds that may eliminate or enhance pigment production in bacteria.

Antibiotic MICs are used to determine the sensitivity of bacteria to antibiotics. There are several methods to determine MICs, including agar dilution plates and broth dilutions14. Broth dilutions can be performed in small test tubes or in a 96-well microtiter plate. The microtiter plate method of MIC determination described herein will allow the user to test a wide range of antibiotics using a minimum of resources. The assay provides reproducibility as well as flexibility in the number of antibiotics and strains tested by this method. Additionally, with the incorporation of NTBC in the assay, the user can determine if elimination or reduction of pyomelanin production alters antibiotic sensitivity in bacteria that produce pyomelanin.

Bacterial response to oxidative stress can be tested in several ways. The most common methods described are either viable counts of bacteria subjected to oxidative stress for a period of time1, or oxidative stress disc diffusion assays15. These methods tend to use high concentrations of oxidative stressors to examine the effects of oxidative stress in bacteria and results can be quite variable between biological replicates. The viable count assay also tends to use more agar plates than the other methods. The spot plate assay we describe uses low concentrations of H2O2 and allows the user to test the oxidative stress response of multiple strains using a minimum of plates. The assay is also consistently reproducible between technical and biological replicates. As pyomelanin is involved in resistance to oxidative stress, the incorporation of NTBC in the assay allows the user to determine the effects of elimination of pyomelanin production on oxidative stress resistance.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Приготовление культуральных сред, антибиотики, и 2- [2-нитро-4- (трифторметил) бензоил] -1,3-циклогександиона (NTBC)

  1. Сделайте отвар LB (1% триптона, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl в H 2 O) и аликвоту в соответствующих объемах. Стерилизовать в автоклаве. Хранить при комнатной температуре.
  2. Сделайте 100 мл LB-агар (1% триптонового, 0,5% дрожжевой экстракт, 0,25% NaCl, 1,5% агар в H 2 O) в 250 мл колбах. Стерилизовать в автоклаве и хранить при комнатной температуре. Убедитесь, что агар расплавляют перед заливкой в ​​пластинах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Колбы, содержащие 100 мл LB-агар даст 4 пластины. Количество LB агаре могут быть изменены, чтобы соответствовать числу пластин, необходимых для анализа.
  3. Сделать PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мм KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4) 16. Стерилизация в автоклаве или фильтрацией и хранят при комнатной температуре.
  4. Подготовка к антибиотикам растворы для гентамицина, канамицина, А.Н.д тобрамицин.
    1. Подготовьте соответствующие антибиотики концентрации акций для P. Штаммы, содержащие палочка 100 мг / мл гентамицина в дозе 30 мг / мл канамицина и 10 мг / мл тобрамицина. Растворить антибиотики в воде, стерилизуют фильтра (0,2 мкм) и хранят при температуре 4 ° С. Alter антибиотики и концентрации в зависимости от изучаемого бактерии.
  5. Подготовьте растворы NTBC. Растворите 10 мг NTBC в 400 мкл ДМСО. Это дает концентрацию 75,9 мМ NTBC. Храните NTBC растворы при температуре -20 ° C. Оттаивания растворах при комнатной температуре при необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разные источники NTBC имеют различия в растворимости. Определить подходящий автомобиль, в котором распускать NTBC на основе рекомендаций производителя и скорректировать Шаг 1,5 соответственно.

2. NTBC титрования бактериальных штаммов

  1. Настройка ночных культур штаммов для тестирования. Добавить 2 мл LB бульона до 16 х 150 мм пробирку(Один за деформации) и прививку с 1 изолированных колонии от каждого штамма. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с аэрацией на культуре ткани ротатора в воздушном инкубаторе.
  2. На следующий день, готовить титрования NTBC в LB бульоне. Используйте первоначальный диапазон от 0 до 900 мкМ NTBC, так как различные штаммы имеют различия в чувствительности к NTBC.
    1. Добавить 1 мл LB бульона 4 до 5 пробирок (16 х 150 мм) на линию.
    2. Добавьте исходный раствор NTBC (75,9 мм) до пробирках (16 х 150 мм) в диапазоне концентраций. В таблице 1 для концентраций NTBC и соответствующих объемов фондовых добавить 1 мл LB бульоне.
  3. Измерьте оптическую плотность 600 из ночных культур. Вымойте культур, прежде чем принимать OD 600 показания по ликвидации pyomelanin присутствует в средствах массовой информации.
    1. Вымойте культур путем центрифугирования 1 мл культуры в микроцентрифуге при 16000 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант и любые свободно осажденные клетки смикропипетки и ресуспендируют осадок клеток твердой в 1 мл LB.
  4. Привить титрования пробирки при OD 600 0,05. Рассчитать количество промытого культуры, необходимой для инокуляции пробирки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте мыть культур для прививок, так как pyomelanin не должны присутствовать.
  5. Инкубируют при титровании трубки в течение примерно 24 ч при 37 ° С с аэрацией, используя культуры ткани ротатор в воздушном инкубаторе.
  6. Сфотографировать титрования трубы и сравнивать производство пигмента внутри и между штаммами, чтобы определить количество NTBC использовать для ВПК и окислительного стресса анализов. Использование OD 600 показания для определения количества клеток в pyomelanin свободного культурального супернатанта и определить плотность клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отношение ОД 600 pyomelanin в культуральной супернатанта клеток может быть рассчитана для количественного различия в pyomelanin производства после лечения с NTBC.

3. Антибактериальная Минимальная Inhibiтори концентрацию (МИК) Анализ в 96-луночных планшетах

  1. Настройка ночных культур штаммов для испытания в LB и без NTBC.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывается с помощью репрезентативной уровень 300 мкМ NTBC. Соответствующий уровень NTBC быть использованы при операции 2.6.
    1. Добавить 300 мкм NTBC 2 мл LB. Добавить эквивалентный объем носителя (ДМСО) 2 мл LB для условия не NTBC.
    2. Использование стерильных зубочистки, привить трубки с одной изолированной колонии бактерий. Там будет одна культура с NTBC и одна культура не NTBC для каждого штамма. Инкубируют в течение ночи при 37 ° С с аэрацией, используя культуры ткани ротатор в воздушном инкубаторе.
  2. На следующий день, чтобы LB + NTBC и LB + ДМСО мастер решения для настройки MIC анализа. Добавить NTBC в концентрации 600 мкМ, как это будет разбавлен в два раза, когда посевной материал добавляется, получая конечную концентрацию 300 мкМ.
    1. Чтобы проверить один antibiушные для одного штамма, добавить 600 мкм NTBC 2 мл LB и смешать, чтобы сделать главное решение NTBC. Добавить эквивалентный объем носителя (ДМСО) в 2 мл LB и смешать, чтобы сделать не NTBC главное решение. Используйте эти решения для создания антибиотиков растворы, а также для создания серии разбавления в 96-луночных планшетах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Препараты мастер решение даст дополнительный решение для учета ошибок пипеток. Мастер растворы можно масштабировать вверх или вниз по мере необходимости в зависимости от количества антибиотиков и штаммов.
  3. Подготовка к антибиотикам решения в мастер-решений LB + NTBC или LB + ДМСО.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация антибиотика в этих растворов должен быть двойной финал требуемой концентрации. Достаточно раствор должен быть передать 100 мкл четырех скважин на 96-луночный планшет.
    1. Подготовьте гентамицин +/- NTBC маточного раствора при 64 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавить 0,288 мкл гентамицин складе (100 мг / мл) до 450мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация гентамицина для Р. палочки PAO1 32 мкг / мл.
    2. Сделайте канамицин +/- NTBC маточного раствора в 256 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавьте 3.84 мкл канамицина (30 мг / мл), 450 мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная концентрация канамицина для Р. палочки PAO1 128 мкг / мл.
    3. Подготовка тобрамицин +/- NTBC маточного раствора на 8 мкг / мл. Для того, чтобы это решение, добавить 0,36 мкл тобрамицина складе (10 мг / мл), 450 мкл LB + NTBC или LB + ДМСО мастер решений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для P. палочки PAO1, максимальная концентрация тобрамицина в 4 мкг / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: антибиотики и концентрации могут быть скорректированы для бактерий быть проверены.
  4. Добавить 100 мкл каждого 2x раствором антибиотика с четырех скважин в 96-луночный планшет. Поместите эти решения в ряд А. Для examplе, гентамицин должен быть помещен в А1-А4, канамицин должны быть помещены в A5 через A8, и тобрамицин должны быть помещены в A9 через A12. См фиг.1А для диаграммы 96-луночного планшета, созданной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько антибиотики могут быть проверены в одной тарелке, но только один штамм должен быть проверен на плите, чтобы устранить потенциал для перекрестного заражения от других штаммов.
  5. Добавьте 50 мкл мастер раствора LB + NTBC или LB + ДМСО строкам B-Н от 96-луночного планшета. Убедитесь, что одна плита LB + NTBC и один пластина LB + ДМСО. Смотрите рисунок 1А.
    1. Используйте LB + NTBC для антибиотиков в LB + NTBC. Используйте LB + ДМСО для антибиотиков в LB + ДМСО.
  6. Использование микропипетки выполнять два раза серийных разведений антибиотиков путем передачи 50 мкл раствора из ряда А грести Б. Смешивают раствор, изменить советы пипетки, и передавать 50 мкл раствора, из ряда В грести C. Повторите для remainiнг строк. После разбавления ряда G, удалить 50 мкл раствора из этой строки и выбросить. Используйте строку H как без контроля антибиотиков для бактериального роста. Смотрите рисунок 1В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый хорошо в рядах от А до G в настоящее время содержит 50 мкл антибиотика в LB + NTBC или LB + ДМСО на 2X конечный целевой концентрации. Ряд Н содержит LB + NTBC или LB + ДМСО без каких-либо антибиотиков.
  7. Измерьте оптическую плотность 600 из ночных культур. Вымойте все культуры, прежде чем принимать OD 600 показания по ликвидации pyomelanin присутствующих в средствах массовой информации.
    1. Вымойте культур путем центрифугирования 1 мл культуры в микроцентрифуге при 16000 мкг в течение 2 мин. Удалить супернатант с микропипетки и ресуспендируют осадок клеток в 1 мл LB.
  8. Развести в одночасье 2.75x10 культур в 5 КОЕ / мл в LB.
    Примечание: Предположим, что один OD 600 блок является эквивалентом 1х10 9 КОЕ / мл для P. палочки. ОД в КОЕ / мл преобразований может быть Different в других бактерий.
  9. Добавить 50 мкл разбавленного бактериальной культуры к соответствующему скважины.
    Примечание: культур, выращенных в NTBC должны быть добавлены к лункам, содержащим NTBC и культуры, выращенные в ДМСО должны быть добавлены к лункам, содержащим ДМСО. Смотрите рисунок 1В.
    1. Добавить бактерии трех скважин на каждого штамма и концентрации антибиотика. Добавить 50 мкл LB с четвертой скважины, чтобы действовать в качестве контроля для бактериального заражения. Смотрите рисунок 1В.
    2. Используйте микропипетки многоканальный привить скважин. Убедитесь, что пипетки советы в нижней части скважины при добавлении прививочный для предотвращения загрязнения соседних скважин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление бактериальной культуры в лунки будет разбавлять антибиотика и NTBC концентраций, два раза.
  10. Накройте 96-луночных планшетах с парафином и инкубируют примерно 24 ч при 37 ° С. Инкубируют 96-луночных планшетах в статике, в воздушном инкубаторе.
  11. Исследоватьпластины для роста бактерий в скважинах. МИК представляет собой наименьшую концентрацию антибиотика, в которой нет роста бактерий не наблюдается для всех трех повторностей каждого штамма.
    1. Визуально проверьте пластину для роста или читать с помощью ридере набор для OD 600.

4. Пятно планшете для окислительного стресса ответ

  1. Настройка ночных культур штаммов для испытания в LB с и без NTBC как описано на стадии 3.1.
  2. На следующий день, готовить агаром LB, содержащих H 2 O 2 в качестве окислительного стресса. 2 О 2 концентрации в диапазоне Н от 0 до 1 мм является хорошей отправной точкой.
    1. Растопить агар колб фунт. Классные СМИ примерно 50 ° C при комнатной температуре.
    2. Добавить H 2 O 2, непосредственно к охлаждаемой среде при требуемой концентрации. Вихревые колбы перемешать. В таблице 2 концентрации H 2 O 2и объемы концентрированной H 2 O 2, чтобы добавить. Эти значения основаны на 100 мл агара LB.
    3. Налейте пластин сразу после добавления Н 2 О 2 и пламя поверхность, чтобы удалить пузырьки. Выход 4 пластин в 100 мл LB-агар. Отметить пластины с концентрацией Н 2 О 2.
    4. Место пластин выявленные в капюшоне биологических потока с вентилятора, работающего в течение 30 мин, чтобы удалить лишнюю влагу из пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте пластины В этот же день готовы. Несоблюдение этого требования может привести к несогласованности данных.
      Примечание: Окислительные стресс-такие как паракват может быть заменен на H 2 O 2 в этом анализе. Концентрации, используемые для других окислительных стрессовых может отличаться от тех, которые используются для H 2 O 2.
  3. Вымойте и измерить OD 600 из ночных культур, как описано в шаге 3.7.
  4. Нормализовать ОП 600 всего ночь у.е.ltures к низкой стоимости для набора штаммов проходят испытания. П. палочки обычно имеет OD 600 приблизительно 2,5 при выращивали в течение ночи в LB + NTBC или LB + ДМСО.
    1. Определить объем культуры, необходимой для разбавления культуры к низкой OD 600 в общем объеме 1 мл. Например, если культура имеет OD 600 из 3 и самое низкое OD 600 для множества штаммов 2,5, выполнить следующий расчет: (2.5) (1 мл) = (3) (х). х = 0,833 мл. 0,833 мл культуры будут размещены в пробирке.
    2. Рассчитать количество LB + NTBC (300 мкМ) или ДМСО LB +, необходимого для доведения объема культуры до 1 мл. Для примера, на этапе 4.4.1, количество LB + NTBC или LB + ДМСО добавляли к культуре будет 0,167 мл (1 мл общий объем - 0,833 мл культуральной). Сделать исходные растворы LB + NTBC и LB + ДМСО использовать для этих разведений на основе объема, необходимого для разбавления все штаммы.
    3. Смешайте культуру и LB + NTBC или LB + ДМСО встряхиванием.
  5. Для поддержания культуры в постоянной концентрации NTBC или ДМСО, выполните десять раз серийные разведения нормированных ночных культур в PBS + NTBC или PBS + ДМСО.
    1. Сделать акции решения PBS + NTBC и PBS + ДМСО. Для одного набора разведений для одного штамма, смешайте 300 мкм NTBC или эквивалентный объем ДМСО с получением PBS, чтобы общий объем 720 мкл. Масштаб этих запасов вверх или вниз в зависимости от того, сколько штаммы испытываются.
    2. Этикетка микроцентрифужную трубы для 10 -1 через 10 -7 разведений. Серийными Добавить 90 мкл PBS + NTBC или PBS + ДМСО в соответствующие пробирки. Используйте PBS + NTBC для штаммов, выращенных в LB + NTBC и использовать PBS + ДМСО для штаммов, выращенных в LB + ДМСО.
    3. Добавить 10 мкл культуры к соответствующему 10 -1 разведения трубки. Смешайте встряхиванием и передачи 10 мкл разведения 10 -1 до 10 -2 разбавления трубки. Повторяйте, пока все разведения не было Перфоrmed. Изменить пипетки советы между разведениями.
  6. Местная 5 мкл 10 -3 до 10 -7 разведения на LB + H 2 O 2 в двух экземплярах пластин для каждого штамма. Используйте кончик пипетки одну если пятна высевают из самых разбавить до наименьшего разбавленной (10 -7 до 10 -3). Не наклоняйте или наклонить тарелку, пока жидкость не высохнет в тарелку.
  7. Инкубируйте пластин в течение 24-48 ч при 37 ° С (воздух) инкубатора, в зависимости от штамма.
    ПРИМЕЧАНИЕ: П. палочки PAO1 будет иметь хорошие размера колонии на LB после 24 часов инкубации. Выдержите штаммов, пока они не колониям примерно тот же размер, как PAO1.
  8. Сфотографировать пластины, используя ПЗС-камеры над transluminator. При желании, редактировать фотографии для контраста и культуры на того же размера. Подсчитайте количество колоний в каждом месте, чтобы определить изменения в чувствительности к окислительному стрессу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

NTBC титрования

Титрования NTBC были использованы для определения, если NTBC смог сократить производство pyomelanin в P. палочки, а также определить концентрацию NTBC, что исключает или снижает pyomelanin продукцию для использования в дополнительных анализов. Там может быть изм...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

The NTBC titration method described in this protocol will allow the user to determine if NTBC can reduce or eliminate pyomelanin production in bacteria, and determine the concentration of NTBC required. The most critical step in the NTBC titration assay is determining the range of NTBC concentrations to use in the assay. Different strains of P. aeruginosa have different sensitivities to NTBC, and laboratory strains may be more sensitive to NTBC than clinical isolates12 (Figure 2). The...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

The authors thank Dara Frank and Carrie Harwood for their generous contribution of strains. University of Wisconsin Milwaukee Research Foundation holds patent no. 8,354,451; with claims broadly directed to treating or inhibiting the progression of infection of a microorganism in a patient by administering a 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase-inhibiting compound such as 2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC). Inventors are Graham Moran and Pang He. This research was supported by the National Institutes of Health (R00-GM083147). The University of Washington P. aeruginosa transposon mutant library is supported by NIH P30 DK089507.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-[2-nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione (NTBC)Sigma-AldrichSML0269-50mgAlso called nitisinone.  Soluble in DMSO.
H2O2Sigma-Aldrich216763-100ML30 wt. % in H2O.  Stabilized.
GentamicinGold BioG-400-100Soluble in H2O.  Filter sterilize.
KanamycinFisher ScientificBP906-5Soluble in H2O.  Filter sterilize.
TobramycinSigma-AldrichT4014-100MGSoluble in H2O.  Filter sterilize.

Ссылки

  1. Rodriguez-Rojas, A., et al. Inactivation of the hmgA of Pseudomonas aeruginosa to pyomelanin hyperproduction, stress resistance and increased persistence in chronic lung infection. Microbiology. 155, 1050-1057 (2009).
  2. Keith, K. E., Killip, L., He, P., Moran, G. R., Valvano, M. A. Burkholderia cenocepacia Produces a Pigment with Antioxidant Properties Using a Homogentisate Intermediate. J Bacteriol. 189, 9057-9065 (2007).
  3. Schmaler-Ripcke, J., et al. Production of Pyomelanin, a Second Type of Melanin, via the Tyrosine Degradation Pathway in Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 75, 493-503 (2009).
  4. Turick, C. E., Knox, A. S., Becnel, J. M., Ekechukwu, A. A., Milliken, C. E. Properties and Function of Pyomelanin. Biopolymers In Tech. Elnashar, M. , 449-472 (2010).
  5. Bridelli, M. G., Ciati, A., Crippa, P. R. Binding of chemicals to melanins re-examined: adsorption of some drugs to the surface of melanin particles. Biophys Chem. 119, 137-145 (2006).
  6. Barza, M., Baum, J., Kane, A. Inhibition of antibiotic activity in vitro by synthetic melanin. Antimicrob Agents Chemother. 10, 569-570 (1976).
  7. Nosanchuk, J. D., Casadevall, A. Impact of Melanin on Microbial Virulence and Clinical Resistance to Antimicrobial Compounds. Antimicrob Agents Chemother. 50, 3519-3528 (2006).
  8. Arias-Barrau, E., et al. The Homogentisate Pathway: a Central Catabolic Pathway Involved in the Degradation of L-Phenylalanine, L-Tyrosine, and 3-Hydroxyphenylacetate in Pseudomonas putida. J Bacteriol. 186, 5062-5077 (2004).
  9. Ernst, R. K., et al. Genome mosaicism is conserved but not unique in Pseudomonas aeruginosa from the airways of young children with cystic fibrosis. Environ Microbiol. 5, 1341-1349 (2003).
  10. Sanchez-Amat, A., Ruzafa, C., Solano, F. Comparative tyrosine degradation in Vibrio cholerae The strain ATCC 14035 as a prokaryotic melanogenic model of homogentisate-releasing cell. Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 119, 557-562 (1998).
  11. Hunter, R. C., Newman, D. K. A Putative ABC Transporter, HatABCDE, Is among Molecular Determinants of Pyomelanin Production in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 192, 5962-5971 (2010).
  12. Ketelboeter, L. M., Potharla, V. Y., Bardy, S. L. NTBC treatment of the pyomelanogenic Pseudomonas aeruginosa isolate PA1111 inhibits pigment production and increases sensitivity to oxidative stress. Curr Microbiol. 69, 343-348 (2014).
  13. Kavana, M., Moran, G. R. Interaction of (4-Hydroxyphenyl)pyruvate Dioxygenase with the Specific Inhibitor 2-[2-Nitro-4-(trifluoromethyl)benzoyl]-1,3-cyclohexanedione. Biochemistry. 42, 10238-10245 (2003).
  14. Andrews, J. M. Determination of minimum inhibitory concentrations. J Antimicrob Chemother. 48, 5-16 (2001).
  15. Nikodinovic-Runic, J., Martin, L. B., Babu, R., Blau, W., O'Connor, K. E. Characterization of melanin-overproducing transposon mutants of Pseudomonas putida F6. FEMS Microbiol Lett. 298, 174-183 (2009).
  16. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: a laboratory manual. , 3 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  17. Roy-Burman, A., et al. Type III protein secretion is associated with death in lower respiratory and systemic Pseudomonas aeruginosa infections. J Infect Dis. 183, 1767-1774 (2001).
  18. Jacobs, M. A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 14339-14344 (2003).
  19. Youngchim, S., Pornsuwan, S., Nosanchuk, J. D., Dankai, W., Vanittanakom, N. Melanogenesis in dermatophyte species in vitro during infection. Microbiology. 157, 2348-2356 (2011).
  20. Khajo, A., et al. Protection of Melanized Cryptococcus neoformans Lethal Dose Gamma Irradiation Involves Changes in Melanin's Chemical Structure and Paramagnetism. PLoS ONE. 6, e25092(2011).
  21. Hancock, R. E. W. Hancock Laboratory Methods. , University of British Columbia, Department of Microbiology and Immunology. British Columbia, Canada. Available from: http://www.cmdr.ubc.ca/bobh/methods.htm (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

102PyomelaninNTBC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены