Оценка чувствительности и Perigenital простаты тучных клеток активации в мышиной модели новорожденных материнской разъединении

Резюме

Мы измеряем активации perigenital механическую чувствительность и тучных клеток в простате у мужчин C57BL / 6 мышей, которые прошли в начале жизни стресс парадигму - новорожденных материнской разделения, для того, чтобы индуцировать доклинические модель простатита / синдрома хронической тазовой боли хронической.

Аннотация

Хронический простатит / синдром хронической тазовой боли (CP / ПКЮТО) имеет распространенность 14% жизни, и является наиболее распространенным урологическим диагнозом для мужчин моложе 50, но это наименее понятных и учился хронической тазовой боли расстройства. Существенное число пациентов с хронической тазовой боли доклада пережив стресс раннего жизни или злоупотребления, которые могут заметно повлиять на функционирование и регулирование гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой (HPA) оси. Активация тучных клеток, который, как было показано, чтобы быть увеличена в моче и выражены секрета простаты СР пациентов / КППС, частично регулируется вниз по течению активации оси HPA. Неонатальный материнской разделение (НМС) была использована для более чем двух десятилетий, чтобы изучить результаты раннего стресса жизни в моделях грызунов, в том числе изменения в оси HPA и висцеральной чувствительности. Здесь мы предлагаем подробный протокол для использования NMS в доклинической модели CP / ПКЮТО у самцов мышей C57BL / 6. Мы описываем методологиюдля выполнения NMS, оценки perigenital механической аллодинии и гистологические признаки активации тучных клеток. Мы также предоставляем доказательства того, что в начале психологический стресс может иметь долгосрочные последствия на мужской мочеполовой системы у мышей.

Введение

Хроническая тазовая боль сама по себе не болезнь, а скорее термин, связанный с продолжающимся спонтанным и / или вызывал боли, испытываемой пациентами с диагнозом синдром раздраженного кишечника (СРК), цистит / синдром болезненного мочевого пузыря интерстициальной (IC / PBS), вульводиния, или хронический простатит / синдром хронической тазовой боли (CP / ПКЮТО). Эти синдромы часто сопутствуют и имеют много общих характеристик, что у них нет сопутствующей патологии или выявила основные этиологии, хотя дисфункция в иммунной системе, центральной нервной системы, и периферической нервной системы, как было показано содействовать поддержанию и прогрессирования этих нарушений ^{1 -3.} Пациенты с хронической тазовой болью, скорее всего, представит с симптомами, не входящим в тазовой связанных функциональных расстройств боли и расстройства настроения, в том числе тревоги, депрессии и панического расстройства ^4-6, который был связан с изменением функционирования гипоталамо гипофизарнонадпочечников (HPA) оси ^7-10. Воздействие стресса начале жизни или травмы значительным фактором риска для развития гПа нарушения и связанные с ними хронические болевые синдромы ^10,11 и, как таковой, значительная группа пациентов с функциональными расстройствами тазовых боли сообщают, что испытали негативные события детства, такие как злоупотребления или пренебрежения ^12-14.

Грызунов модели новорожденных материнской разделения (NMS), которая включает в себя удаление щенков от их плотины в течение установленного периода времени, в течение периода preweaning, были использованы в течение последних двух десятилетий, чтобы изучить результаты раннего стресса жизни. В общем, НМС, как было показано, чтобы увеличить HPA оси активации, и, как следствие тревоги, как поведение, непосредственно влияет на экспрессию генов в гипоталамусе, а также нарушения ниже по потоку от регулирования лимбических структурах ^15-18. Нарушение нормального функционирования гПа оси, как было показано способствовать увеличению прямой кишки ^19-22 И вагинальный ¹⁶ Чувствительность отображается моделей грызунов NMS, но, несмотря на обширный характеристики долгосрочного эффекта послеродового воспаления мочевого пузыря ^23-25, влияние стресса начале жизни в значительной степени пошли неизученным в мочеполовых органах. Таким образом, следующие исследования опишу, как выполнять NMS в мышей, а затем оценить perigenital механическую чувствительность и тучных клеток инфильтрации / активацию в простате, чтобы проверить использование мужских NMS мышей в доклинической модели для CP / СХТБ.

Из всех диагностированных хронических тазовых болевых расстройств, CP / ПКЮТО, пожалуй, не менее хорошо признаны и характеризуется синдром, несмотря на то, что распространенность жизни примерно на 14% ²⁶ и ежегодные расходы пациента на сумму $ 4,400 (в два раза, что боли в пояснице или ревматоидный артрит ^27). Пациенты с CP / CPPS отчета боли в промежности, прямой кишки, предстательной железы, полового члена, яичек и / или живот ^28, опыт приветGher степень психологического стресса, чем пациентов контрольной ²⁹ и обычно присутствует с симптомами или с диагнозом сопутствующих хронической тазовой боли или расстройства настроения ^5,29-31. Периодические инфекции, вытекающей эпителий, нейрогенного воспаления, и аутоиммунные все были предположил в качестве потенциальных основных причин CP / КППС ^2,32,33, а также активации тучных клеток и дегрануляции ^34. Выраженные простаты выделениями из мужчин с CP / ПКЮТО возросло тучных клеток триптазы и фактора роста нервов (ФРН) уровни ³⁴ и более позднее исследование подтвердило, что триптазой и карбоксипептидазы А (CPA3), маркер активации тучных клеток, также увеличилось в Моча больных СР / КППС ^35. Потенциальная роль тучных клеток в начале и поддержания СР / СХТБ была основным направлением исследований на животных на этой синдрома до сих пор. Наиболее часто используется модель с грызунами используется для изучения CP / ПКЮТО является экспериментальный аутоиммунный простатит (EAP) модель поколениясоздававшие путем подкожной инъекции антигена простаты в полном адъюванте Фрейнда, что приводит к различным степеням железы воспаления в зависимости от вида и штамма используемых ^34,36-39. Мачты инфильтрация и активация / дегрануляции было показано, чтобы увеличить следующий индукцию EAP ^34,35,40. Трансгенные мыши с дефицитом либо в тучных клетках ³⁴ или триптазы рецептора par2 ³⁵ не развиваются железы тактика чувствительность следующий EAP, в отличие от дикого типа EAP мышей. Хотя это доклинические модель воспроизводит многие из характеристик человеческого CP / СХТБ, протокол индукции не является признаком состояния человека, который имеет различной этиологии и часто не связаны напрямую воспаление, инфекции, травмы или предстательной железы.

Влияние стресса начале жизни на развитие CP / СХТБ у людей в основном пропали неизученными; Однако, исследование Ху и др. ^41, показали, что мнеп, которые сообщили истории детства физического, эмоционального и / или сексуальное насилие значительно чаще испытывают симптомы, указывающие на CP / СХТБ. Кроме того, они показали, что боль и мочевыводящих оценки были повышены у пациентов с историей физического и эмоционального насилия. Ранее мы показали, что та же НМС парадигма в женской мышей C57BL / 6 производит влагалищное гиперчувствительность и аномальной экспрессии генов в обоих влагалища и мочевого пузыря наводит на мысль о неблагополучных HPA выхода оси ^16. Это свидетельство в сочетании с высокой распространенностью CP / пациентов КППС представляющих с другими сопутствующими заболеваниями, в том числе ⁴² IC / PBS и расстройств настроения, которые более четко было показано, что связано с ранней жизни стресс воздействия ^12-14, обеспечивает обоснование использования НМС модель для исследования CP / СПП у мышей.

протокол

Все эксперименты, описанные в этом протоколе соответствует руководящим принципам NIH в соответствии с руководящими принципами, указанными в Университете Канзаса медицинский центр Уходу за животными и использованию комитета.

1. новорожденных матери Разделение (НМС)

1. Монитор беременных плотин в день в течение мусора родов.
   Примечание: день мусор родился считается Р0.
2. На P1, удалить дамбу из дома клетку и поместите в чистую емкость вторичного.
3. Натрите несколько постельных принадлежностей между руками чистых перчатках, чтобы сохранить аромат домашней клетке.
4. Добавить глубину 1 - 2 см от клетку постельные принадлежности в чистоте, надлежащим образом помечены 2 л стеклянный стакан. Добавить приблизительно половину какого-либо дополнительного обогащения подстилки, который присутствует в клетку, например, nestlet, курчавость бумаги, в стеклянном стакане.
5. Аккуратно все щенков из одного помета, индивидуально, в тот же стакан.
6. Сразу же местоСтакан в инкубаторе состоялась в 33 ^о С и 50% влажности в течение 180 мин.
7. Удалить плотину из второго контейнера и вернуть ее в клетку. Возвращение домой клетку его надлежащего жилья месте, в виварии.
8. Повторите эту процедуру для каждого помета переживает NMS, используя чистые перчатки и вторичные контейнеры для каждого помета / плотины.
9. В конце периода разделения 180 мин, возвращают пометов в их клетки в том же порядке, как они были удалены.
10. Получить клетку первого помета, который был отделен в начале дня. Удалить плотину из дома клетку и поместите в чистую емкость вторичного.
11. Удалить первый стакан из инкубатора и втирать несколько постельных принадлежностей между чистыми руками в перчатках, чтобы сохранить аромат домашней клетке при обращении щенков.
12. Аккуратно переместите щенков, индивидуально, из стакана в клетку.
13. Вернуться любое обогащение и постельные принадлежности оставшиеся в стакане сГлавная клетка.
14. Вернуться плотину из второго контейнера в клетку и вернуть его в соответствующем жилищном месте в виварии.
15. Промыть стакан с водой и вернуть его в инкубатор. Используйте тот же стакан для каждого помета в течение всей процедуры разделения.
16. Повторите эту процедуру для каждого помета переживает NMS в том же порядке, как они были помещены в инкубатор.
17. Повторите всю процедуру для каждого помета прохождением NMS каждый день через P21.
18. Отучить NMS и наивные щенков на P22 путем размещения однопометными того же пола вместе в чистых клетках в комплекте с пищей и водой. Наивные щенков следует родилась и размещены в тех же условиях, что и NMS мышей, но не претерпевают дополнительную обработку вне обычных задач животноводства.

2. Perigenital Механическая чувствительность

1. фон Фрея Аппарат установки
   1. Принесите мышей в комнату тестирования и позволить им акклиматизироваться в течение 30мин, оставаясь в их клетках.
   2. Подготовка полигона путем размещения поглощающего лежащей снизу под повышенным проволоки сетки верхней таблице (79 см х 28 см), что обеспечивает достаточно места, чтобы следователь подходить с нижней без поразительные мышей, примерно 55 см в высоту.
   3. Поместите до 12 мышей, в индивидуальном порядке, в соответствии с четкими, перфорированные пластиковые камер (11 см х 5 см х 3,5 см) на верхней части таблицы проволочной сетки. Поместите тяжелые предметы на верхней палат, чтобы предотвратить мышей от побега.
   4. Акклиматизироваться мышей в течение дополнительных 30 мин на экране до порогового вывода оценки.
2. Оценка Perigenital Механическая чувствительность
   1. Выполните вверх-вниз метод с использованием стандартного набора градуированных фон Фрея мононитей ^43. Используйте следующие мононити: 1,65 г, 2,36 г, 2,83 г, 3,22 г, 3,61 г, 4,08 г, 4,31 г, 4,74 г и.
      1. Держите базы 3.22 г мононити и выставить втянутого мононить.
         Примечание: Некоторые модели могут не иметь восстанавливаемую мононити.
      2. Расположите зонд таким образом, что моноволокно вертикально ориентированных и когда мышь оповещения, неподвижно, а его вес тела распределяется равномерно между задних лап не применить его к левой или правой стороне мошонки, избегая среднюю линию, пока небольшое изгиб наблюдается в нити.
      3. Удерживая мононити на месте в течение 10 сек или пока животное показывает положительный ответ.
         Примечание: положительный ответ считается оживленных рывок или прыжок в ответ на мононити приложения или облизывание или едкой поведения, направленной на мононити. Если мышь перемещается во время мононити приложения 10 сек без отображения этого поведения, леска должна быть повторно после минимального 1 мин длительного периода покоя. Если мышь перемещается ни ни имеет любой из перечисленных выше поведения во время мононити приложения 10 сек, то считается, отрицательный ответ.
      4. Запишите ответ, либо отрицательный или положительный, в лабораторной тетради или ноутбук и повторите эту процедуру на всех остальных мышей с использованием 3,22 г мононити.
      5. Проверьте все еще раз, используя мышей следующий соответствующий мононити. Примечание: Если мышь выставлены отрицательный ответ на мононити 3,22 г, применить 3,61 г мононити таким же образом и записать ответ. Если мышь выставлены положительный ответ на 3.22 г мононити, применять 2,83 г мононити и записать ответ.
   2. Продолжить испытания каждого мышь, используя следующий больший или меньший мононити, в соответствующих случаях, для дополнительных приложений после 4 наблюдается первый положительный ответ.
   3. Вернуться на главную мышей клетки.
   4. Используйте значение конечного фон Фрея мононити применяется в серии опытов в единицах журнала для расчета 50% порог г снятие, как описано в Chaplan др. ^43.

Название "> 3. Сотовый Окрашивание подкисленных Толуидин Голубой мачты

1. Обработка ткани
   1. Рассеките простаты ткани ⁴⁴ от мышей, которые были внутрисердечно перфузии с ледяной 4% параформальдегидом ^45. Постфикс ткани в 4% параформальдегид в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем в cryoprotect 30% сахарозы в 1x PBS при 4 ° CO / N.
   2. Подготовьте небольшую (30 мл) ванну гептана и поместить его на сухом льду.
   3. Промойте ткань простаты в 1x PBS и высушите с помощью света обязанность уничтожить.
   4. Вставьте ткань простаты в холодным гептаном до тех пор, пока не будет заморожен.
   5. Сразу же место замороженные ткани простаты в cryomold содержащей монтажные средства массовой информации и место на сухом льду, пока не заморожен.
   6. Магазин cryomolds при -20 ° С.
   7. Поперечно резать ткани простаты на 7 мкм толщиной криосрезах использу криостат.
   8. Поместите 8 - 12 несерийные криосрезах, которые охватывают длину ткани, на положительно заряженных микроскопа.
   9. Магазин не закончил слайды при температуре -20 ° С до дальнейшей обработки.
2. Подготовка подкисленной ТОЛУИДИН синий
   1. Добавить 1 г толуидинового синего O в 100 мл 70% этанола и вихревые пока в растворе, чтобы приготовить 1% исходного раствора. Раствор можно хранить при комнатной температуре в течение трех недель.
   2. Добавить 1 г NaCl в 100 мл воды в химическом стакане помещается в верхней части мешалки.
   3. Доводят рН раствора NaCl не используя 12 М HCl до рН в диапазоне 0,5 - 1,0 достигается.
   4. Подготовка 0,25% рабочего раствора толуидин синий путем объединения 8 мл исходного раствора толуидин синий и 32 мл 1% раствора NaCl. Внесите вверх и вниз, чтобы гарантировать полную включение маточного раствора Толуидин Голубой и смешать с использованием вихрь. Рабочий раствор должен быть свежим и выбрасываются после использования.
3. Окрашивание простаты криосрезы
   1. Удалить слайды должны быть обработаны с морозильной камерой и позволит уравновесить до комнатной температуры в течение примерно 30 мдюйм
   2. Промыть срезах тканей по отдельности погружением слайдов в течение примерно 1 сек в 50 мл коническую пробирку, содержащую достаточный объем 1x PBS, чтобы гарантировать, что срезы ткани слайд-смонтирован будет полностью погружен в воду. Разрешить слайды сухой воздух на бумажное полотенце.
   3. Место слайды в окрашивания стеклянный сосуд достаточно 0,25% рабочего раствора толуидин синий чтобы гарантировать, что срезы ткани слайд-смонтирован будет полностью погружен и инкубируют в течение 10 - 15 мин, а на платформе-качалке, установленной на 15 оборотов в минуту.
   4. Dip слайдов в 1x PBS в течение приблизительно 1 сек, чтобы смыть лишнюю толуидиновым синим.
   5. Поместите слайды в коробке слайдов или стойке таким образом, что слайды на их сторонах, чтобы позволить для дренажа.
   6. Сушат слайды в печи при 37 ° С в течение как минимум 2 ч или O / N при комнатной температуре.
   7. Дегидрировать слайды быстро, используя спирт, позволяя слайды к абсолютно сухой между экспозициями алкоголя. Сухие горки, слив на бумажное полотенце ай вытирая спины и ребер с легким обязанностей протрите.
      1. Погрузитесь слайдов в 95% этанола в течение приблизительно 1 сек и позволяют полностью высохнуть. Повторите эту процедуру 1 - 10 раз, пока ткань не сохнет синий, чем фиолетовый.
      2. Погрузитесь слайдов в 100% этанола в течение приблизительно 1 сек и позволяют полностью высохнуть. Повторите эту процедуру 1 - 10 раз, пока ткань не темно-синий и среднего, но не фиолетовый.
   8. Закрепить окраску путем инкубации слайды в 100% ксилола в течение 3 мин. Дать высохнуть.
   9. Покровное слайды с глицерином, PBS, или ксилола на основе постоянного крепления СМИ. Слейте лишнюю СМИ и магазин при комнатной температуре.
4. Количественная тучных клеток
   1. Визуализируйте ТОЛУИДИН разделы сине-окрашенные ткани на 20-кратным увеличением с помощью световой микроскопии (рис 2).
   2. Подсчитайте общее количество тучных клеток, присутствующих в область отображения и различать не-дегранулированных и дегранулированных тучных клеток. 40X Magnificatион может быть необходимо, чтобы подтвердить статус грануляции в некоторых тучных клеток.
      Примечание: Не дегранулированных тучные клетки обладают плотной метахромазию с отсутствием или слабым ядерной набросков и / или не гранулированного экструзии вокруг клетки. Дегранулированных тучные клетки обладают менее интенсивный метахромазию и имеют очевидное четкие очертания ядра и / или свободных гранул в цитоплазме и за пределами границы ячейки.
   3. Продолжить, чтобы оценить общее количество не-дегранулированных и дегранулированных тучных клеток в объеме раздела текущего ткани. Повторите эту процедуру, по крайней мере 7 дополнительных отдельных секций, охватывающих длина каждой ткани.
   4. Рассчитывают процент дегранулированных (DG) в общем объеме тучных клеток для каждой ткани / мышь в соответствии со следующей формулой: (DG тучные клетки / Всего тучные клетки) х 100.

Результаты

Мыши, которые прошли НМС показали поведенческие доказательства, указывающего CP / СХТБ. При тестировании с градуированной серии фон Фрея мононити, 8-недельных мышей NMS (п = 4) отображается perigenital механической аллодинии, когда по сравнению с наивных коллег (п = 5, рис 2). Об этом свидет?...

Обсуждение

Этот протокол обеспечивает методологию для использования у новорожденных стресс, в форме NMS, чтобы вызвать симптоматику, указывающую CP / ПКЮТО в взрослых самцов мышей. Как взрослые, НМС мыши обнаруживают значительное perigenital механической аллодинии, а также доказательства дегрануляции т...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant C57BL/6 female mice	Charles River	027	Timed or untimed pregnant females should be monitored daily for in-house birth.
2 L glass beaker(s)	Sigma-Aldrich	CLS10002L	Each NMS litter will be held in the same beaker throughout the 21 day separation period.
VWR Forced Air Incubator, Basic	VWR International	414005-124	The incubator should be held at 33°C and 50% humidity.
Touch Test Sensory Evaluator, Kit of 20 (Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer for touch assessment)	Stoelting	58011	The following monofilaments should be used for perigenital sensitivity assessment: 1.65 g, 2.36 g, 2.83 g, 3.22 g, 3.61 g, 4.08 g, 4.31 g, and 4.74 g.
Animal Enclosure (12 mice 6 rats)	IITC	435	Be sure to place a heavy object on top of the individual, acrylic animal enclosures to prevent mice from escaping.
Mesh Stand for mice and rats (12 mice 6 rats)	IITC	410	Place stand on a stable table top for comfortable access.
Phosphate buffered saline	Sigma-Aldrich	P5493	Dilute the 10x PBS stock to 1x PBS.
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	A 4% paraformaldehyde solution is needed to intracardially perfuse mice and postfix tissue in preparation for mast cell staining.
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016	Cryoprotect fixed tissue in 30% sucrose solution at 4°C overnight.
Heptane	Sigma-Aldrich	246654	Chill heptane on dry ice to freeze tissue.
Standard Cryomold	VWR International	4557	To assist in freezing prostate tissue prior to cryostat sectioning
Tissue-Tek OCT Compound	Sakura	4583	12 x 125 ml
VWR Superfrost Plus Micro Slide	VWR International	48311-703	75 x 25 x 1 mm
Toluidine Blue O	Sigma-Aldrich	198161	Certified by the Biological Stain Commission. Suitable for use as a metachromatic stain for mast cells.
Ethanol, Absolute (200 Proof)	Fisher Scientific	BP2818-4	Molecular Biology Grade, Fisher Bioreagents; 95% and 100% solutions will be needed to dehydrate stained cryosections before mast cell visualization.
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Acidified NaCl solution should be made fresh before staining cryosections.
GeneMate Sterile 50 ml Centrifuge Tubes	BioExpress	C-3394	Disposable tubes used to mix toulidine blue elements or dip slides into 1xPBS.
Coplin staining dish for 10 slides, with ground glass cover	Fisher Scientific	08-815	Hold up to 10 standard 3 x 1 in. (75 x 25mm) slides back-to-back. Use separate dishes for Toluidine Blue working solution, 95% EtOH, 100% EtOH, and xylene.
Xylenes (Histological)	Fisher Scientific	X3P	Once dehydrated, tissue is cleared with xylene.
Microscope Slide Boxes, 100-Place	VWR International	82003	Boxes can be used for storage and transportation of slides.
Fisherbrand Microscope Slide Box	Fisher Scientific	22-363-400	These slide boxes are typically small enough to fit inside a cryostate.
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Glycerol is a traditional mounting medium.
Mounting Medium, Richard-Allan Scientific	VWR International	4111	Mounting medium firmly bonds the coverslip to the slide.
Micro Cover Glasses, Rectangular, No. 1	VWR International	48393-106	A coverslip is placed over the dehydrated and cleared tissue to protect the sample.
Light Microscope	Nikon		The Advanced Automated Research Microscope Eclipse 90i, used by our lab, has been discontinued and replaced Eclipse Ni-E.