JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

In this study we present an in vitro culture system that can efficiently generate pDCs by co-culturing common lymphoid progenitors with AC-6 feeder cells in the presence of Flt3 ligand.

Аннотация

Плазмоцитов дендритные клетки (PDCs) являются мощным типа интерферона (ИФН-I), производящие клетки, которые активируются в ответ на инфекцию или во время воспалительных реакций. К сожалению, исследование функции PDC препятствует их низкой частоты в лимфоидных органах, а существующие методы экстракорпорального поколения DC преимущественно в пользу производства CDCs над PDCs. Здесь мы представляем уникальный подход эффективно генерировать PDCs из общих лимфоидных клеток-предшественников (CLPS) в пробирке. В частности, протокол, описанный подробно, как очистить CLPS из костного мозга и генерировать PDCs по сокультивировани гамма-облученной АС-6 фидерных клеток в присутствии лиганда Flt3. Уникальной особенностью этой системы культуры является то, что CLPS мигрировать под AC-6 клеток и стать булыжником площадь формирования клеток, важным шагом для расширения PDCs. Морфологически различные контроллеры домена, а именно PDCs и CDCs, были получены примерно через 2 недели с составом 70-90% PDCs в оптимальных условиях. Как правило, количество генерируемых PDCs этим методом, примерно в 100 раз количества CLPS семенами. Таким образом, это новая система, с которым решительно генерировать большое количество PDCs, необходимых для облегчения дальнейших исследований в развитие и функции этих клеток.

Введение

Дендритные клетки (ДК) являются профессиональными антиген-представляющими клетками, которые играют важную роль в регулировании иммунного ответа 1. В то время как контроллеры домена являются гетерогенными, они могут быть классифицированы на две популяции, обычный РС (CDCs) и плазмоцитов ДК (PDCs) 2,3. В дополнение к лимфоидных органов, CDCs и PDCs также найдены в тканях, включая легкие, кишечник и кожу 2. Морфология CDCs и PDCs отличается, с CDCs проявляющих дендритных-выступы и форма PDCs быть более плазмы клеток, как. Кроме того, общий мыши округ Колумбия, CD11c, более высокий уровень экспрессии на CDCs чем на PDCs. Кроме того, CDCs может быть разделен на CD11b + CD24 - CDCs и CD11b - CD24 + CDCs, оба из которых выражают более высокие уровни МНС класса II и молекулы костимулирующих чем сделать PDCs 2. Зрелые PDCs, с другой стороны, было показано, что выборочно выразить Siglec-H и BST2 4. Functionally, CDCs являются лучшими антиген-представляющих клеток, чем PDCs; Однако, PDCs может производить огромное количество типов интерферона на вирусной инфекции или воспалительных стимуляции 5.

Оба CDCs и PDCs недолговечны, и, следовательно, должны быть постоянно пополняется из предшественников в костном мозге (ВМ) 6,7. Приемных передачи общих миелоидных клеток-предшественников (CMPS) и общих предшественников лимфоидных (CLPS) в смертельно облученных мышей-показывает, что CDCs и PDCs могут быть получены из обеих линий 8-10. Тем не менее, есть подмножество PDCs, выражающих RAG1 / 2 и обладают переставить DJ сегменты на IgH локуса 11,12. Эти клетки также поделиться молекулярные сходства с В-лимфоцитами, в том числе выражения B220 маркера, кислоты зондирования рецепторов нуклеиновых (TLR7 / TLR9), и транскрипционных факторов (SPIB и Bcl11a) 13, имеет все полагают, подписи лимфоидной линии. Таким образом, CLPс может быть хорошим выбором для поколения в пробирке PDCs из-за сходства клонов.

В то время как частота обоих CDCs и PDCs у человека и мышей очень низка 6, ДК, в частности CDCs, могут быть получены в лабораторных от BM или предшественников в присутствии цитокинов, таких как GM-CSF или 11,14 Flt3 лиганда (FL ) с использованием фидерных систем без 11,15,16. К сожалению, однако, это не возможно, чтобы произвести большое количество PDCs в пробирке с использованием FL 11,15,16. Ранее мы показали, что PDCs может быть эффективно генерируется в пробирке из CLPS с использованием системы АС-6 подачи 17. Преимущество использования стромальных клеток линии АС-6 в системе культуры в том, что оно обеспечивает контакт клетка-клетка и секреции цитокинов, которые поддерживают генерацию большого количества PDCs от CLPS. Хотя производство этой системы вполне надежный, заботливый репликации из процедур, описанных ниже, обязательны Яп Для того чтобы обеспечить эффективную генерацию PDCs.

протокол

/ 6 мышей дикого типа C57BL были приобретены из Национальной лаборатории Центра животных (NLAC), Тайвань. Все мыши были выведены и выдерживают при конкретного патогена условиях. Протоколы и процедуры использования животных были рассмотрены и одобрены уходу и использованию комитета Институциональная животных Национального Тайваньского университета Медицинского колледжа (разрешение Номер: 20120075) по. Кроме того, исследователи сделали все возможное, чтобы уменьшить потенциал для боли, страданий, или терпящим бедствие на животных при выполнении экспериментов. Все процедуры, описанные проводились при комнатной температуре в перчатках.

1. Подготовка AC-6 фидерных клеток

Примечание: АС-6,21 (AC-6 в краткосрочной) линии 18 стромальных клеток (при условии И. Вайсман, Стэнфордский университет) должна поддерживаться в среде RPMI, дополненной 15% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS). Чтобы служить в качестве питательных клеток, АС-6 клетки γ-облучении 3000 рад (30Gy) за один день до совместной культуры, чтобы предотвратить их распространение. Примечание гона АС-6 клеток, как правило, теряют свою дифференцировку поддержки способность, если покинул переполнены во время технического обслуживания, или если их количество проход более 20.

  1. Промыть АС-6 клеток один раз 1 мл Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором (DPBS) и удалить аспирацией DPBS. Treat АС-6 клеток в 0,8 мл раствора трипсина (0,05% трипсина и 0,5 мМ ЭДТА) в DPBS в течение 3-5 мин при температуре 37 ° С, 5% СО 2 и затем реакцию останавливают разбавлением 10 объемов питательной среде с целью сделать клеточной суспензии.
  2. Семенной АС-6 клеток на 5.9x10 4 клеток / лунку в 12-луночные планшеты и инкубируют при 37 ° С, 5% СО 2 O / N.
    Примечание: Плотность тока, 6 клеток очень важно, поскольку более низкой плотностью будут способствовать генерации CDC. Сеялки при плотности 5.9x10 4 клеток / лунку позволит АС-6 для достижения слияния на следующий день, который является оптимальным для вывода PDCs из CLPS.
  3. Облучают АС-6 клеток при 3000 рад (30 Гр) с использованием гамма-облучатель.
    Заметка: Доза для облучения AC-6 оптимизирована для предотвращения клетки от пролиферации и еще держать их жизнеспособными достаточно долго, чтобы обеспечить цитокинов и межклеточных контактов, необходимых для дифференциации ДК от CLPS.
  4. Аспирируйте среднего и заменить 1 мл среды RPMI полной (RPMI с 10% инактивированной нагреванием FBS, 50 мкг / мл гентамицина и 50 мкМ β-меркаптоэтанол).

2. Изолировать BM-клетки мышей

  1. Жертвоприношение мышей от СО 2 удушья и цервикальной дислокации. Поместите мышей на рассечение лоток и стерилизовать 70% -ным этанолом. Сделайте надрез в середине живота и снимите кожу от дистальной части мыши в том числе кожи, покрывающей нижние конечности.
  2. Проанализируйте мышей в полу-стерильных капот. Чтобы освободить бедра и голени, обрезать выше бедра и голени ниже коленного сустава. Снять мышцы от костей с помощью ножниц и место кости в 6 см чашку Петри, содержащую 5 мл RPMI завершить.
  3. Переместить в стерильной капот культуры. Заполните 3 мл шприц, соединенный с иглой 27G в полной среде RPMI с. Отрежьте оба конца костей с помощью ножниц и вставьте 27G иглу, чтобы очистить мозг из костей, осторожно инъекционных полный RPMI один раз с каждого конца.
  4. Подготовка суспензии отдельных клеток, осторожно пипеткой клетки вверх и вниз 3-5 раз в культуральной чашке с использованием шприца без иглы.
  5. Центрифуга клетки в течение 5 мин при 500 х г и декантируют супернатант.
  6. Лизировать эритроциты 1 мл буфера ACK (150 мм NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, 0,1 мМ ЭДТА) инкубирование в течение 1 мин и реакцию останавливают разбавлением 10 объемами полного RPMI. Разрешить клетки стоят в течение 5 мин для того, чтобы на пеллетах замертво скопления клеток и тканей мусора под действием силы тяжести.
    Примечание: Не стоит более 5 мин, как это приведет к потере клеток из-за оседания жизнеспособных клеток.
  7. Медленно Декантировать клеток, содержащих супернатант в новую пробирку, оставляя мусорапозади в пробирку.
  8. Центрифуга в течение 5 мин при 500 мкг для осаждения клеток, затем снимите и выбросьте супернатант.
  9. Ресуспендируют общий клетках костного мозга (обычно 4-6 х 10 7 BM-клетки получают от одной мыши) в 100 мкл FACS буфера (PBS + 1x 2% FBS + 1 мМ ЭДТА).

3. FACS анализа и сортировки CLPS

  1. Добавить анти-CD16 / 32 (гибридомы, супернатант клона 2.4G2, 50 мкл / реакции или 1-2 мкг / реакция) в клетки в FACS буфере (этап 2.9) в течение 1-2 мин, чтобы блокировать рецепторы Fc.
    Примечание: Анти-CD16 / 32 также называют Fc-блок, который добавляется для предотвращения неспецифического связывания антител с клетками, экспрессирующими Fc рецепторы, включая гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов.
  2. Одновременно окрашивает клетки со следующими красителем меченых антител флуоресцентных (для 4x10 7 клеток) в течение 15 мин на льду, избегая освещенности. Антитела: ПЭ-сопряженных маркеры Lineage (0,2 мкг каждого) в том числе анти-CD3 (17A2), анти-CD8 (53-6.7), анти-В220 (RA3-6B2), против CD19 (eBio1D3), анти-CD11b (М1 / 70), анти-Gr-1 (RB6-8C5), анти- Thy1.1 (HIS51), анти-NK1.1 (PK136), анти-Ter119 (ТЕР-119), и анти-МНС-II (NIMR-4), 0,2 мкг анти-с-Kit-PerCP-Cy5.5 (2В8), 1 мкг анти-ССС-1-FITC (D7), 0,4 мкг анти-М-ЧСФР-АРС (AFS98) и 0,2 мкг анти-IL-7Rα-ПЭ-Cy7 (A7R34).
  3. Промыть клеток 3 мл FACS буфера и центрифуги в течение 5 мин при 500 х г в.
  4. Ресуспендируют клетки в 300 мкл FACS буфера, и клетки фильтр через сито 40 мкм клетки.
  5. Промыть пробирку с дополнительным 100 мкл FACS буфера для восстановления любых оставшихся клеток и фильтр в стерильный FACS сортировки трубку, используя тот же фильтр клеток.
  6. Сразу Выполнить анализ потока цитометрии после окрашивания с использованием соответствующих фильтров и напряжения для обнаружения сигнала. Используйте нм лазер 488 для обнаружения FITC-, PerCP-Cy5.5-меченых антител, нм лазер 561 для обнаружения ПЭ и ПЭ-Cy7-labelded антитела и 633 нм ласэ обнаружить APC-меченого антитела.
  7. Разобраться CLPS по следующим маркеров Lin - C-комплект INT SCA-1 INT ​​М-CSFR - Ил-7Rα + (а, окрашенных в шаге 3.2) с использованием клеточного сортера. Сбор отсортированных клеток в 15 мл пробирку, содержащую 8 мл полной среды RPMI в качестве подушки.
  8. Запись абсолютное число отсортированных клеток, как показано на клеточного сортера на конце прогона. Как правило, 5х10 4 CLPS могут быть получены из одного БМ мыши.

4. Совместное культивирование CLPS и AC-6

  1. Центрифуга отсортированные клетки от шага 3.7 в течение 10 мин при 500g, удалить супернатант, и ресуспендируют осадок клеток с достаточно полной среде RPMI, чтобы получить плотность клеток вокруг 5х10 4 клеток / мл. Семенной 500 клеток / лунку в 12-луночного планшета, содержащую фидерные клетки, полученные на стадии 1.4.
  2. Добавить 100 нг / мл FL 19 (HU-Flt3L-Ig-генерируется в доме с использованием системы экспрессии согласно М. Манц, Universiти Больница Цюрих, Швейцария) и инкубировать при 37 ° С, 5% СО 2 с периодическим визуальным контролем развития постоянного тока под микроскопом.
    Примечание: Коммерчески доступный рекомбинантный человеческий FL или мыши FL может быть использован в качестве замены для HU-Flt3L-Ig поддержки развития постоянного тока.
  3. Сбор клеток в супернатант в 12 день и мыть скважин раз с 0,5 мл RPMI среду завершить сочетая полученные супернатанты. Добавить 0,5 мл свежей среды и лом прикрепленные клетки с клеточным скребком.
  4. Смешайте клеток, содержащих среду от обеих частей и центрифуги в течение 5 мин при 500 х г в.
  5. Сцеживать супернатант и ресуспендирования клеток в 50 мкл FACS буфера. Добавить 50 мкл анти-CD16 / 32 гибридом супернатанта и инкубировать в течение 1-2 мин, чтобы блокировать Fc рецепторы.
  6. Перечислять и окрасить все клетки со следующими антителами (0,05 мкг каждая) анти-CD11c-АРС (N418), анти-CD11b-FITC и анти-В220-PE.
  7. Вымойте и центрифуги клетки, как описатьд в шаге 3.3.
  8. Ресуспендируют клеток в 100 мкл FACS буфера, ворота на CD11c + и анализировать для CDCs (CD11c + CD11b + B220 -) и PDCs (CD11c + CD11b - B220 +) 17.

Результаты

В общей сложности 4-6x10 7 ВМ клетки, как правило, изолированы от бедренных костей голени и одного 6-8 WK-старого дикого типа C57BL / 6 мыши. Чтобы до конца разобраться CLPS, всего клетки BM окрашивали PE-сопряженных антител против клона маркеров (CD3, CD8, В220, CD19, CD11b, GR-1, Thy1.1, NK1.1, Ter119 и МНС-II), анти -с-Ко...

Обсуждение

Здесь мы опишем в пробирке культуру систему для надежной генерации ДК и PDCs в частности, из небольшого числа CLPS. Уникальность этой системы культуры связано с использованием АС-6 клеток, в стромальных клеток линии, как питатели. Этот подход был показан, чтобы обеспечить не только цито...

Раскрытие информации

Authors have nothing to disclose.

Благодарности

Мы благодарны д-ра. Маркус Манц и Ирвинг Вайсман для обеспечения реагентов. Мы также признаем, услугу, предоставляемую на проточной цитометрии анализа и сортировки клеток ядра фонда Первого и Второго центральной лаборатории Национального университета Тайваня Медицинского колледжа и больницы НТУ, соответственно. Эта работа была поддержана Министерством науки и технологий, Тайвань (МОСТ 102-2320-B-002-030-MY3) и национальные медицинских исследовательских институтов, Тайвань (НПУ-EX102-10256SI и НПУ-EX103-10256SI).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse Ly6g/Ly6c (PE), clone RB6-8C5Biolegend108408linage marker
Anti-mouse NK1.1 (PE), clone PK136Biolegend108708linage marker
Anti-mouse  CD11b (PE), cloneM1/70Biolegend101208linage marker
Anti-mouse CD19 (PE), clone eBio1D3Biolegend115508linage marker
Anti-mouse B220 (PE), clone RA3-6B2Biolegend103208linage marker/FACS
Anti-mouse CD3 (PE), clone 17A2Biolegend100308linage marker
Anti-mouse CD8a (PE), clone 53-6.7Biolegend100707linage marker
Anti-mouse MHC-II (PE), clone NIMR-4Biolegend107608linage marker
Anti-mouse Ter119 (PE), clone TER-119Biolegend116208linage marker
Anti-mouse Thy1.1 (PE), clone HIS51eBioscience12-0900-83linage marker
Anti-mouse M-CSFR (APC), clone AFS98Biolegend135510FACS
Anti-mouse c-Kit (PerCP/Cy5.5), clone 2B8Biolegend105824FACS
Anti-mouse Sca-1 (FITC), clone D7Biolegend108106FACS
Anti-mouse IL-7Ra (PE/Cy7), clone A7R34Biolegend135014FACS
Anti-mouse CD11c (PerCP/Cy5.5), clone N418Biolegend117328FACS
Anti-mouse CD11b (FITC), clone M1/70Biolegend101206FACS
FACSAria IIIBD BiosciencesCell sorter
FACS sorting tube BD Biosciences352054
FlowJoFlowJo LLCFlow analysis sofrware

Ссылки

  1. Hartwig, C., et al. Fcgamma receptor-mediated antigen uptake by lung DC contributes to allergic airway hyper-responsiveness and inflammation. Eur. J. Immunol. 40, 1284-1295 (2010).
  2. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu. Rev. Immunol. 31, 563-604 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and Function of Dendritic Cell Subsets. Immunity. 40, 642-656 (2014).
  4. Swiecki, M., Colonna, M. Unraveling the functions of plasmacytoid dendritic cells during viral infections, autoimmunity, and tolerance. Immunol. Rev. 234, 142-162 (2010).
  5. Liu, Y. J. IPC: professional type 1 interferon-producing cells and plasmacytoid dendritic cell precursors. Annu. Rev. Immunol. 23, 275-306 (2005).
  6. Merad, M., Manz, M. G. Dendritic cell homeostasis. Blood. 113, 3418-3427 (2009).
  7. Ghosh, H. S., Cisse, B., Bunin, A., Lewis, K. L., Reizis, B. Continuous expression of the transcription factor e2-2 maintains the cell fate of mature plasmacytoid dendritic cells. Immunity. 33, 905-916 (2010).
  8. Karsunky, H., Merad, M., Cozzio, A., Weissman, I. L., Manz, M. G. Flt3 ligand regulates dendritic cell development from Flt3+ lymphoid and myeloid-committed progenitors to Flt3+ dendritic cells in vivo. J. Exp. Med. 198, 305-313 (2003).
  9. Manz, M. G., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L., Akashi, K. Dendritic cell potentials of early lymphoid and myeloid progenitors. Blood. 97, 3333-3341 (2001).
  10. D'Amico, A., Wu, L. The early progenitors of mouse dendritic cells and plasmacytoid predendritic cells are within the bone marrow hemopoietic precursors expressing Flt3. J. Exp. Med. 198, 293-303 (2003).
  11. Sathe, P., Vremec, D., Wu, L., Corcoran, L., Shortman, K. Convergent differentiation: myeloid and lymphoid pathways to murine plasmacytoid dendritic cells. Blood. 121, 11-19 (2013).
  12. Shigematsu, H., et al. Plasmacytoid dendritic cells activate lymphoid-specific genetic programs irrespective of their cellular origin. Immunity. 21, 43-53 (2004).
  13. Reizis, B., Bunin, A., Ghosh, H. S., Lewis, K. L., Sisirak, V. Plasmacytoid dendritic cells: recent progress and open questions. Annu. Rev. Immunol. 29, 163-183 (2011).
  14. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J. Exp. Med. 176, 1693-1702 (1992).
  15. Naik, S. H., et al. Development of plasmacytoid and conventional dendritic cell subtypes from single precursor cells derived in vitro and in vivo. Nat. Immunol. 8, 1217-1226 (2007).
  16. Onai, N., et al. Identification of clonogenic common Flt3+M-CSFR+ plasmacytoid and conventional dendritic cell progenitors in mouse bone marrow. Nat. Immunol. 8, 1207-1216 (2007).
  17. Chen, Y. L., et al. A type I IFN-Flt3 ligand axis augments plasmacytoid dendritic cell development from common lymphoid progenitors. J. Exp. Med. 210, 2515-2522 (2013).
  18. Whitlock, C. A., Tidmarsh, G. F., Muller-Sieburg, C., Weissman, I. L. Bone marrow stromal cell lines with lymphopoietic activity express high levels of a pre-B neoplasia-associated molecule. Cell. 48, 1009-1021 (1987).
  19. Onai, N., Obata-Onai, A., Tussiwand, R., Lanzavecchia, A., Manz, M. G. Activation of the Flt3 signal transduction cascade rescues and enhances type I interferon-producing and dendritic cell development. J. Exp. Med. 203, 227-238 (2006).
  20. Szilvassy, S. J., et al. Leukemia inhibitory factor upregulates cytokine expression by a murine stromal cell line enabling the maintenance of highly enriched competitive repopulating stem cells. Blood. 87, 4618-4628 (1996).
  21. Arcanjo, K., et al. Biochemical characterization of heparan sulfate derived from murine hemopoietic stromal cell lines: a bone marrow-derived cell line S17 and a fetal liver-derived cell line AFT024. J. Cell. Biochem. 87, 160-172 (2002).
  22. Onai, N., et al. A clonogenic progenitor with prominent plasmacytoid dendritic cell developmental potential. Immunity. 38, 943-957 (2013).
  23. Whitlock, C. A., Muller-Sieburg, C. E. Long-term B-lymphoid cultures from murine bone marrow establishment and cloning by using stromal cell line AC 6.21. Methods Mol. Biol. 75, 231-248 (1997).
  24. Chen, Y. -. L., Chang, S., Chen, T. -. T., Lee, C. -. K. Efficient Generation of Plasmacytoid Dendritic Cell from Common Lymphoid Progenitors by Flt3 Ligand. PLoS ONE. 10 (8), e0135217 (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1056Flt3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены