Способ оценки подкрепляющих свойств этанола в Крысы без воды депривации, сахарин выцветания или дополнительного обучения доступа

Резюме

Этот протокол описан новый и эффективный способ быстро начать оперантный реагирует на этанол у крыс, что, в отличие от стандартных методов, не требует лишение воды или сахарин / сахарозу замирание для инициирования реагирования.

Аннотация

Оперантное методы оральные самоуправления, как правило, используются для изучения подкрепляющих свойств этанола у животных. Тем не менее, стандартные методы требуют сахарин / замирание сахарозы, водной депривации и / или при обращении обучение для инициирования оперантный реагирования на крысах. В данной статье описан новый и эффективный метод, чтобы быстро начать оперантного отвечать на этанол, который удобен для экспериментаторов и не требует лишения воды или сахарин / увяданию сахарозы, тем самым устраняя потенциальную посрамить использования подсластителей в этаноле исследований оперантных самоуправления. С помощью этого метода, как правило, крысы Wistar приобретать и поддерживать Самоуправление 20% -ного раствора этанола в течение менее двух недель тренировок. Кроме того, концентрации и выгоды этанола в крови положительно коррелируют на сессии самоуправления 30 мин. Кроме того, налтрексон, УЛХ одобрил препарат для алкогольной зависимости, что было показано, чтобы подавить этанол самоуправленияу грызунов, дозозависимо снижает потребление алкоголя и мотивации к потреблению алкоголя у крыс самоуправляющиеся 20% этанола, что подтверждает использование этого нового метода для изучения подкрепляющих свойств алкоголя у крыс.

Введение

Разработка моделей на животных для изучения подкрепляющие эффекты лекарственных средств стало важным инструментом для изучения наркомании человека. Более конкретно, оперантный самоуправление является широко используется модель поведения, которая является одним из наиболее эффективных средств для оценки положительных усиливающих эффектов перорально потребленный раствора этанола. Ранний проблема с разработкой такой модели был основным аверсивный вкус высокой концентрации этанола для большинства грызунов, явление , которое разделяют также у людей с небольшим опытом или без опыта с алкоголем ^1. Стандартный протокол для преодоления этого барьера требует воды лишения и / или сахарин сахарозы выцветания для приобретения и поддержания самоуправления. Тем не менее, эти два подхода не выгодно. Они требуют длительных периодов обучения, чтобы просто начать отвечать на этанол и получить относительный показатель успешности приобретения. Использование подсластителей также вводит потенциальное смещение винтерпретация данных самоуправления. Эти ограничения не применяются к следующему протоколу.

В кратком изложении, Самсон и коллеги ² показали , что растворение этанола в сладком растворе 20% сахарозы , а затем выведении сладостью в течение 4 -х недель тренировок требуется для инициирования реагирования на 10% этанола в воде. Кроме того, потребление этанола надежный обычно достигается в 6 до 8 недель , ^1-3. Такой подход является весьма проблематичным. Во-первых, это требует длительных периодов обучения, прежде чем исследователи могут начать измерять этанол самоуправления. В противоположность этому , внутривенные самоуправления кокаина или героина требуется 0 - 1 дней предварительной подготовки наркотиков на рычаге пищевого доставки в пищевых животных ограничено, и стабильное реагирование на лекарства часто достигается в течение 10 - 12 дней ^4,5. Другим ограничением этого метода является то, что сахарин и сахароза являются весьма полезным для крыс и выявить паттерны активации мозга Similar к наркотикам злоупотребления, тем самым вводя потенциал для путает в этаноле самоуправления изучает ^6-9. И, наконец, у крыс , приобретающие Самоуправление раствора этанола с использованием этого метода показать изменчивость в приобретении и отклика скорости ^1,10, со значительной долей крыс последовательно исключены из эксперимента из - за неудачного приобретения и / или недостаточной скорости отклика.

В противоположность этому, с этим протоколом, мы представляем простой, но эффективный метод для приобретения и поддержания пероральной самостоятельного введения 20% -ного этанола в водном растворе, который не требует воды лишения, сахарозу / сахарин выцветания или расширенного доступа обучение. Недавнее исследование показало, что самолечение для орального этанола показывает перевернутую U образную кривую зависимости ответа от дозы с высоким потреблением этанола во время самостоятельного введения при концентрации этанола 20%, таким образом, обеспечивая обоснование выбора 20% -ного раствора этанола в нашем experimСИХИЧЕСКОЕ дизайн ^11.

протокол

Все процедуры проводятся в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Уход за животными и жилищно-коммунального

1. По прибытии в колонию, у крыс Wistar дом мужчина весом 200 - 225 г при прибытии в пар при температуре (21 ° C) и влажности окружающей среды под контролем с обращенным 12 ч свет-темнота цикла.
   Примечание: В зависимости от обоснования экспериментов, крысы могут быть одной размещены.
2. Дайте крыс акклиматизироваться в виварии и светового цикла в течение по крайней мере одной недели перед началом эксперимента и справиться с ними ежедневно. Взвешивание животных один раз в неделю.
3. Дайте крыс свободный доступ к корму для и водопроводной воды в течение всего срока эксперимента (водной депривации не нужно инициировать реагирования ^12). Проводить все тестирования поведения во время темной фазы цикла свет-темнота в темной комнате тестирования.
   Примечание: Хотя мы обычно используем молодых взрослых мужчин крыс линии Вистар (послеродовые дни 62 - 65), этот рrotocol теоретически может быть пригодным для исследования других штаммов крыс, а также половые и / или возрастные различия.

2. Обучение Оперантное

1. Провести все поведенческие обучение и тестирование в идентичных рабочих камерах для измерения 30,5 × 29,2 × 24,1 см и содержащий сетки полы и сковородки отходов, выровненные с подстилкой (изменилось между животными, чтобы уменьшить запах киев), расположенный в звукосигнальных смягчающих кабинок, оборудованных вытяжными вентиляторами для вентиляции ,
   Примечание: Крыс обучают оперантного кондиционирования с 1 дня обучения (ответ на рычаг необходимо получить упрочнитель) от + 1 ч + 8 ч темного цикла. Там нет предварительного воздействия алкоголя, ни пищи или формирования жидкости перед тренировкой спирта.
2. Одета каждый оперантного камеры с огнями стимула, шприцевые насосы и двумя выдвижными рычагами, расположенными сбоку к жидкой чашке сосуда. Камеры интерфейса и управления с помощью компьютера с помощью соответствующего программного обеспечения.
   Заметка:Большинство поставщиков будет предоставлять пакеты самоуправления, содержащие все необходимые компоненты, а также программное обеспечение и интерфейсы, необходимые для управления камерами.
3. Написать программу оперантного кондиционирования, которая инициирует график фиксированного соотношения (FR) 20% этанола армированием (ые оперантный график, в котором реакция усиливается только после определенного количества ответов) в соответствии с инструкциями изготовителя. Например, в фиксированной пропорции 1, крысы должны производить один ответ на получение упрочнитель (смотрите раздел Справочная Файлы кода для примера программы FR1). Выполните следующие команды.
   1. Продлить два рычага, чтобы отметить начало сессии и сигнал доступности алкоголя.
      Примечание: Один рычаг нажать на рычаг, связанный с этанолом (активный) награжден поставкой объемом 100 мкл 20% этанола в воде в соседнем питьевой хорошо и инициирует сопутствующий 5-s период тайм-аута сигнализируемая освещениебиток света над рычагом. Кий свет вводится на 1-й день обучения.
   2. Во время тайм-аута, запись отвечать на запросы, хотя он не имеет никаких запланированных последствий. ответы Запись на другой рычаг (неактивным), хотя они никогда не имеют поведенческие последствия. Примечание: неактивный рычаг служит в качестве контроля для оценки неспецифического поведения.
   3. Запишите число ответов на активный рычаг (уровень ответов), а количество 20% этанола награды заработали.
   4. Через 30 мин прошло, убирается два рычага, чтобы сигнализировать об окончании сессии и сигнал об окончании доступности алкоголя.
   5. Сохранение и архивирование всех данных.
4. Перед началом тренировки необходимо проверить правильность функционирования всех устройств в каждой камере оперантного (выдвижные рычаги, жидкость диспенсер).
5. Готовят 20% -ный раствор этанола в / v от 190 Proof (95%) этанола, разбавленного в водопроводной воде.
   Примечание: Этанол раствор можно хранить при комнатной температуре. в зависимостиот производителя, растворы запас этанол может быть до 99,98%. Также отметим, что, в то время как в большинстве опубликованных рукописей, концентрация этанола, как правило, представлены как объем / объем, некоторые из них могут представлять их как вес / объем.
6. Заполните шприц с 20% -ным раствором этанола и убедитесь, что нет утечки или пузырьков воздуха в настое линиях. Надавите вручную небольшой объем этанола, посредством инфузии линии, чтобы убедиться, что этанол будет правильно доставлен в емкость с первого усиленного ответа. Сушат сосуд с бумажным полотенцем и убедитесь, что он пуст перед началом сеанса.
7. Загрузите программное обеспечение, которое контролирует график FR 20% -ного этанола арматуры
8. Поезд operant- и крысы наркотиков наивный в соответствии с графиком FR1 самовведению 20% этанола без воды лишения в течение 30 мин сессий.
   1. Транспортировка крыс из вивария в комнату тестирования с использованием транспортной клетки.
   2. Назначают каждую крысу в одну камеру.Возьмите каждую индивидуальную крысу из транспортной клетки и поместить его в назначенном камере самоуправления.
   3. Старайтесь, чтобы условия эксперимента последовательно каждый день. Поэтому, всегда проверяйте крыс в той же камере самоуправления примерно в то же время каждый день.
   4. Запустите программное обеспечение, которое инициирует график FR1 из 20% этанола арматуры.
   5. В конце сессии, удалите крыс из камер самоуправления и вернуть их в виварии.
   6. Для того чтобы вручную подтвердить, что решение алкоголь потребляется животными, используйте бумажное полотенце и проверить, если сосуд сушат. В качестве альтернативы, используйте 1 или 2 мл шприц и собирают оставшуюся в емкости для оценки объема, который не расходуется жидкость.
      Примечание: Для более точного измерения (но и более дорогие), можно оборудовать каждую камеру с системой lickometer, присоединенным к жидкостному чашеобразной сосуд, который позволяет точно подсчет облизываниеы производства крыс во время сессии самоуправления.
   7. Очистите стены и сетки пол каждой камеры с поверхностным дезинфицирующим средством.
   8. После использования, поддерживать Вливание линии путем очистки их 70% -ным раствором этанола. Когда устройство не используется, вставьте колпачок, чтобы избежать плесени и пыли.
9. После каждой сессии, собирать и анализировать данные, сгенерированные. Более конкретно, вычислить среднее число активных рычажные прессы, среднее количество алкоголя вознаграждения, полученного так же, как среднее число неактивных рычажные прессы.
   Примечание: В большинстве работ, потребление алкоголя также представлен как потребление этанола в г / кг веса тела (). Потребление Этанол можно рассчитать по следующей формуле:
   
   При объеме потребленной (мл) - количество заработанных наград ± унитарной объем / награды и плотности этанола при комнатной температуре - 0,789 г / мл.
   Например, если крыса весом 400 г заработал 20 РеваРДС 20% -ного раствора об / об этанол:
   
10. не провести сеанс 5/6 дней в неделю до стабилизации производительности (определяемой как минимум 15 сеансов и без изменений более 15% в общем количестве наград, полученных в течение последних 3-х сеансов).
    Примечание: После того, как крысы достигли стабильной базовой линии на FR1, оперантное программа кондиционирования могут быть изменены в соответствии с инструкциями изготовителя, чтобы увеличить число ответов, необходимых для получения вознаграждения алкоголя. Фиксированной соотношение может, например, быть увеличено до FR2 или FR3, чтобы минимизировать случайное подкрепление.
11. Измерение концентрации этанола в крови:
    1. Для того, чтобы подтвердить, что награды, полученные в сеансе самоуправления потребляются крыс, измерения концентрации этанола в крови после самостоятельного введения. После того как крысы достигли стабильный базовый уровень, сбора крови из латеральной хвостовой вены непосредственно послесессия. Вставьте 23 G иглы в кровеносный сосуд и собрать 50 образцов крови мкл с использованием капиллярной трубки.
    2. Перенести пробы крови по 50 мкл до 10 мл флаконах и верхнее пространство добавляют 50 мкл 1: 1000 изопропилового спирта в качестве внутреннего стандарта. Приготовьте стандартную кривую от 10 до 300 мг / дл от стандартов этанола. Образцы процесса с парофазного пробоотборника с хроматографическую колонку ¹³ в соответствии с настройками производителя.
12. Прогрессивное отношение
    1. Используйте прогрессивные отношения (PR) графики для оценки мотивации животных , чтобы потреблять награду ^14. PR является оперантное график, в котором количество ответов для получения упрочнитель постепенно увеличивается (в других терминах, крысы должны работать больше для каждого последующего вознаграждения).
       Примечание: В отличие от FR сессий, пиар-сеанс не истекло и будет прекращена только один раз 30 мин прошло без завершенного соотношения.
       1. Поместите крыс в их назначенных оперантных коробках и позволяютим реагировать на 20% этанола в соответствии с графиком PR арматуры: Держите все экспериментальные условия , идентичные тем , которые используются в расписании FR (см шаг 2.3), за исключением увеличения требование ответа или стоимость внутри-сессии (т.е. число рычажные прессы требуется на активный рычаг для получения разового вознаграждение этанол) в соответствии со следующей формулой: 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 24, 28, 32 ... Примечание: пример из программа PR приведена в разделе Справочная файлов кода.
       2. Завершить сеанс PR 30 мин один раз прошло без вознаграждения.
          Примечание: контрольная точка определяется как требование последнего завершенного ответа во время PR-сессии.

3. Тестирование Predictive Действительность операнта модели алкогольного САМОУПРАВЛЕНИЯ

Примечание: После того, как крысы приобрели базовый уровень стабильной самоуправления (см шаг 2), можно оценить прогностическую обоснованность модели путемтестирование эффективности налтрексона, в настоящее время FDA одобренный препарат для алкогольной зависимости в снижении 20% -ного этилового спирта самоуправлением. Мы рекомендуем делать это испытание на самом высоком FR, достигнутого во время обучения (FR2), когда ответы надежно высоки. После того, как прогностическая валидность устанавливается, модель может быть использована для оценки новых лекарственных средств-кандидатов.

1. Перед тем как день тестирования, дают крыс подкожной инъекции физиологического раствора за 30 мин до самоуправления сессий приучить их к инъекции в течение минимум двух последовательных сессий самоуправления или до реагирования на этанол не влияет на засоленных инъекций (определяется как без изменений больше, чем 15% в общем количестве наград, полученных в течение последних 2-х сеансов).
2. Растворите налтрексон в солевом растворе и доведения рН до достижения нейтральности, чтобы облегчить инъекции животным. Вводить препарат в объеме 1,0 мл / кг за 30 мин до сеанса, с помощью подкожного пути введения. Примечание: Литрратура обеспечивает хорошие доказательства для выбора дозы между диапазонами 0,1 - 1 мг / кг, так что 0,1, 0,3 и 1 мг / кг используются в данном протоколе.
   Примечание: Исследование показывает использование обоих подкожного и внутрибрюшинного путей введения налтрексона, хотя их эффективность может отличаться от подкожных инъекций равно 30 раз более сильным , что внутрибрюшинные инъекции ^15. По этой причине мы рекомендуем использовать подкожный путь , как использование этого маршрута для инъекций налтрексона была подтверждена и реплицируются различными лабораториями в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мг / кг ^12,15,16.
3. В течение дня испытания, инъекции крыс в сбалансированном / случайном порядке в конструкции между разными субъектами по одному из четырех Налтрексон дозирования циклов (0, 0,1, 0,3 и 1 мг / кг) за 30 мин до начала сессии самоуправления.
4. Между каждым дозирующим цикла, позволяют крыс к вымыванию препарат с минимумом двух последовательных сеансов самоуправления или пока не отвечать на запросыэтанол возвращается к исходному уровню. Примечание: В результате, в конце теста, у всех крыс были введены с каждой из четырех доз.
5. После этой фазы, выбрать наиболее эффективную дозу (1 мг / кг) и проверить действие налтрексона на мотивацию животных к употреблению алкоголя с помощью многопозиционного график соотношения (этап 2.12).

Результаты

На рисунке 1 показана репрезентативную поведение самоуправления operant- и наркотиков наивный Вистар (восемь различных когорт на сумму в общей сложности 239 крыс) , обучающихся по графику FR1 самовведению 20% этанола без воды лишения или сахарин / замиранием сахарозы...

Обсуждение

С помощью этого протокола, мы представляем новый метод для приобретения и поддержания стабильного устные самостоятельного введения 20% этанола у крыс, что, в отличие от классических моделей этанола самоуправления, не требует использования воды лишения, расширенного обучения доступа, и...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra Tall MDF Sound Attenuating Cubicle, Interior: 22"W x 22"H x 16"D	Med Associates Inc.	ENV-018MD
Extra Tall Modular Test Chamber with modified Top, Waste Pan and Photobeam	Med Associates Inc.	ENV-007CT-PH
Stainless Steel Grid Floor for Rat or Small Primate	Med Associates Inc.	ENV-005
Retractable Lever	Med Associates Inc.	ENV-112CM	2 by SA chambers
Stimulus Light, 1" White Lens, Mounted on Modular Panel	Med Associates Inc.	ENV-221M	2 by SA chambers
Dual Cup Liquid Receptacle with 18 ga Stainless Steel Pipes	Med Associates Inc.	ENV-200R3AM
Single Speed Syringe Pump, 3.33 rpm	Med Associates Inc.	PHM-100
Liquid Delivery Kit	Med Associates Inc.	PHM-122-18
SmartCtrl 8 Input / 16 Output Package	Med Associates Inc.	DIG-716P2
MED-PC software	Med Associates Inc.	SOF-735
http://www.mednr.com/	Med Associates Inc.		A website that is open-source and has been created to offer researchers a place to exchange MEDState Notation code
Kendall Monoject 20 cc Syringes, Regular Luer Tip	VWR International	MJ8881-520657
Ethanol, Pure, 190 Proof (95%), USP, KOPTEC	Decon Labs	2801
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	Hospira	0409-4888-50
Naltrexone hydrochloride	Sigma Aldrich	N3136-1G
23 G BD PrecisionGlide Needles	BD	305145
Minivette POCT 50 µL, K3EDTA	Sarstedt	17.2113.150	For capillary blood collection