JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

Аннотация

Эффективное иммунный ответ зависит от быстрой мобилизации лейкоцитов крови к месту инфекции или травмы. Исследуя миграцию лейкоцитов в естественных условиях имеет решающее значение для понимания молекулярной основы лейкоцитов трансэндотелиальной миграции и взаимодействия с сосудистого эндотелия. Один мощный подход предполагает прижизненный микроскопии на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках интерес.

Здесь мы приводим протокол для визуализации моноцитов и нейтрофилов в CX 3 CR1 GFP / мас мыши IV введенного с оранжевыми красителя помечены нейтрофилов с инверсной конфокальной микроскопии. Покадровой фильмы собрались от 30 мин до нескольких часов визуализации позволяют анализировать поведение лейкоцитов в брыжеечных вен под обеих стационарных и воспалительных состояний. Мы также описать шаги, чтобы побудить локально судно воспаление крови с TLR2 / TLR1 агониста Pam3SK4 и контролировать subsequeнт набор нейтрофилов и моноцитов.

Представленная методика может также использоваться для мониторинга других популяций лейкоцитов и исследовать молекулы, замешанных в лейкоцитов или торговли, используя другие стимулы или трансгенных мышей.

Введение

Нейтрофилов и моноцитов в клетки врожденной иммунной системы, которые непрерывно циркулируют в крови. После травмы или инфекции, воспалительные сигналы вызывают лейкоцитов диапедез в поврежденные и инфицированные ткани, в данном инициирования клеточного иммунного ответа 1-3. Быстрота мобилизации лейкоцитов определяет положительный результат иммунных реакций. Эти сложные процессы зависят от специфических молекул (например, Селектины, эндотелий-хемокинов связаны), присутствующих на воспаленной эндотелия, которые помогают для создания липких контактов между циркулирующих лейкоцитов и эндотелия 1-3 .Чтобы получить представление о молекулах, участвующих в лейкоцитарной кадровое каскада, важно, чтобы визуализировать кинетику набора клеток, а также отслеживать поведение каждой клеточной популяции /. Эффективным методом прижизненной микроскопии включает на трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки в клетках, представляющих интерес.

Содержание "> На сегодняшний день, несколько подходов с использованием прижизненной микроскопии были разработаны для изображения сосудистой 4,5. Например, визуализация уха дермы сосудистой или брыжеечных вен прижизненной конфокальной микроскопии был использован для определения поведения патрулирования мышиный Ly6C низких моноцитов и человека CD14 + CD16 тусклым моноциты на стороне просвета кровеносных сосудов в стационарных условиях 6-8. Сосудистая мышиная модель кремастер часто используется для наблюдения за поведением нейтрофилов или воспалительных Ly6C высоких моноцитов при воспалительных или ишемических состояний у трансгенных мышей. В том, что так, кремастер стимулируется с помощью внутримошоночной инъекции IL1β, CCL2, TNFβ или ФМЛФ. После 2-4 часов, затем ткани хирургическим выводили и проанализированы прижизненной конфокальной микроскопии 9-11.

Следующий протокол описывает метод мониторинга моноцитов и нейтрофилов в то же время с любымперевернутый флуоресцентной конфокальной микроскопии. Кроме того, наш метод подробно описано, как изображение и тот же сосуд раньше (стационарный режим) и после воспаления и, как следовать кинетики лейкоцитов. Для этой цели мы используем CX 3 CR1 GFP / вес мыши, чей моноциты экспрессируют EGFP, вводили IV с оранжевым красителем мышиных нейтрофилов помечены. С использованием инвертированного конфокальной микроскопии, можно (1) для отслеживания и анализа патрулирование Ly6C низкие моноциты в стационарных условиях и (2), чтобы следовать набору обоих моноцитов и нейтрофилов в том же сосуде после местного воспаления. Здесь мы создаем воспалительных заболеваний с помощью агониста TLR2 / TLR1 Pam3CSK4 12. Кроме того, такие изображения могут помочь определить роль специфических молекул, представляющих интерес в различных этапах лейкоцитов каскада если осуществляется на определенных нокаут-мышей, или в присутствии блокирующих антител 6,9,13.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры животных были проведены в соответствии с институциональной Комитетом по этике уходу за животными в Женеве, Швейцарии и кантона ветеринарии. Номер разрешения GE / 63/14.

1. Подготовка Единой клеточной суспензии из костного мозга

  1. Жертва мыши (8-12 недель) путем смещения шейных позвонков. Стерилизовать задние ноги с 70% этанола. Удалить кожу от задних ног.
  2. Рассеките из бедра мыши и большеберцовые кости и удалить ткань с ног с помощью скальпеля. Промыть ноги с 90% -ным этанолом и поместить в культуральную чашку, наполненную PBS.
  3. Под капот культуры, чистой ткани из бедра и большеберцовые кости с помощью скальпеля и отдельный на коленном суставе. Отрежьте конец каждого из костей.
  4. Флеш костного мозга от каждой кости с использованием 23G иглу и шприц 1 мл, наполненную подготовки среды (без фенолового красного DMEM / F12, 1% сыворотки крыс), в 50 мл винт трубы. Лишить клеточных агрегатов деликатно пассажей через пе 23GEdle и 1 мл шприца. Доведите общий объем до 25 мл препарата среде.
  5. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл красных кровяных клеток Лизис RBLC буфера (8,3 г NH 4 Cl, 1 г NaHCO 3, 1 мл ЭДТА (100 мМ), полное до 1 л дистиллированной водой, фильтруют 0,22 мкм) в 15 мл винт трубы. Выдержите 30 сек на льду.
  6. Добавить 10 мл препарата среды и центрифуги 250 мкг, 5 мин, 4 ° C. Удалите супернатант и ресуспендируют в 2 мл препарата среде.

2. нейтрофилов Обогащение негативный отбор

  1. Добавить 150 мкл мыши коктейль обогащения нейтрофилов (клеток изоляции комплект платформы, такие как EasySep). Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  2. Добавьте 10 мл фенола красного свободной DMEM. Инверсия раз и центрифуги 250 мкг, 3 мин, 4 ° С.
  3. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1,75 мл препарата среды в 5 мл полистирола с круглым дном пробирки. Добавить 250 мкл Биов коктейль Selection. Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  4. Vortex магнитных частиц (от платформы набор для выделения клеток) в течение 30 сек ресуспендировать частиц. Добавить 500 мкл магнитных частиц в суспензии клеток. Смешайте и инкубировать на льду в течение 10 мин.
  5. Поместите пробирку в магнит. Подождите 3 мин.
  6. Обратить магнит на новый 5 мл полистирола с круглым дном пробирки для сбора нужных немеченые клетки. Не принимайте последнюю каплю висит в трубке. Нежелательных клеток останется в трубке внутри магнита. Откажитесь эту трубку в биологической отходов.
  7. Поместите новую трубку в магнит. Подождите 3 мин.
  8. Обратить магнит на новый 15 мл винт трубы для сбора нужных немеченые клетки. Не принимайте последнюю каплю висит в трубке.
  9. Полный объем до 5 мл с фенолом красным свободного DMEM.

3. Маркировка нейтрофилов

  1. Добавить 0,5 мкл оранжевой краски, такие как сотовый Tracker Orange (работает концентрация1 мкМ, CMRA - хлорметил-rodol-ацетат, акции 10 мМ в ДМСО). Инкубируют 2 мин при 37 ° С.
  2. Добавить 2,5 мл препарата среде. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С.
  3. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл препарата среде в 1,5 мл пробирку.
  4. Возьмите аликвоту рассчитывать с гематоцитометр.
  5. Инкубируйте 5 минут при 37 ° С. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С.
  6. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 1 мл PBS. Центрифуга 250 мкг, 5 мин, 4 ° С, чтобы вымыть.
  7. Удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 10х10 6 клеток в 100 мкл PBS. Держите на льду до внутривенной инъекции. Примечание: клетки должны быть IV вводят как можно быстрее. 6-12x10 6 нейтрофилы / мышь обычно получают.

4. Подготовка Мышь прижизненной микроскопии

Примечание:.. Шаг 4,1) и 4,2) должны быть выполнены в начале эксперимента, чтобы избежать длительного времени ожидания меченых нейтрофилов на IC нае.

  1. Взвесьте CR1 GFP мышь CX 3 (8-12 недель).
  2. Подготовьте 800 мкл анестетиков (кетамин 60 мг / кг, 4,5 ксилазина мг / кг, acepromazone 1,75 мг / кг в PBS).
  3. Обезболить мыши. Инъекцией 200 мкл / 20 г мышь. Управление анестезия пальца щипать и проверки дыхания.
  4. Вводите нейтрофилов (10x10 6 ячеек в 100 мкл PBS) внутривенно, используя боковые вены хвоста или ретро-орбитальной пазухи, в удобное экспериментатора.
  5. Положите мышь на грелку и защищать глаза глазной гель.
  6. Стакан покровное (диаметр 35 мм) помещают в 10 см блюдо культуры ткани, которая имеет 30 мм отверстие диаметром. Использование масла для поддержания блюдо культуры ткани в контакте с покровным.
  7. Надрезать кожи живота с ножницами, чтобы разоблачить брюшины. Надрезать брюшины ножницами, чтобы разоблачить кишечник.
  8. Добавить 200 мкл PBS (предварительно нагревают при 37 ° С) в рeritoneal полости. Возьмите мышь в руке и поверните его лицом вниз, так что кишечник выходит из брюшной полости с нежным давлением. Наведите в культуре ткани блюдо.
  9. Аккуратно deroll кишечник с стерилизованных ватные палочки на покровное для того, чтобы разоблачить сосудов брыжейки.
  10. Вырезать бумажные салфетки в полосах и влажный их 37 ° C нагретого PBS. Остановите кишечник с кусочками бумажных салфеток, чтобы уменьшить движения, вытекающие из перистальтики.
  11. Поставьте блюдо культуры тканей и мышь внутри камеры 37 термостатируемом ° C на заказ стадии трее инвертированного микроскопа. Ввести шприц, содержащий анестетики подкожно в заднюю ногу. Примечание: Кроме того, мышь может получать кислород (0,5 л / мин) с маской.
  12. Управление мышь для анестезии палец щипать и проверки частоты дыхания каждые 30 мин. При необходимости, доставить заряд анестетиков (20 мкл), чтобы должным образом поддерживать анестезию. НЕЕ: Сушка сосудистой следует избегать. Таким образом, его влажность поддерживается регулярно смачивая бумажные салфетки, используемые для иммобилизации кишечника с 37 ° С-подогретое PBS.

5. Измерение нейтрофилов и моноцитов Поведение в воспаленных сосудов в Vivo помощью прижизненной микроскопии

  1. Набор лазеры 488- 561- и по самой низкой мощности, необходимой, чтобы избежать лазерного индуцированных фототоксичность. В наших экспериментах, это меньше, чем 0,5%. Интенсивность GFP в моноцитов и оранжевого красителя в нейтрофилов так ярко, что, как правило, 0,3% достаточно. Примечание: Это представляет собой мощность лазера 0,15 до 0,25 МВт с нашей системы.
  2. Получение изображений по 512 х 512 пикселей (т.е. 635 мкм) в 2,2 сек с открытым отверстием, используя 20X сухой цели инвертированного микроскопа. Используйте Z-глубину от 10 до 20 мкм, что обеспечивает устойчивый сигнал с низким лазерных полномочий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы обычно проводят эксперименты с г-глубине между 12 до 1656; м. В случае, представленных фигур и фильмы, Z-глубина 20 мкм. Фазового контраста позволяет идентифицировать эндотелиальных стен и изображений осуществляется на мезентериальных вен. Так, патрулирующие клетки перемещаются довольно медленно со скоростью 5-10 мкм / мин 6, записи поле интереса каждые 20 сек удовлетворительное. С описанных настроек, моторизованная этап позволяет записывать до 7 областях, представляющих интерес в то же время.
  3. Наведите и сосудов брыжейки в термостат камеры микроскопа позволит им оправиться от подготовки в течение 30 мин до приобретения первого фильма. В течение этого времени, выбрать несколько полей, представляющих интерес. Фокус на поверхности просвета сосуда, ближайшей к цели. При необходимости, воспользоваться небольшим автофлуоресценции эндотелия, чтобы установить фокус.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическое при подготовке мыши слегка подчеркивает эндотелий. Следовательно, прокатки нейтрофилов и/ или моноциты могут наблюдаться в первые 15 мин следующей подготовки мыши.
  4. Запишите первый фильм в течение 30 мин в стационарных условиях, одно изображение каждые 20 сек.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение приобретает каждое поле интереса 2.2 сек и моторизованный этап автоматически перемещается из одной области в другую. Она восходит к первой позиции в 20 сек в течение 30 мин записи фильма.
  5. Чтобы инициировать воспаление кровеносных сосудов, добавить каплю 20 мкл PBS, содержащего 100 мкг TLR2 / TLR1 агонистом Pam3CSK4 12 непосредственно на отображаемого сосудов.
  6. Управление фокус для каждой из сфер интересов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время приобретения, всегда есть небольшие изменения фокуса на оси. Несмотря Z-глубины 10-20 мкм, это может привести к снижению интенсивности флуоресценции. Таким образом, вручную переориентировать каждое поле интереса в конце каждого фильма, если это необходимо. Записывайте фильмы за 30 мин периодов и до 3 часов вТаль после начала воспаления.
  7. В конце эксперимента, пожертвовать наркозом мыши цервикальным сдвигом.

6. Формирование файлов фильмов и слежения лейкоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение Nikon приобретение генерирует .nd2 файлы, но следующая процедура будет похожа с другим программным обеспечением и брендов.

  1. Экспорт файлов в формате TIFF, как серии.
  2. Перейти к ПО ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj). Импорт серии TIFF. Каждый канал в другой файл.
  3. Нанесите медианный фильтр с радиусом 2.0 пикселя из за зеленого и красного каналов, чтобы уменьшить фоновый шум (процесс> Фильтры> Медиана ...).
  4. Преобразование файлов в двоичный (Process> Binary> Сделать Binary). Включение программного обеспечения для расчета порога для каждого изображения.
  5. Слияние каналов в одной серии изображений (Image> Color> Merge Channels ...). Выберите моноцитов в Greeп канала, нейтрофилы в красном канале и проходящего света в сером канале.
  6. Преобразование сложены изображений в RGB цвета (изображение> Цвет> Стек для RGB).
  7. Сохранить файл как .avi
  8. Данные импортируются и составлен в программном обеспечении Imaris (битовой плоскости). Движения моноцитов и нейтрофилов затем отслеживается с помощью мастера отслеживания пятна.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рукопись описывает оптимизированный протокол легко контролировать поведение моноцитов и нейтрофилов в брыжеечных вен наркозом мышей в режиме реального времени. Использование 37 ° C-термостатированный камеры является обязательным для поддержания температуры мыши, а также из-за завис?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Методологии, описанные в этой рукописи обеспечить последовательный подход, чтобы эффективно изучить моноцитов и нейтрофилов в поведение брыжеечных вен в стационарных и воспалительных состояний.

Решающим шагом в подготовке является иммобилизация кишечника с PBS, конта?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
5 ml polystyrene round bottom tubes Beckton Dickinson352058
10x CFI Plan Apochromat 0.45   DT:4mm Nikon
20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm Nikon
Cell Tracker Orange CMRA DyeLife TechnologiesC34551
EasySep MagnetStem Cell Technologies18000
EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kitStem Cell Technologies19762
EDTASigma AldrichE6758
FCSPAAA15-042
Immersion Oil Type ANikonany viscous oil 
Life Box Temperature Control SystemLife Imaging
NaHCO3Sigma AldrichS5761
NH4ClSigma AldrichA9434
Nikon A1R confocal microscopeNikonA1Rinverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software
PBSLife TechnologiesD8537
phenol red free DMEM/F12Life Technologies21041-025any phenol red free medium is suitable
PAM3CSK4Invivogentlrl-pmsreconstitute in PBS
Rat serumStem Cell Technologiesincluded in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit
Tissue culture dish 100TPP93100

Ссылки

  1. Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
  2. Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).
  3. Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41, 694-707 (2014).
  4. Ley, K., et al. Chapter 11. Intravital microscopic investigation of leukocyte interactions with the blood vessel wall. Methods Enzymol. 445, 255-279 (2008).
  5. Sperandio, M., Pickard, J., Unnikrishnan, S., Acton, S. T., Ley, K. Analysis of leukocyte rolling in vivo and in vitro. Methods Enzymol. 416, 346-371 (2006).
  6. Auffray, C., et al. Monitoring of blood vessels and tissues by a population of monocytes with patrolling behavior. Science. 317, 666-670 (2007).
  7. Cros, J., et al. Human CD14dim monocytes patrol and sense nucleic acids and viruses via TLR7 and TLR8 receptors. Immunity. 33, 375-386 (2010).
  8. Hanna, R. N., et al. The transcription factor NR4A1 (Nur77) controls bone marrow differentiation and the survival of Ly6C- monocytes. Nat Immunol. 12, 778-785 (2011).
  9. Woodfin, A., et al. The junctional adhesion molecule JAM-C regulates polarized transendothelial migration of neutrophils in vivo. Nat Immunol. 12, 761-769 (2011).
  10. Proebstl, D., et al. Pericytes support neutrophil subendothelial cell crawling and breaching of venular walls in vivo. J Exp Med. 209, 1219-1234 (2012).
  11. Wantha, S., et al. Neutrophil-derived cathelicidin promotes adhesion of classical monocytes. Circ Res. 112, 792-801 (2013).
  12. Ozinsky, A., et al. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 97, 13766-13771 (2000).
  13. Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498, 371-375 (2013).
  14. Carlin, L. M., et al. Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal. Cell. 153, 362-375 (2013).
  15. Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo. J Vis Exp. , (2015).
  16. Iqbal, A. J., et al. Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo. Blood. 124, e33-e44 (2014).
  17. Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PloS One. 6, e25109(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

105

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены