Последовательное извлечение растворимых и нерастворимых Альфа-синуклеина из Паркинсона Brains

Резюме

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

Аннотация

Альфа-синуклеина (α-син) белок в большом количестве экспрессируется, главным образом, в нейронах, и существует в нескольких различных форм - мономеров, тетрамеров, олигомеров и фибрилл. Во заболевания, α-син претерпевает конформационные изменения с образованием олигомеров и агрегатов высокие молекулярной массой, которые имеют тенденцию превращать протеин в более нерастворимые. Аномально агрегированный α-син является невропатологических особенностью болезни Паркинсона (БП), деменции с тельцами Леви (DLB) и множественной системной атрофии (MSA). Биохимический анализ характеристик и нерастворимых альфа-син, используя буферов с увеличением силы моющих средств и высокоскоростной ультрацентрифугированием обеспечивает мощный инструмент для определения развития α-син патологии, связанной с прогрессированием заболевания. Этот протокол описывает выделение более нерастворимого / агрегированной а-син из посмертного человеческого головного мозга ткани. Эта методика может быть адаптирована с изменениями в исследованиях нормального и аномального альфа-syn биологии в трансгенных животных, несущих моделей различных альфа-син мутации, а также в других нейродегенеративных заболеваний, которые показывают аберрантных фибриллярных отложений белков, связанных с их соответствующими патологий.

Введение

Одним из ключевых патологических особенностей общих среди нескольких нейродегенеративных заболеваний является формирование аномальных белковых агрегатов, что происходит в белок / болезни определенным образом ^1. Таким образом, есть характерные extraneuronal бета-амилоида бляшки и агрегированные гиперфосфорилированного депозиты тау внутри нейронов при болезни Альцгеймера (AD); агрегированные альфа-син депозиты в тельцами Леви (LB), которые внутринейрональную включений, а также в пределах дистрофических процессов нейронов, называемых Lewy невриты (LNS) в ПД, ПД деменции и деменции с тельцами Леви (DLBs) ^2-4. Аномальные альфа-син месторождения также видели в знаковых поражений глиальных цитоплазматических включений в MSA ^5. При болезни Гентингтона, есть характерные Поли-Q отложения, и обязательным ненормальным Тар ДНК белок-43 и сплавляют в саркомы белков (FUS) откладываются в лобно-височных деменций. Важно для PD, генные мутации α-син, как было установлено КауSE аутосомно-доминантное ПД ^6-11. Кроме того, α-син гена утроение ¹² и дублирование ^{13 также} вызывает семейной PD, таким образом, связывая повышенную экспрессию α-син в pathomechanisms БП. Примечательно, как спорадические случаи и семейные PD гавань аномальные вклады α-син патологии ^14. Текущие доступные методы лечения PD только паллиативная и не имеют никакого влияния на прекращение или замедление прогрессирования заболевания неумолимый.

α-син в большом количестве экспрессируется в мозге человека, и составляет около 1% от общего белка мозга. Он присутствует более конкретно в нейронах, но может существовать в более низких хотя количествах в глиальных клетках. Спорным моментом является нативной структуры альфа-син, который может существовать в виде случайного мономера ¹⁵ или сложенном тетрамера ^16. Во время болезни, α-син меняет свою конформацию, что позволяет ему получить неправильно упакованных и этот процесс считается причиной болезни pathogeНесис. Несмотря на несколько лет исследований в патофизиологических аспектов альфа-син и болезни, точные причины заболевания еще механизмы остаются неясными ^14.

Исследования с использованием посмертный анализ мозга Паркинсона до сих пор при условии, важные подсказки относительно нормальной и аномальной биологии α-син и в спорадических PD, а также PD связаны с мутациями в гене LRRK2 ^17-22. Здесь биохимический протокола экстракции (см схеме, представленной на рисунке 1) для более нерастворимых альфа-син депозитов человека посмертного PD мозговой ткани, которые укрывают α-син агрегатов в разной степени было описано. Эта методика также может быть приспособлена с изменениями в буферных композиций для изучения агрегатные белки из других нейродегенеративных заболеваний ^23,24, а также от трансгенного животного мозговой ткани ^25-27. Основное внимание на адаптации являются различия в solubiмируемости и общая сумма соответствующих белков, некоторые из которых, главным образом, ядерные и, возможно, потребуется высокой соли буферы для оптимальной экстракции, как показано на FUS ^28.

протокол

Посмертное ткани мозга были подарены королеве площади Brain Банка неврологических расстройств, Университетский колледж Лондона, Институт неврологии, используя этически утвержденные протоколы и хранятся для исследования основании лицензии, выданной органом человеческого тканей (ОМТ) Великобритания (нет. 12198). См перечень случаев, используемых для этого протокола (таблица 1).

1. Подготовка буферов

1. Подготовка 1X TBS (трис-буферный солевой раствор) буфер:
   1. Подготовка 10X TBS, как исходного раствора с 500 мМ Трис-HCl рН 7,4 и 1,500 мМ NaCl.
      1. Взвесить 60,5 г Трис-Cl рН 7,6 и 87,6 г NaCl в 800 мл воды высокой степени чистоты. Регулировка рН с помощью 1 М HCl и конечного объема запасов к 1 л
   2. Подготовка конечной концентрации 1X TBS путем разбавления фондовом в 10 раз дистиллированной водой.
   3. Добавить ингибиторы протеазы (ИП), (1 таблетка на 50 мл буфера) и Фос-стоп таблетки ингибитор фосфатазы (1 таблетка на 10 мл буфера) вотменить действие неспецифических ферментативных действий протеаз и фосфатаз.
      Примечание: Здесь мы использовали ингибитор фермента таблетки от Roche, но в равной степени других коммерчески доступных ингибиторов может быть использован в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
2. Подготовьте TBS-буфера SDS добавлением 5% вес / объем натрия додецилсульфат (SDS) в 1X TBS (рН 7,4) буфера. Раствор нагревают до 60 ° С при постоянном перемешивании с использованием магнитной мешалки, чтобы растворить SDS.
3. Подготовьте TBS-ДСН-буфера мочевины путем добавления мочевины до конечной концентрации 8 м / о, чтобы 1X TBS-буфера SDS (рН 7,4). Раствор нагревают до 60 ° С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, чтобы растворить мочевину.

2. Образец Гомогенизация и дифференциальные Ультрацентрифугирование

Примечание: следующая часть работы включает в себя обработку человека ткани головного мозга в соответствии с правилами HTA Великобритании. Местные стандартные операционные процедуры следуют на всех Tiмес. Образцы мозга расчленены из замороженных блоков мозга и тканей гомогенизировали материала в microcabinet поддерживается при отрицательном давлении. Одноразовые халаты, перчатки, маски для лица-Над-обуви протекторы и защитные очки носят в течение всей процедуры. Отходы человеческого тканевого отбрасывается после автоклавирования при 121 ° С в течение 20 мин для безопасной утилизации. Острые (скальпель лезвия) расположены в соответствующем контейнер для острых предметов для локализации и безопасной утилизации.

1. Возьмите кусок замороженного человеческого ткани (примерно 0,5 г в весе от базальных ганглиев области) и быстро пропустить через мясорубку на небольшие фрагменты (примерно 1 мм ²⁾ на льду с использованием небольшой чашке Петри и стерильный скальпель лезвием. Использование отдельного чашки Петри и скальпель лезвие для каждого образца. Сбор измельченной ткани в 15 мл пробирку и добавляют 10 объемов ледяной 1XTBS буфера в пробирку.
2. Однородный образцы с использованием механического гомогенизатора при 20000 оборотах в минуту в течение 10 сек. Охлаждают на льду в течение 2 мин. Повторите этот шаг три разас.
   Примечание: Это делается для того, что образцы не нагреваются в то время как гомогенизации.
3. Уточнить путем центрифугирования при 1000 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Отменить шарик негомогенизированном материала.
4. Возьмите супернатант (сырой гомогената), добавить в поликарбонатные центрифужные пробирки (размер трубы зависит от размера ротора) и баланс тщательно. Центрифуга при 100000 х г в течение 1 ч при 4 ° С.
5. Сохраните супернатант, как это ТБС-растворимой фракции.
6. Промыть гранул дважды в пяти объемах буфера 1X TBS и центрифуги каждый раз при 100000 х г в течение 15 мин при 4 ° С. Откажитесь от супернатантов.
   1. Ресуспендируют Конечный осадок обработкой ультразвуком осадок в течение 10 сек при 20 кГц приблизительно 5 объемов 1X TBS-SDS при комнатной температуре.
      Примечание: перед добавлением SDS содержащих образцов буфера должен быть доведен при 10 ° С, чтобы избежать SDS осадков.
   2. Ультрацентрифуга при 100000 х г в течение 30 мин при 25 ° С.
7. Сохранение супернатант, как это йе SDS растворимой фракции.
   1. Промыть осаждения два раза в 5 объемах 1X TBS-буфера SDS при комнатной температуре. Центрифуга каждый раз при 100000 х г в течение 15 мин при 25 ° С.
   2. Солюбилизации конечный осадок в 50 мкл 1X TBS-SDS-мочевину буфером с помощью ультразвукового установленный на 20 кГц в течение 10 секунд, чтобы достичь полного растворения; это называется растворимой фракции мочевины.
8. Анализе каждой фракции на общее содержание белка с использованием коммерческого набора для анализа белка в соответствии с протоколом производителя. Развести образцы TBS-ДСН-мочевины 1: 1 с буфером TBS 1X, чтобы позволить совместимость с белковым анализом реагентов. Образцы замерзнуть в небольших аликвот (20 мкл) при -80 ° С, чтобы уменьшить циклов замораживания-оттаивания.
   Примечание: Добавление 10% глицерина в образцах рекомендуется для длительного хранения при -80 ° С.

3. Иммуноблоттинг образцов и анализа результатов

1. Запуск образцы из TBS, TBS-SDS и TBS-SDS-мочевины экстрактов на 10-скважины 4-12% Бис-Трис полиакриламид гельс MOPS буфера, как работает с использованием стандартных методик. См Галлахер и Чакраварти (2008) ²⁹ для детального протокола вестерн-блот.
2. Нагрузка 10 мкг белка из каждого образца на каждой дорожке вместе с маркер молекулярной массы для TBS и SDS и фракций мочевины.
3. Запуск гель при 200 V в течение 1 часа или до синего красителя из загрузочного буфера достигает дна геля.
4. Передача белки из гелей электрофореза на нейлоновые мембраны ^28, предварительно смоченных сначала в 100% метаноле, а затем в передаче буфера, содержащего 20% метанола. Обеспечение опознавательный знак на блот, чтобы определить сторону белка и ориентацию маркеров размера молекулярной массы.
   1. Сэндвич гель с мембраной вместе влажной фильтровальной бумагой. Правильное расположение мембраны имеет решающее значение с мембраной между гелем и анодом. Выполнение передачи в течение 2 ч при 40 В.
   2. Макияж 1X PBS-Tween (1X PBS-T) буфер: растворить 1 таблетку PBS в 200 млводы с получением 0,01 М фосфатном буфере, 0,0027 М хлорида калия и хлорида 0,137 М натрий, рН 7,4.
   3. Блок мембраны в 5% -ном растворе БСА в 1X PBS-T в течение 30 мин при встряхивании при 70 оборотах в минуту. Это предотвращает неспецифического связывания первичного антитела к мембране.
5. Зонд белка блот 6 мл альфа-син первичное антитело Syn-1 (BD Biosciences; моноклональное антитело мыши) в соотношении 1: 750 разбавление (O / N при 4 ° С) с последующим серии промывок 1X PBS-T ( 3 х 5 мин каждый раз) ^28.
6. Инкубируйте блот с соответствующим HRP, конъюгированное вторичное антитело в масштабе 1: 2000 разбавление в течение 30 мин. Выполните серию промываний (3 х 5 мин каждый раз) с 1X PBS-T.
   1. Погружают блотов в расширенной раствора хемилюминесценции на 15 сек в темной комнате. Обложка пятна с пленкой и место Авторадиография фильмов против Промокните стороны белка в светонепроницаемый кассеты, чтобы захватить соответствующие сигналы (подходящих полос размер).
   2. Разработка Авторадиография фильмы в автоматическом разработчика.
      Примечание: Пятна также могут быть разработаны вручную с помощью проявитель и фиксаж из коммерческого источника в случае автоматизированная машина разработчик не доступны.
7. Инкубируйте Вестерн-блоттинг с 6 мл вестерн-блоттинга зачистки буфера в течение 10 мин с постоянном встряхивании лишить блот антитела сигнала альфа-син. Выполните шаги 3,43 через, чтобы, используя 3.6.2 бета-актина первичного антитела (мышиное моноклональное) в 1: 8000 разбавления.
8. Сканирование и преобразовывать окончательное изображение в изображение и измерить плотность Tiff с использованием NIH ImageJ для целей количественного (бесплатно загружаемое программное обеспечение).
   Примечание: Программное обеспечение позволяет читать плотностей относительной площади интереса (соответствующие полосы размер), и данные могут быть выражены либо в соотношении α-син плотности / бета-актина (ген дом по поддержанию) в качестве условных единиц или на свои собственные, когда ген дом хранение не действует (как в случае мочевины растворимых пробах).

Результаты

TBS, SDS и мочевины растворимых белков, извлеченные из базальных ганглиев в соответствии с протоколом, показанного на фиг.1 проводили на геле и иммуноблоттинг с син-1 мышиного моноклонального альфа-син первичным антителом. ТБ растворимые фракции отображается наличие мономерного альфа-син (~ 14 кДа видов) в ПД и контроля дел, рассмотренных (рис 2А). В SDS растворимые фракции также показал обильные мономерного альфа-син во всех трех подтипов изученных случаях, как показано в нижней блот экспозиции (рис 2С). Случаи PD также показали более высокую молекулярную массу (ММ) альфа-син видов, как видно на высоком блот экспозиции, которые, вероятно, будут олигомеры (рис 2С). Мочевины, растворимые фракции из БП случаях показали повышенные количества альфа-син мономеров, олигомеров и агрегированных видов по сравнению с контрольными дел. В неокортекса идиопатические случаи PD демонстрируют более высокие объемы AGGREG ованные α-син видов, в то время как лимбической случаи показывают промежуточные уровни нерастворимого альфа-син. Оба SDS и мочевины из фракции идиопатических случаев ПД продемонстрировать различные уровни усеченных альфа-син продукции на 12 кДа и 6 кДа, как описано ^20. В противоположность этому, случаи управления не показали нерастворимый или агрегированных альфа-син (рис 2E). Полу-количественные показатели плотности отражают количество LB нагрузки как categoriesd помощью α-син иммуногистохимии, демонстрирующий нерастворимый характер агрегированной а-син (рис 2B, 2D, 2F) в неокортекса и лимбической случаях ПД.

Рисунок 1. Принципиальная схема нерастворимого альфа порядке -syn экстракции.rget = "_blank"> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Типичные иммуноблоты альфа -syn уровнях от PD и контролировать человеческую ткань. TBS, SDS и мочевины растворимые фракции от базальных ганглиев (региона, который таит в α-син патологии в ЧР случаев) идиопатических случаев ПД и неврологических нормально (контроля) Мозги были проанализированы на наличие альфа-син, используя западную иммуноблот. 10 мкг белка наносили на каждую дорожку. В TBS фракции (А), в основном α-син мономеры присутствуют во всех случаях. В SDS фракции (C), некоторые олигомеры альфа-син видны вместе с мономерами преимущественно в PD ткани. В фракций мочевины (С), мономеров, олигомеров и агрегированной а-син переменно выражается в PD случаев рефлектиновг их соответствующие нагрузки LB. В неврологической нормальные контрольные образцы показывают наличие только небольших количеств мономера альфа-син. Пожалуйста, обратите внимание возможные продукты деградации альфа-син которые видны в некоторых случаев с высокой нагрузкой LB. Сплошная глава стрелка представляет мономерной формы альфа-син. Символ * возможно представляет собой C-терминально укороченная форма альфа-син, как описано ранее ^20,26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

случай	Секс	Возраст на момент смерти YRS	задержка посмертное (ч)	рН ткани
Неокортекса 1	М	82	40	6.3
Неокортекса 2	F	75	35,3	6.4
Лимбическая 1	М	81	28,5	6.2
Лимбическая 2	F	79	36,5	6.2
Контроль 1	М	80	38	6.1
Контроль 2	F	83	32,5	6.3

Таблица 1. Ограниченные демография случаев используются

Обсуждение

Эта статья описывает биохимический протокол для извлечения и экспертизы дифференциальных свойств растворимости мономерной, олигомерной и агрегатируется альфа-син из больных мозгов, используя денатурирующих гель работу. Это хорошо создана методика исследования агрегированный α-син ^{17, 18, ​​20, 21} белок, который, как правило, растворимы в своей родной форме, но получить амилоидогенных или повышенные свойства агрегации с прогрессированием заболевания или с генетическими мутациями. Тем не менее, некоторые группы используют небольшие изменения в концентрациях SDS в их буферах (8% или 10% вместо 5%) ^{21,22, 30.} ПБС анионный детергент и solubilises альфа-син олигомеров, которые могут включать мембраной формы α-син, в то время как мочевина, хаотропный реагент денатурирует нерастворимые агрегированные и фибриллярные или амилоидогенных формы альфа-син ^20. В связи с этим систематическое исследование Paleologou др ³¹ исследовали стабильностьальфа-син олигомеров и фибрилл с различными концентрациями мочевины (6,5 - 8 м) или SDS (0,25-2%) и сообщили, что олигомеры стабильные концентрации SDS, но не с высокой концентрацией мочевины. Их ФИЛА-1 антитела, специфичные для альфа-син олигомеров и фибрилл обнаружены высокие концентрации фибрилл в 6,5 М концентрации мочевины под неденатурирующих условиях. Концентрации буфера, используемого в этом протоколе близко отражает то, что было описано в Culvenor др. (1999) ^32.

Анатомические области мозга для биохимического извлечения нерастворимого альфа-син должны быть тщательно отобраны, и это должны отражать альфа-син LB и LN нагрузку в зависимости от прогрессирования заболевания ^33,34. Случаи, используемые здесь, базальные ганглии образцы из неокортекса и лимбической подтипов PD отражающих поздно, и промежуточные этапы PD прогрессии в соответствии с McKeith ctriteria ^34. В Queen Square мозга банка, одна половина мозгарегулярно фиксировали в формалине для гистохимических анализа, а другая половина тщательно расчлененный в различных анатомических областей и флэш-замораживали и хранили при -80 ^{° С} морозильников для дальнейших биохимических и ДНК исследований / анализа РНК. После фиксации формалином мозгов и рассечения невропатологи, иммуногистохимии осуществляется с помощью α-син антитела и результаты архив. Кроме того, как с помощью обычных методик, рН ткани мозга измеряется по прибытии в качестве меры агональном состояния мозговой ткани. Это формирует прочную основу для качества сохранности ткани для биохимического анализа.

Наши данные показывают, что здесь есть более SDS растворяется α-син мономера в ЧР случаях по сравнению с контроля; в частности неокортекса случаи PD имеет более высокую нагрузку α-син по сравнению с различными лимбической PD. В неокортекса случаи представляют большую прогрессирование БП α-син патологии в неокортекса регионах, таких как лобной и теменной Коррешеткам ^33,34. Лимбической случаи PD имеют более высокие баллы LB в базальных отделах переднего мозга / лимбической области таких областях, как миндалевидное тело, transentorhinal и поясной областей. Для содержательного данных и статистического анализа, нужно бежать по меньшей мере 4 случая из каждой группы. Точно так же мы не пытались статистический анализ данных, представленных здесь блот.

Он также должен отметить, что различные антитела могут распознавать различные формы / состав высшего порядка альфа-син олигомеров, и каждый может иметь свое собственное относительную чувствительность и предпочтения. Это видно из результатов Тонг и др. ^29, где они показывают, что 4 различных альфа-син антитела (син-1, СС, онко и LB509) дают сменные результаты, по крайней мере для альфа-син олигомеров / агрегатов. Мономеры α-син были признаны аналогичными степени всеми 4 антител, хотя они могут иметь вариации в зависимости от того, находится ли антитело эпитоп α-син либо в N-терминал или Cтерминальном ^29. Точно так же, специфические антитела для фосфо-синуклеина определить четкую высокого молекулярного веса α-синуклеиновых видов ^20,21. В методике, описанной здесь, высоко характеризуется антитела Syn-1 был использован _^19-21.

Тем не менее, важно учитывать проверки какие-либо новые антитела на Вестерн-блоттинга с помощью антител экспериментов предварительной абсорбции, а также сверхэкспрессии и нокдаун белка в клетках.

Это важно учитывать и другие варианты, которые были применены исследователями для определения небольших фрагментов альфа-син и нестабильные или тетрамерные альфа-син форм. Это может включать легкой фиксации мембраны с 0,4% PFA в PBS, чтобы сохранить усеченные формы альфа-син ³⁵ или лечения образца гомогената с сшиватели для стабилизации тетрамеров ^36.

Точная биохимическая оценка белков с использованием посмертный тиСГУП требует минимизации деградации белка ферментативный и модификации. Поэтому целесообразно использовать ткань с кратчайшие задержки посмертных и / или выберите подобранные образцы в случае когорт. Иммуногистохимия с использованием стандартных антител для α-син иммуногистохимии должны быть выполнены до начала протокола изоляции. Степень α-син патологии сильно варьирует и может меняться в зависимости от областей, выбранных. Желательно, чтобы выбрать участки с обильной патологии в качестве положительного контроля для оптимального выхода с каждого запуска. Применение ингибиторов протеазы и, если необходимо, ингибиторы фосфатазы для предотвращения нежелательного ферментативного расщепления после освобождения внутриклеточных протеаз или фосфатаз, возникающих в процессе лизиса клеток и поддержание пробы при 4 ° С имеет решающее значение.

Важно, что все образцы в пределах партии экспериментов обработаны равномерно и стабильно, чтобы избежать изменений внутри пользовательских; несколько FREСледует избегать циклов Эз-оттаивания, так как это может потенциально отказаться пост-трансляционные модификации, такие как фосфорилирование. Критическая точка иметь в виду при рассмотрении большого числа образцов, что данные иммуноблоттинга должны быть нормализованы к одному образцу, который должен работать параллельно с другими образцами всех на гелях и все данные, которые ссылаются на этот образец. Это делается для того, нормализация данных иммуноблота между несколькими пятнами. Этот метод принят в нашей недавнем исследовании ^22.

Следует отметить, что для того, чтобы сохранить фоновое ECL низким блоты не следует высыхать в любой момент во время протокола вестерн-блот. Кроме того, очень длинных выдержках (> 10 мин) на Авторадиография фильмов следует избегать, поскольку это приведет к насыщению сигнала ECL и приведет к неточному количественного определения.

Это выше протокол является относительно простым техника с использованием общих лабораторных реагентов и вструментов и может быть ценным инструментом для исследования патофизиологии α-син белка в PD исследований. Эта методика не может быть продлен только с соответствующими изменениями к изучению α-син биологии в альфа-син трансгенных животных, но и для других нейродегенеративных заболеваний, показывающих аномальные вклады агрегированных белков, таких как AD, MSA, DLB, HD и frontotemporaldementias. Однако данные Вестерн-блоттинга, описанные здесь, могут также быть подтверждено с помощью иммуноферментного анализа с использованием антитела к конкретным формам альфа-син ^31.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tris-HCL	Sigma	T5912
sodium chloride	VWR	27800.291
SDS	Fluka	71727
Urea	Sigma	U5378
Protease inhibitor tablets	Roche	04 693 116001
Phosphatase inhibitor tablets	Roche	04 906 837001
Phosphate buffered saline tablets	Sigma	P4417
Tween-20	Sigma	P9416
NuPAGE MOPS SDS running buffer	Invitrogen	NP0001
NuPAGE transfer buffer	Invitrogen	NP0006-1
Hybond-P membrane	GE Healthcare	RPN303F
Whatman 3MM filter paper	Sigma	WHA30306185
Bis-tris gels 4-12%	Invitrogen	NP0322BOX
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate	Pierce	34080
Bio-RAD DC protein assay kit	Bio-Rad	500-0112
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes	Beckman	355630
Western blot stripping buffer	Thermo scientific	46430
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal)	BD Biosciences	610786
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal	Sigma	A5441
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody	Santa Cruz	sc-2031
Bovine serum albumin	Sigma	A7030
Instrument	Company	Rotor/ model no
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max	Beckman	MLA-80
Sonicator	Heat Systems	XL20-20
Homogeniser	Jenke and Kunkel	TP18/10