JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

A protocol for the extraction and pre-concentration of estradiol from water samples by using an automated and miniaturized system is presented.

Аннотация

Новый метод для извлечения твердой фазы (SPE) в пробах окружающей среды, водных предлагается. Разработанная прототип является экономически эффективным и удобным, а также позволяет выполнять быстрый, простой и автоматизированной SPE. Предварительно концентрированный раствор совместим с помощью иммунологического анализа, с содержанием низкой органическом растворителе. Описан метод для извлечения и предварительной концентрации естественного гормона 17 -эстрадиола в пробах воды 100 мл. С обращенной фазой НПП выполняется с октадецил-кремнезема сорбента и элюирование проводится с 200 мкл метанола 50% об / об. Элюент разбавляют добавлением ди-воды, чтобы снизить количество метанола. После подготовки вручную столбец SPE, общая процедура выполняется автоматически в течение 1 часа. В конце процесса, концентрация эстрадиола измеряется с использованием коммерческого энзим-связанного иммунного-сорбента анализа (ELISA). 100-кратное предварительно концентрация достигается и содержание метанола в только 10% объем / объем. Полное восстановление молекулыдостигаются с 1 нг / л шипами образцы деионизированной и синтетические морской воды.

Введение

Подготовка образца является важным шагом в любом аналитическом процессе. В частности, удаление матричных эффектов, уменьшения помех, и обогащение аналита необходимы для получения точных результатов и достичь низких пределов обнаружения. Эндокринные нарушения соединения (СЭД) имеют особый интерес в связи с их действием на живые организмы, даже когда присутствующие на очень низких уровней в окружающей среде. Естественный гормон эстрадиол 17β-присутствует на загрязнение воды ЕС Наблюдать список и склонны быть добавлены в список приоритетных веществ, регулируемых в рамках Рамочной директивы Европейской Водной. Твердофазная экстракция (ТФЭ) обычно применяется для анализа малых загрязняющих веществ в воде, как с химической 1-5 (хроматографии, масс-спектрометрии) и иммунологических методов обнаружения 6-9. Последнее получила интерес в области мониторинга окружающей среды, а иммунологические доступны в большом разнообразии форматов, являются специфическими для ТАrget аналита, и достичь низких пределов обнаружения. 6, 7, 10, 11 Различные твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) являются коммерчески доступными и позволяют проанализировать несколько образцов сразу на нескольких луночный планшет. Процедура состоит в последовательных стадий, которые могут занять несколько часов. Конечный продукт реакции может быть обнаружено оптически для определения концентрации молекулы-мишени на основе калибровочной кривой.

Классические процедуры SPE включают сорбента предварительного кондиционирования, извлечение пробы, промывку, элюирование и концентрации путем выпаривания элюента. Растворитель, используемый для разбавления экстракта выбирают в зависимости от способа обнаружения. Для иммунологических методов, количество органических растворителей сильно влияет на чувствительность метода. 12

В дополнение к восстановлению и предварительно концентрации выступлений, метод также должен быть простым и экономически эффективным. Автоматизация procedurЕ помогает уменьшить количество ошибок человека, связанных с. В нашей предыдущей работе мы ввели 13 наш прототип автоматизированного SPE, и наш метод был применен к анализу естественного гормона 17 -эстрадиола в пробах морской воды. С помощью настоящего видео мы хотели бы подчеркнуть технические преимущества нашего метода по сравнению с традиционной офф-лайн и он-лайн SPE, и его совместимости с конкретной обнаружения по иммуно-реакции. Мы опишем протокол применяется к проб воды для определения 17 -эстрадиола. SPE осуществляется с октадецил-кремнезема (С18) фазы сорбента и элюирование осуществляется с помощью разбавленной метанола.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Следующий протокол описывает SPE выполнены на 100 мл воды образца с C18 сорбента и элюирование 50% об / об метанол. Обогащенный образец разбавляют, чтобы достичь 10% об / об метанол перед анализом с твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) комплект.

1. Подготовка реагентов

  1. Подготовка проб воды
    1. Перед любой другой стадии, фильтрации каждой выборки 100 мл воды с размером 0,2 мкм фильтров пор.
    2. Шип образца с требуемой концентрации разбавлением соответствующего объема раствора сравнения в объеме воды. Например, приготовить 100 мл пробы воды с 100 нг / л Е2 разбавлением 3,3 мкл контрольного раствора Е2 в концентрации 300 мкг / л. Развести это решение в десять раз, чтобы получить образец с шипами 10 нг / л Е2. Развести этот последний еще десять раз, чтобы получить выборку из 100 мл с 1 нг / л Е2.
    3. Поместите образец отфильтрованного (немодифицированного или шипами) в стеклянной бутылке с GL45 нить. Используйте образец в тот же день. Возьмем небольшую часть для анализа ELISA с оценить начальную концентрацию.
  2. Подготовьте 300 мкл элюента разбавлением метанола в деионизированной (ди) воды до 50% объем / объем в жесткой трубке.

2. Подготовка колонке SPE

  1. Подготовка 20 мг / мл суспензии октадецил-кремнезема частицы сорбента, добавив первые 1600 мкл метанола, а затем 400 мкл ди-вода до 40 мг сорбента с обращенной фазой. Плотно закрыть крышкой и агитировать с вихрем.
  2. Установка нижнюю мембрану в колонке
    1. Выберите один нейлоновую мембрану с размером пор 11 мкм и поместить его на двойной слой анти-пыль ткани. С диаметром 3 мм удар, вырезать две небольшие части в мембране.
    2. Возьмите одну из маленьких мембран с плоским конечных фильтров пинцетом и поместить его на одной стороне колонны.
    3. Винт с плоским дном разъем с трубкой и затяните. Мембрана нвл на месте, а сорбент может быть добавлен надежно. Draw стрелкой на корпусе, указывающей на колонке к концу, где мембрану помещали.
  3. Подготовка насадочной колонны сорбента
    1. Закрепите колонку на держателе с стрелкой в ​​направлении снизу. Колонка должна быть установлена ​​как вертикально, насколько это возможно.
    2. Приложить пустой 10 мл одноразовый шприц к концу трубки колонны, с помощью разъемов Луера.
    3. Подготовка микро-пипетки с наконечником в 20-200 мкл, установите громкость на 100 мкл. Этот формат наконечник пипетки приспособлен к размеру колонки сорбента, который будет подготовлен. Процедура будет сложнее с большими наконечники пипеток, таких как те, которые используются с 1 мл пипетки.
    4. Перемешивают сорбента суспензии с вихрем, и быстро пипетки 100 мкл в центре на колонке. При введении, аспирация аккуратно все пипетировали решение корыта мембрану с помощью шприца с другой стороны. В этом говозраст, раствор заполнение шприца должно быть ясно из частиц, а слой частиц в конечном итоге может наблюдаться в колонке.
    5. Повторите этот процесс еще 2 раза посредством перемешивания смеси суспензии между всеми шагами пипеток, чтобы обеспечить гомогенную суспензию частиц в растворе. Полученную столбец содержит 6 мг сорбента.
    6. Когда 300 мкл суспензии были загружены и сушат отсасыванием шприцем, держать шприц в положении, и поместить второй нейлоновую мембрану в верхней с помощью щипцов с другой стороны.
    7. Заверните второй разъем с трубкой и распоряжаться шприц. Колонка SPE готов к использованию.

3. Подготовка системы

  1. Затянуть колонку SPE на устройстве с помощью разъемов Луера. Стрелка должна указывать на ту же сторону, показанному на устройстве.
  2. Подключите бутылку, содержащую образец для устройства на закручиваниипри условии, GL45 защитный колпачок на нем.
  3. Загрузка 200 мкл элюента в резервуаре '' элюента.
  4. Нагрузка 800 мкл ди-вода в "разбавления" резервуара.
  5. Поместите бутылку на выходе отходов для сбора обработанной воды во время стадии экстракции. Формат не важен, но объем должен быть достаточно большим по отношению к объему пробы.
  6. Поместите маленький пузырек на выходе датчика с минимальным объемом мощностью 1,5 мл. Максимальный объем 1 мл будет слишком мал, как пузырьки образуют в этой розетке при сборе обогащенного элюент и буфер для разведения.
  7. Убедитесь, что регулятор давления находится в закрытом положении, повернув его вручную, обратный по часовой стрелке до тех пор, дальнейшее движение не возможно.

4. SPE с Prototype

  1. Переключение на прототипе, нажав на кнопку на задней.
  2. Подготовка пользовательский интерфейс и выбора программы
    1. Открыть пользовательский интерфейс. Выбратькоммуникационный порт на компьютере, к которому подключено устройство из списка, и нажмите кнопку «Далее».
    2. Введите значения для 580 PSET и 30 для dpset. Насос будет регулировать, чтобы поддерживать давление в системе под давлением и резервуаров 580 ± 30 мбар при запуске.
    3. Выберите автоматическом режиме.
    4. В автоматическом режиме угол, загрузите файл программы в «пути файла конфигурации" окно.
  3. Регулировка регулятора давления
    1. Запустите насос.
    2. Поверните вручную регулятор давления, пока значение читать пропитанного связующим веществом, не уступает, но близко к 320 мбар.
    3. Остановите насос.
  4. Запуск процедуры SPE
    1. Нажмите 'Start' в автоматизированном режиме углу. Насос включается и добыча, и элюции разведение шаги автоматически следуют одна за другой. Вся процедура для образца 100 мл выполняется в 50 мин.
    2. Проверьте значение пропитанного связующим веществом,. Она должна быть в диапазоне 320 - 350 мбар в течение стадии экстракции, чтобы обеспечить оптимальную скорость потока.
    3. Закройте маленький пузырек и хранить при 4-5 ° С в темноте до анализа. Выполнить анализ в следующей 30 часов, чтобы предотвратить деградацию вещества.
    4. Избавьтесь от обрабатываемой воды.
  5. Очистка системы
    Примечание: После каждой процедуры экстракции система должна быть очищена, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.
    1. Приготовьте 10 мл раствора метанола, 70% об / об в стеклянной бутылке GL 45.
    2. Отключите колонку SPE и подключить трубку с разъемами.
    3. В автоматическом режиме, выберите файл "Очистка" и начать его с теми же настройками давления.

5. Обнаружение эстрадиола концентрации с ELISA

  1. Подготовка калибровочных образцов с концентрацией, как указано в протоколе, снабженный набором ELISA, который используется. Подготовьте Calibraции устанавливается в такое же матрицы, что и образец, и один калибровочный набор с метанолом 10% об / об.
  2. Нанесите необходимое количество образца в лунки на тарелку, в соответствии с инструкциями изготовителя. Используйте калибровочные образцы, немодифицированные и шипами образцы воды, которые были отфильтрованы, но не обработанные SPE, и обогащенные образцы в метаноле 10% об / об. Использование 3 скважины на образец, чтобы уменьшить ошибку, связанную с анализом.
  3. Выполните указания на протокол, который снабжен комплектом для добавления реагентов, времени инкубации, промывки и дальнейшей реакции с ферментом.
  4. Read оптический сигнал в каждую лунку в соответствии с инструкциями изготовителя комплекта с помощью планшет-ридера инструмента и сбора данных.
  5. Использование программного обеспечения в планшет-ридере инструмента, чтобы соответствовать калибровочных кривых и определения концентрации E2 в исходном образце с той же матрицей, и в обогащенном метанолом образцы 10% об / об.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Воспроизводимость сорбента упаковки оценивали путем сушки и взвешивания пипеткой сорбента в стеклянных флаконах, и результат показан на рисунке 1. Воспроизводимость момент инъекции тестировали на образцах 100 мл, как показано на рисунке 2. Концентра?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Предложен новый способ получения проб воды с последующим анализом с помощью иммуноферментного анализа. Прибор позволяет выполнять извлечение твердой фазы в автоматизированном и удобный способ.

Фильтрация пробы воды до его введения в систему является критическим. Люб?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was funded by the European Union Seventh Framework Program FP7/2007-2013 under grant agreement no. 265721. The authors thank the RIKILT Institute for Food Safety (NL) for their support in this project.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Filter membrane 0.2 μm pore sizeMerck MilliporeGNWP04700For sample filtration
Nylon membrane 11 μm pore sizeMerck MilliporeNY1104700For SPE column
Disposable biopsy punch 5 mmMedical Budget39302439
Nucleodur C18 ec Macherey Nagel713550.0150 μm particle diameter
Synthetic sea waterSigma AldrichSSWS500-500ML
MethanolVWR
17beta-estradiol standardEnzo Life Science300 ng/ml
17beta-estradiol ELISA kitEnzo Life ScienceADI-900-00896 wells, range 30 - 3,000 ng/L

Ссылки

  1. Chang, H. S., Choo, K. H., Choi, S. J. The methods of identification, analysis and removal of endocrine disrupting compounds (EDCs) in water. J. Hazard. Matter. 172, 1-12 (2009).
  2. Azzouz, A., Souhail, B., Ballesteros, E. Continuous solid-phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry determination of pharmaceuticals and hormones in water samples. J. Chromatogr. A. 1217, 2956-2963 (2010).
  3. Tomsikova, H., Aufartova, J., Solich, P., Novakova, L. High sensitivity analysis of female-steroid hormones in environ-mental samples. Trends Anal. Chem. 34, 35-58 (2012).
  4. Ciofi, L., Fibbi, D., Chiuminatto, U., Coppini, E., Checchini, L., Del Bubba, M. Fully automated on-line solid phase extraction coupled to high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis at sub-ng/L levels of selected estrogens in surface water and wastewater. J. Chromatogr. A. 1283, 53-61 (2013).
  5. Robles-Molina, J., Lara-Ortega, F. J., Gilbert-Lopez, B., Garcia-Reyes, J. F., Molina-Diaz, A. Multi-residue method for the determination of over 400 priority and emerging pollutants in water and wastewater by solid-phase extraction and liquid chromatography-time-of-flight mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 1350, 30-43 (2014).
  6. Huang, C. H., Sedlak, D. L. Analysis of estrogenic hormones in municipal waste water effluent and surface water using enzyme-linked immunosorbent assay and gas chromatography/tandem mass spectrometry. Environ. Toxicol. Chem. 20, 133-139 (2001).
  7. Hintemann, T., Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. Field study using two immunoassays for the determination of estradiol and ethinylestradiol in the aquatic environment. Water Res. 40, 2287-2294 (2006).
  8. Farré, M., Kuster, M., Brix, R., Rubio, F., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Comparative study of an estradiol enzyme-linked immunosorbent assay kit, liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and ultra-performance liquid chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry for part-per-trillion analysis of estrogens in water samples. J. Chromatogr. A. 1160, 166-175 (2007).
  9. Pu, C., Wu, Y. F., Yang, H., Deng, A. P. Trace analysis of contraceptive drug levonorgestrel in waste water samples by a newly developed indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) coupled with solid phase extraction. Anal. Chim. Acta. 628, 73-79 (2008).
  10. Van Emon, J. M., Gerlach, C. L. A status report on field-portable immunoassay. Environ. Sci. Technol. 29 (7), 312A-317A (1995).
  11. Farré, M., Brix, R., Barcelò, D. Screening water for pollutants using biological techniques under European Union funding during the last 10 years. Trends Anal. Chem. 24 (6), 532-545 (2005).
  12. Schneider, C., Schöler, H. F., Schneider, R. J. A novel enzyme-linked immunosorbent assay for ethinylestradiol using a long-chain biotinylated EE2 derivative. Steroids. 69, 245-253 (2004).
  13. Heub, S., et al. Automated and portable solid phase extraction platform for immuno-detection of 17β-estradiol in water. J. Chrom. A. 1381, 22-28 (2015).
  14. Petrovic, M., Eljarrat, E., Lopez de Alda, M. J., Barcelo, D. Endocrine disrupting compounds and other merging contaminants in the environment: a new survey on new monitoring strategies and occurrence data. Anal. Bioanal. Chem. 378, 549-562 (2004).
  15. Richardson, S. D., Ternes, T. A. Water analysis: Emerging contaminants and current issues. Anal. Chem. 86, 2813-2848 (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

107

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены