Эффективное млекопитающих выражение клеток и Пошаговый Очистка внеклеточной гликопротеинов для кристаллизации

Резюме

This is a quick, cost-efficient protocol for the production of secreted, glycosylated mammalian proteins and subsequent single-step purification with sufficient yields of homogenous protein for X-ray crystallography and other biophysical studies.

Аннотация

Production of secreted mammalian proteins for structural and biophysical studies can be challenging, time intensive, and costly. Here described is a time and cost efficient protocol for secreted protein expression in mammalian cells and one step purification using nickel affinity chromatography. The system is based on large scale transient transfection of mammalian cells in suspension, which greatly decreases the time to produce protein, as it eliminates steps, such as developing expression viruses or generating stable expressing cell lines. This protocol utilizes cheap transfection agents, which can be easily made by simple chemical modification, or moderately priced transfection agents, which increase yield through increased transfection efficiency and decreased cytotoxicity. Careful monitoring and maintaining of media glucose levels increases protein yield. Controlling the maturation of native glycans at the expression step increases the final yield of properly folded and functional mammalian proteins, which are ideal properties to pursue X-ray crystallography. In some cases, single step purification produces protein of sufficient purity for crystallization, which is demonstrated here as an example case.

Введение

Понимание структуры белка на атомном уровне является ключевым для выявления молекулярной основы биологических путей и заболеваний. Рентгеновский белок кристаллографии наиболее широко используемый / применимым методом для определения макромолекулярных структур. Основная задача этого метода является получение достаточного количества правильно уложенного, чистого белка. Это становится проблемой, особенно при работе с секретируемых белков млекопитающих, которые подвергаются конкретные пост-трансляционных модификаций.

Бактериально-выраженные белки являются основным источником белков, нанесенных кристаллизовались в базе данных белковых ^1. Бактериальные системы экспрессии в значительной степени предпочтительны, поскольку они быстро, недорого и, как правило, высокие урожаи белка. Тем не менее, внеклеточные домены белков млекопитающих, выраженные в бактерий часто не правильно уложенный, в котором требуется случай повторной укладки и обширные очистки шаги для получения гомогенного FOlded белок. Кроме того, многие белки млекопитающих требуют посттрансляционную гликозилирование достичь правильное сворачивание ^2. Хотя выражение и гликозилирование в дрожжевых клетках насекомых или может преодолеть проблему складывания, после трансляционные модификации, в том числе гликозилирования, существенно отличаются от тех, клеток млекопитающих ^3, уступая белки с неправильными или неоднородных модификаций.

Клетки млекопитающих выразить всю необходимую молекулярные механизмы для обеспечения надлежащего пост-трансляционных модификаций и складывание; Однако, эти системы экспрессии обычно не предпочитают большинство лабораторий, в связи с ограниченными выходами и высокой стоимости реагентов и расходных материалов. Полиэтиленимин (PEI), стандартный трансфекции реагент является относительно дешевым, но накладывает значительный цитотоксичность и низкую эффективность трансфекции, в результате увеличения расходов в клеточной ДНК, СМИ, и культивирование оборудования. Многие альтернативы PEI являются непомерно дорогими. Мы обращаемсяэти проблемы, описывающая комбинацию улучшенных средств для культивирования клеток и химически модифицированные PEI для быстрого и относительно недорогого способа выражения секретируемых белков млекопитающих с последующей одной стадии очистки. Это надежный метод дает достаточные урожаи для функциональных и биохимических исследований ^4, а в некоторых случаях, приводит белка поддаются кристаллизации без дополнительной очистки.

Этот протокол описывает несколько методов, чтобы максимизировать выражение и выход для секретируемых белков млекопитающих в человеческих эмбриональных почек (НЕК) 293F клеток, выращенных в суспензии. Эффективность трансфекции (и стоимость), производство белка и очистку всех значительно усиливается после этого протокола. PEI модифицирован добавлением карбаматов путем одностадийного реакции с раскрытием кольца (PEI-ТМС-25, синтез и свойства описаны подробно в работе ⁵⁾ значительно улучшает эффективность трансфекции, снижает цитотоксичность от катионныхМембрана нарушение и, соответственно, снижает затраты на эксперимент. Кроме того, жизнеспособность клеток и экспрессию белка значительно улучшены с добавлением культуры добавки для снабжения глюкозы и витаминов. Важно для производства гликозилированных белков, лечение с kifunensine, нетоксичный химический ингибитор маннозидаза I, производит белки с определенными, незрелых гликанов, которые могут быть удалены с помощью эндогликозидазой EndoHf с получением белков с одним N-ацетилглюкозамина в месте полнометражный N-связан Glycan ^6. Наконец, секреция белков в бессывороточной, химически определенной среде позволяет быстро, и облегчает очистку для структурных и биохимических исследований. Пошаговый никель-нитрилотриуксусная кислота (Ni-NTA) очистки смолы удаляет большинство видов загрязнения в надосадочной жидкости и в некоторых случаях, может привести белок достаточной чистоты для кристаллизации.

протокол

1. Производство миллиграмм количества плазмидной ДНК для крупномасштабных переходных трансфекции

1. Клонирование интересующий белок в с высоким числом копий вектора экспрессии млекопитающих с использованием сайта рестрикции клонирования или другой подходящий метод.
   1. Для получения оптимальных результатов используйте pHLsec ⁷ вектор, который имеет встроенный С-концевой 6His-тега, сильный промотор последовательность Козака и оптимизированы сигнал секреции.
2. Преобразование плазмиды на компетентных клеток.
   1. Добавьте 20 мкл компетентных клетках E.coli на 1 мкг плазмидной ДНК и инкубируют на льду в течение 30 мин.
   2. Теплового шока клетки при 42 ° С в течение 35 сек, затем инкубируют на льду в течение 2 мин.
   3. Добавить 300 мкл ростовой среды микробной (SOC) и инкубируют при 37 ° С в течение 45 минут, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
   4. Пластина клеток на агар с соответствующим выбором антибиотика.
      1. Использование 100 мкг / мл карбенициллина если плазмида в векторе pHLsec,
3. Культура колонии в 250 мл бульона Луриа (LB), дополненной 100 мкг / мл антибиотика (карбенициллин) O / N при 37 ° С, встряхивая при 220 оборотах в минуту.
4. Очищают ДНК из культуры с помощью Привет-Speed ​​плазмиды Maxi Kit в соответствии с протоколом производителя.
   1. Элюции ДНК в буфере ЕВ (10 мМ Трис-Cl, рН 8,5), а буфера ТЕ.
   2. Алиготе очищенной плазмиды в количестве, необходимом для трансфекции и хранить при температуре -20 ° С.

2. Масштабная Культура и переходных Трансфекцию 293F клеток

1. Дополнение 1 л 293F носители с 10 мл глютамина и 5 мл ручка / Strep (как 100х). Хранить при 4 ° С. 5 мл ручка / Strep является достаточной прочности в бессывороточной условиях, и снижение концентрации антибиотика повышает жизнеспособность клеток в течение трансфекции, который повышает урожайность белка.
2. Культура 293F клетки в 300 мл среды в 1 л поликарбоната с толку колб Эрленмейера вентилируемой крышкой сс при 37 ° С с _8% CO 2, при встряхивании в стандартном инкубаторе тканевых культур.
3. Развести клетки до 5 ^× 10 5 / мл плотности за один день до трансфекции.
4. В день трансфекции, дополнение культуральной среды путем добавления 10% объема 2% вес / объем Cell Boost в 293F СМИ.
   1. Измерьте концентрацию глюкозы с помощью монитора глюкозы в соответствии с инструкциями изготовителя и использовать добавки, как необходимо для достижения концентрацией глюкозы 500 мг / дл.
5. Добавить kifunensine (1 мкг / мл конечная концентрация) на этом этапе контролировать гликозилирования белков.
6. Рассчитать объем ДНК, необходимые для мкг плазмиды 1 на 1 ^× 10 6 клеток. В стерильных условиях, разбавленной ДНК в 5 мл бессывороточной среды.
7. Рассчитать объем реагента для трансфекции, необходимых для 1 мкг плазмиды на 2 мкл реагента для трансфекции. В стерильных условиях, разбавленные реагента для трансфекции (PEI-ТМС-25) в 5 мл бессывороточной среды.
8. Добавитьтрансфекции реагента в раствор ДНК с шагом в 1 мл, смешивая мягко. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре реагент-ДНК комплексов с образованием. Затем добавьте раствор на клетках в каплям моды.
9. Разрешить трансфицированные клетки, чтобы выразить белка для 72-96 часов. Дополнение с ~ 10% объема Cell Boost СМИ ежедневно или по мере необходимости, чтобы держать глюкозы чтения 400-600 мг / дл.

3. Очистка

1. Декантировать культуру в центрифужную колбу, центрифуги в течение 20 мин при 1300 х г для осаждения клеток и затем собирают супернатант. При необходимости вращаться во второй раз, и / или использовать фильтр 0,22 мкм уточнить супернатант.
2. Добавить 10% объема 10x Ni-NTA связывания буфер (1,5 М NaCl, 0,5 МК ₂ HPO _4, 0,1 М Трис рН 8,5, 50 мМ имидазола).
3. Подготовка колонки тяжести добавлением 2 мл Ni-NTA суспензии в колонне и уравновешивания с 10 объемами колонки (CV) 1х буфере для связывания. Если это возможно, сделать все шаги столбцов в 4 ° C в помещении. АльтернативныеЭли, холод белка и все буферы на льду перед шагом колонны, и держать белок и собрал проточный на льду.
   Примечание: Ni-NTA суспензию 50% смолы по объему и указано связывающая способность производства составляет 50 мг / мл. Бусины Ni-NTA может быть повторно загружают для многократного использования
4. Поток супернатант через смолу и собирать проточные. Повторите этот шаг.
5. Промыть 10 CV промывочного буфера (300 мМ NaCl, 50 мМ К ₂ НРО _4, 20 мМ имидазола рН 8).
6. Элюируют белок в 5 CV буфера для элюции из (мМ NaCl 300, 50 мМ К ₂ НРО _4, 250 мМ имидазола рН 8).
7. Если дегликозилирование требуется:
   1. Для конечного объема 0,5 мл, концентрат элюат с 0,43 мл с помощью центрифугирования концентратор. Если образования осадка, гранул любой мусор центрифугированием при 16000 х г и 4 ° С.
   2. Добавить 50 мкл 500 мМ Na-цитрат, рН 5,5.
   3. Добавьте 20 мкл EndoHf (1 х 10 ⁶ ед / мл). Инкубируют при комнатной температуре в течение 2 часов.
      НеE: Фермент работает оптимальным образом при 37 ° С, что может привести к концентрированного белкового агрегировать. Продлить инкубацию RT, если дегликозилирование, оценивается SDS-PAGE или иммуноблоттинга является неполным. Фермент не обладают активностью при 4 ° С.
   4. Чтобы удалить EndoHf: Промыть 3 раза амилозы смолы в фосфатно-солевом буфере (PBS) или конечного буфера хранения. Инкубируйте белок с смолы в течение 1 ч при 4 ° С. Спин 5 мин при 1000 мкг в гранулах бусы, чтобы и собирать супернатант.
   5. Концентрат белка с использованием соответствующего молекулярного веса центрифугирования фильтр среза и буфер обмена в буфер хранения (150 мм NaCl и 20 мМ HEPES, рН 7,5).

Результаты

В этом следует результатов этого выражения системы, прилагаемой к домену, секретируемый иммуноглобулин 13 кДа (Ig) от человеческого белка рецептора запуска выраженной миелоидных клеток (2 hTREM2 остатки 19-132). TREM2 тип I трансмембранный белок, содержащий внеклеточный домен одного Ig, который им?...

Обсуждение

НЕК 293F клетки предлагают надежную продукцию белков, требующих пост-трансляционные модификации. Эта система позволяет быстро и масштабируемую выражение изначально свернутых белков, содержащих дисульфидов гликозилирования и фосфорилирования, что в противном случае будет отсутствова...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Culture Flasks	GeneMate	F-5909B
293 Freestyle Media	Gibco/Life Technologies	12338-018
GlutaMAX	Gibco/Life Technologies	35050-061	Use in place of Glutamine
Hype 5 transfection reagent	Oz Biosciences	HY01500
293fectin transfection reagent	Life Technologies	12347019
PEI transfection reagent	Sigma-Aldrich	408727
Maxiprep Kit	Qiagen	12162
Ni-NTA Superflow	Qiagen	30430
Endo Hf	NEB	P0703L
Amylose Resin	NEB	E8021S
Cell Boost R05.2	HyClone	SH30584.02	Cell Culture Supplement
GlucCell	CESCO Bioengineering	DG2032	Glucose Monitoring System
Opti-MEM	Life Technologies	519850.91	Serum Free Medium for DNA transfection
Luria Broth (LB Media)	Life Technologies	10855-001
GC10 Competent Cells	Sigma-Aldrich	G2919