Завесой Колонка: Оптимизация эффективности и чувствительности

Резюме

Here, we present a protocol for the operation and optimization of Active Flow Technology (AFT) column in Curtain flow (CF) mode for enhanced separation performance.

Аннотация

Active Flow Technology (AFT) is a form of column technology that increases the separation performance of a HPLC column through the use of a specially purpose built multiport end-fitting(s). Curtain Flow (CF) columns belong to the AFT suite of columns, specifically the CF column is designed so that the sample is injected into the radial central region of the bed and a curtain flow of mobile phase surrounding the injection of solute prevents the radial dispersion of the sample to the wall. The column functions as an 'infinite diameter' column. The purpose of the design is to overcome the radial heterogeneity of the column bed, and at the same time maximize the sample load into the radial central region of the column bed, which serves to increase detection sensitivity. The protocol described herein outlines the system and CF column set up and the tuning process for an optimized infinite diameter 'virtual' column.

Введение

В последние годы технология колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) значительно продвинулся вперед; пиковые мощности значительно увеличились во многом благодаря использованию меньшего размера частиц и более эффективных частиц ядра оболочки. Поскольку разделений , как правило , более эффективны, поток-на эффект наблюдается увеличение чувствительности , так как пики теперь острее и , следовательно , выше ^1-8.

Тем не менее, радиальная кровать гетерогенность по-прежнему является ограничивающим фактором при выполнении всех столбцов, но это не новая история, так как хроматографы знали это в течение многих лет. Колонка кровати неоднородны как в радиальном направлении ^9-12, а вдоль колонны оси ^10,12-15. Стенка эффект особенно является важным фактором , способствующим утрате ^7,16-18 эффективности разделения. Shalliker и Ритчи ⁷ недавно рассмотрели аспекты колонки кровати неоднородности и , следовательно , это не обязательно должен быть discussed здесь дальше. Несмотря на то, достаточно сказать, что, что изменение в колонке плотности кровати упаковки и эффекты стены приводят к искажению растворенного вещества пробки, таким образом, что полосы элюирования через колонку в пробках , которые напоминают частично заполненных миски , а не тонких плоских твердых дисков ^7, которые обычно изображается в основных текстах обучения. Когда эксперименты были проведены таким образом, что растворенное вещество миграции через слой может быть визуализированы штепсельные профили внутри колонны были частично полым и секция хвостохранилища группы в значительной степени стена компонент образца пробки. Конечным результатом является то, что она занимает гораздо больше пластин , чтобы отделить эти «частично полые» пробки , чем требовалось бы , если диски были твердыми и плоскими ^12,14,17. Для преодоления полосы уширения вопросов , связанных с настенными эффектов и изменения радиальной плотности упаковки, новая форма технологии колонки известной как технологии активного потока (AFT) был разработан ^7,19. Цель этой конструкции былочтобы удалить стенные эффекты через физическое разделение элюирующего растворителя вдоль области стенки, от подвижной фазы при элюировании в радиальном центральной части колонны ^19. Есть два основных типа AFT колонн; Параллельные сегментированные Flow (PSF) колонны и занавес Flow (CF) колонки ^7. Поскольку этот протокол направлен на использование и оптимизации колонн CF, PSF столбцы не будут обсуждаться.

Завесой (CF)

Завесой (CF) форматы колонки используют AFT концевые фитинги на обоих входе и выходе из колонки. AFT концевые фитинги состоят из кольцевого фритты, расположенной внутри мультипортовой штуцером. Фритты состоит из трех частей: пористый радиальную центральную часть, выровненную с центральным портом концевой заделки, пористой внешней части, которая совмещена с периферийным портом (ами) концевой заделки и непроницаемым кольцом, разделяет две пористые участки, предотвращающие любые крест-Flow между радиальными центральных и внешних областях фритты ^19. Рисунок 1 иллюстрирует конструкцию AFT фритту и рисунке 2 показан формат столбца CF. В этом режиме работы (CF) образец впрыскивается в радиальном центральный порт входного патрубка, в то время как дополнительный подвижной фазы вводится через периферическую порт входа к «занавесом» миграции растворенных веществ через радиальный центральной области колонка. Следовательно, образец поступает в слой в радиальном центральной зоне колонны с внешней области колонны, имеющей состав подвижной фазы передается только через него. Исследования показали , что объемное отношение скорости потока около 40:60 (центральный: периферийный порт) для входного конца облегающие колонки 4,6 мм внутренний диаметр (ID) оптимальна ^6,7,16. AFT выходе из колонки CF позволяет регулировать центральной и периферической потока их относительной части и может изменяться почти любой желаемой ратиO через управление давлением. Оптимизация колонки CF может значительно улучшить различные функциональные аспекты технологии колонки, такие как эффективность разделения или чувствительности обнаружения. Таким образом , а 'стена-меньше "," бесконечномерным диаметр "или" виртуальной "столбец устанавливается ^6,10,18,20. Целью колонн CF является активно управлять миграцией образца через колонку, чтобы предотвратить образца от проникновения в область стенки. Таким образом, концентрация растворенного вещества при выходе на детектор максимизируется, повышающий чувствительность примерно в 2,5 раза больше , чем в обычном формате колонки при использовании ультрафиолетового (УФ) обнаружения ^16, и еще больше при использовании масс - спектрометрического обнаружения ^6.

Столбцы CF идеально подходят для низких образцов концентрации, так как чувствительность обнаружения увеличивается. Кроме того, они идеально подходят в сочетании с скорость потока ограниченных детекторов, таких как масс - спектрометр (MS) ^6.FT колонке в формате Идентификатор 4,6 мм, например, может быть настроен, чтобы поставить один и тот же объем растворителя к детектору в качестве стандартного 2,1 мм колонки формата ID при работе при тех же линейных скоростей, путем регулировки выхода центрального потока до 21%. Точно так же в кормовой части колонна также может быть настроен, чтобы поставить ту же нагрузку объема на детектор в качестве столбца Идентификатор 3,0 мм, путем регулировки выхода из центрального потока до 43%. На самом деле любой "виртуальной" формат столбца может быть получен в соответствии с аналитическим требование ^6,18,22. С помощью этих специально разработанные концевые фитинги на входе и на выходе гарантирует, что истинная стенка менее колонна установлена.

Есть два способа установки растворителя систему доставки в центральных и периферийных портов на входе:. Системы ⁶ сплит-потока и два насоса системы ^6,7 Рисунок 3 иллюстрирует каждый из этих ИБП множество системных CF.

Сплит - система потока

яна системы с разделенным потоком (рис 3А) поток насоса приводит к инжектору расщепляется предварительно инжектор с использованием нулевого мертвого объема тройник, где один поток поток подвижной фазы соединен с инжектором, который затем соединяли с центральный порт впускного конца закрывающейся колонны. Второй поток поток подвижной фазы перепускных каналов инжектора и соединен с периферийным портом на входе колонки. Во время разделения потока, процент потока потока доводят до 40:60 ( в центре: периферические) до того , как линии подключены к колонке, т.е. от инжектора до центра и насоса к периферийным.

Система Два насоса

Столбец CF требует двух потоков потока на входном конце закрывающейся колонны. В зависимости от типа автоматического пробоотборника / инжекторе ВЭЖХ приборов, сплит-капельнице вверх может оказаться невозможным, и поэтому CF может затем быть достигнуто с помощью 2 -х насосов (фигура 3В ²¹⁾, Каждый насос выделяется и соединен либо с центральной или периферической порта и скорость потока устанавливается на составляет 40% от потока для центрального порта и 60% для периферийного порта. Например, если общая скорость потока 1,0 мл мин ^-1, центральный расход насоса устанавливается на 0,4 мл мин ^-1 и периферийная насос установлен на 0,6 мл мин - ^1.

Выбор режима работы, который в значительной степени зависит от ВЭЖХ-измерительных приборов и хроматографического режиме работы. Например, в некоторых автоматических пробоотборников изменение давления между положением нагрузки образца и образца впрыснуть положение может произойти срыв отношение разделения потока и, следовательно, в этом случае сдвоенный насос установить будет рекомендовано для обеспечения оптимальной производительности CF. Независимо от растворителя системы доставки, созданной выбранной для входного отверстия колонны CF, оптимизация на выходе CF остается тем же самым. Выпускная центральный порт колонны CF прикреплен к детектору видимой области ультрафиолетового (УФ-Вид) с помощью SmaIчтобы объем возможной насосно-компрессорных труб, чтобы свести к минимуму последствия после колонки мертвого объема. Так, CF столбцы эмулировать узок туннелем колонны, мертвый объем между выходе из колонки и детектора отрицательно сказывается на эффективности разделения колонны CF. Крайне важно, чтобы обеспечить наименьшее количество объема трубопровода между центральным отверстием и UV-VIS детектора, чтобы свести к минимуму влияние мертвого объема, таких как полосы расширения, потери эффективности и чувствительности. Следовательно, использование узкого внутреннего диаметра трубки (0,1 мм ID) рекомендуется легко разрешить корректировки давления без добавления нежелательного мертвого объема. НКТ также прилагается к периферийному порту и направляется в отходы. При выходе из колонки CF, коэффициент сегментации может быть отрегулирован на любом соотношении, которое соответствует цели аналитика. Когда CF ID 4,6 мм используется, например, часто бывает удобно установить соотношение либо как 43:57 или 21:79 (в центре): периферическая эмулировать 'виртуальную' 3,0 мм колонки удостоверения личности или 2,1 мм столбец ID,С уважением. Таким образом, производительность сепарации легко скамейка обозначенным. Отношение сегментации измеряется путем взвешивания количества потока, выходящего из детектора, который подключен к центральному порту и потока выходящего из периферийного порта в течение периода времени. Процент потока через каждый из портов, то можно определить и соотношения можно регулировать путем изменения длины трубки, присоединенные или с помощью трубки, которая имеет различный внутренний диаметр (ID).

Это видео протокол подробно описываются процедуры эксплуатации и оптимизации колонки CF для расширения хроматографического производительности.

протокол

Внимание: Пожалуйста , обратитесь к паспорте безопасности (MSDS) для всех материалов и реагентов перед использованием (т.е. паспорт безопасности для метанола). Обеспечивать использование всех соответствующих правил безопасности при работе с растворителями и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) элюент. Обеспечить надлежащее использование технических средств контроля ВЭЖХ, аналитического баланса и детектора измерительных приборов, а также обеспечить использование средств индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, полные штаны длины, и закрытую обувь).

Примечание: Этот протокол содержит инструкции о том, как использовать столбец CF в системе ВЭЖХ в сочетании с УФ-детектором-Вис. Протокол был написан в предположении читатель имеет базовые знания и опыт в области хроматографии.

1. Настройка инструмента высокоэффективной жидкостной хроматографии

Примечание: Этот раздел может быть изменен в соответствии с потребностями аналитиков, т.е. выбор растворителей, длина волны детектора и скорости потока , чтоподходят к образцу интереса.

1. Подготовка ВЭЖХ - прибор с 100% сверхчистой воды (например, Milli-Q воды) для линии А и 100% метанола для линии В качестве подвижной фазы и произвести чистку насосов согласно требованию производителя.
2. Установите детектор UV-VIS до 254 нм.
3. Выберите либо разделенный поток режим предварительного впрыска установка, или двойной подачи насоса настройки. Для режима разделенного потока перейдите к шагу 2 для работы в режиме двойного насоса перейдите к шагу 3.

Настройка системы 2. Разделение потока

1. Отсоедините линию насоса от инжектора клапана автоматического пробоотборника.
2. Прикрепите тройник к линии насоса.
3. Прикрепите 15 см кусок трубы 0,13 мм идентификатора для каждого порта тройника.
4. Подключите одну трубку от тройника к инжектору клапан автоматического пробоотборника.
5. Установите насос до 1,0 мл мин ^-1.
6. Перед подключением линии насоса к впускному отверстию колонны УТС, мелодией соотношение сегментации потока до 40%: 6 0% (центральная линия: периферийная линия) следующим образом в шаге 2.7.
7. Настройка коэффициента впуска CF по системе разделенного потока
   1. Измерьте массу двух пустых сосудов сбора с использованием аналитических весов и маркировать один сборный резервуар центральный и другой периферийный (один для линии от автоматического пробоотборника к центру порта и один для линии от тройника к периферийному порту) ,
   2. В течение 1,0 мин, собирают выход щего подвижной фазы от линии, поступающей из инжектора (в точке, который будет подключен к колонне) в накопительную емкость, масса которой была измерена в 2.7.1.
   3. Повторное взвешивание сборный резервуар на аналитическом масштабе и определить массу подвижной фазы, собранной.
   4. Повторите шаги 2.7.2 на 2.7.3 для элюента, покидающего линию от тройника, который должен быть подключен к периферийному порту.
   5. Определить процент потока (мл мин ^-1) от каждой линии потока в соответствии со следующими уравнениями:
      1 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 53471 / 53471eq1.jpg "/>
   6. Отрегулируйте коэффициент расхода до 40%: 60% (± 2%) (линия от инжектора до центрального порта: линии от тройника к периферийному порту). Если линия от инжектора к проценту центрального потока порта превышает 40%, увеличение перепада давления за счет уменьшения внутреннего диаметра трубы, или увеличение его длины. Если линия от инжектора к проценту центрального потока порта составляет менее 40%, увеличение внутреннего диаметра трубы или уменьшить длину трубки.
   7. После того, как отношения потока настроены повернуть насос стекать.
   8. Подключите линию от инжектора к центральному отверстию впускного отверстия колонны и линии от тройника к периферийному порту впускного отверстия колонны.
   9. Медленно сползать скорость потока до 1,0 мл мин ^-1 при 100% линии В.
   10. Уравновешивают колонку (4,6 мм Длина ID х 100 мм), позволяя100% -ном растворе метанола (линия В) , подвижная фаза протекает через колонку со скоростью 1,0 мл мин ^-1 в течение 10 мин. На этот раз масштабируется в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
   11. Для настройки выходного отверстия CF перейдите к шагу 4. 'подстройка CF потока на выходе ".

3. Настройка системы двух насосов

1. Подключение системы ВЭЖХ насоса к форсунке, а затем подключить линию от инжектора до центрального впускного отверстия колонны.
2. Подключение дополнительного насоса непосредственно к впускному периферийного порта колонны. Обратите внимание, что этот второй насос обходит инжектор.
3. Рампа скорость потока системы насоса , прикрепленного к центральному порту до 0,4 мл мин ^-1 (представитель 40% от общей скорости потока 1,0 мл мин ^-1) при 100% -ном растворе метанола (линия В).
4. В то же время , как на стадии 3.3, сползать скорость потока периферийного насоса до 0,6 мл мин ^-1 (представитель 60% от общей скорости потока1,0 мл мин ^-1) при 100% -ном растворе метанола (линия В).
5. Равновесие колонку (4,6 мм Длина ID х 100 мм), позволяя 100% -ном растворе метанола (линия В) подвижной фазы протекать через колонку со скоростью 1,0 мл мин ^-1 в течение 10 мин. На этот раз масштабируется в соответствии с размерами других столбцов пользователь может прибегнуть.
6. Для настройки выходного отверстия CF перейдите к шагу 4. 'подстройка CF потока на выходе ".

4. Настройка CF выходе потока

1. Подключите центральный выпускной канал для UV-VIS детектора с использованием 15 см кусок трубы 0,13 мм идентификатора.
2. Подключение 15 см кусок трубы идентификатора 0,13 мм к периферийному выходному отверстию колонны CF.
3. Взвесьте массы двух пустых сосудов сбора на аналитических весах и маркировать одно судно центральной и другого периферийного оборудования.
4. В течение 1,0 мин, собирают выход щего подвижной фазы от UV-VIS детектора (центрального потока) в ярлыке сосуд для сбора центральной, масса которого была измерена в 4.2.
5. Повторное взвешивание сборный резервуар, содержащий собранный элюент на аналитическом уровне и определить массу подвижной фазы, собранной.
6. Повторите шаги 4.4 до 4.5 для элюента, покидающего линию от порта периферийного выпускного.
7. Определить процент потока от каждой линии потока в соответствии со следующими уравнениями:
   
8. Отрегулируйте соотношение потока до 21%: 79% (± 2%) (центральный поток на выходе из УФ-Vis: периферический поток на выходе из линии). Если центральный процент потока от УФ-Vis находится выше 21%, увеличение перепада давления за счет уменьшения внутреннего диаметра трубки, присоединенные к выходу из UV-VIS детектора, или увеличение его длины. Если центральный процент потока от УФ-Вис находится ниже 21%, увеличение внутреннего диаметра трубки, присоединенные к выходу из UV-VIS детектора, или уменьшить длину трубки. Каждый раз, когда длина трубки была изменена, повторшаги 4.3 до 4.7.
   Примечание: В столбце CF в режиме 'виртуального' 2,1 мм внутр готова к анализу.

Результаты

AFT колонны были разработаны с использованием специализированной конструкции фриттиванного (рисунок 1) в колонке мультипортовый концевой арматурой , чтобы преодолеть кровать гетерогенность колонки и повышения эффективности разделения. Межлабораторная иссл...

Обсуждение

Это исследование включало в межлабораторный анализ хроматографических колонок CF, чтобы проверить аналитические показатели с точки зрения эффективности и чувствительности. Колонна CF была создана с двойной насосной системы, как описано в разделе «3. Двойная насосная система создана '...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HPLC instrument
Additional Pump			Required if 2 pump CF system set up is to be used.
Curtain Flow HPLC column	Thermo Fisher Scientific	Not Defined	Soon to be commercialized
Methanol	Any brand		HPLC Grade
PEEK tubing	Any brand		Various lengths and i.d.
PEEK tube cutter	Any brand
Analytical Scale Balance	Any brand
Stop watch	Any brand
Eluent collection vessels	Any brand		1-2 ml sample vials can be used as eluent collection vessels
T-piece	Any brand