Верхушечный резекция мыши моделью для изучения раннего млекопитающих сердце Регенерация

Резюме

A step-by-step video protocol of apical resection is demonstrated in this study. Apical resection is a recently highlighted surgical approach in mammalian heart regeneration research. This study may promote the application of apical resection as a standard methodology in research into the mechanism underlying heart regeneration.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания язвы весь мир из-за интенсивных изменений образа жизни. Регенерации сердца имеет большие перспективы для ремонта и восстановления кардиомиоцитов, утраченных в результате травм и болезней. В отличие от прочной сердечной регенерации некоторых низших позвоночных, млекопитающих взрослые сердца обычно показывают минимальное способность к регенерации и ремонта сердца. Тем не менее, недавние исследования вызвали значительный научный интерес с выводом, что, между послеродовой день с 1 по 7 (P1 Р7), неонатальный сердце мыши сохраняет значительную регенеративный потенциал после апикальной резекции (т.е. хирургического ампутации и воздействия левого желудочка вершине). Одним из основных противоречия по этому нахождения может быть связано с разнообразными процедурами хирургии, связанных используемых в усилиях по распространению или расширения на этом важном открытии. Эти инструкции динамически представить материалы и методологии для апикальной резекции в модели мыши. Характерные шаги этого грызуна SURVIVAл хирургии включают гипотермию анестезии, торакотомия, хирургическое ампутации сердце желудочка вершине, и шов и восстановление мышей. Описанный подход может расширить применение апикальной резекции мышиной модели сердечно-сосудистой исследований.

Введение

Prolonged human life span leads to various aging- and lifestyle-related diseases, including heart failure, a leading cause of mortality. However, without replacement of lost or dysfunctional cardiac muscle cells, current therapeutics can only transiently improve cardiac function^{1, 2}. Thus, it is necessary to discover and develop innovative strategies for cardiac regeneration and repair. The adult mammalian heart has limited regenerative potential. Studies from lower vertebrates, such as urodele amphibians and teleost fish, have provided unprecedented insights into the molecular and cellular mechanisms underlying heart regeneration^{3, 4}. Recently, a neonatal mouse model of heart regeneration has emerged that might enable identification and characterization of more evolutionarily conserved pathophysiological events required for human heart regeneration⁵.

Apical resection refers to the surgical removal of left ventricular apex. This procedure is restricted to 1- to 7-day-old (P1 to P7) mice due to its high lethality in older mice⁶. The cardiac regeneration process in neonatal mice after apical resection is expected to be as follows: (I) rapid and effective formation of a hematoma to seal the apex and prevent exsanguination; (II) cardiomyocyte regeneration and restoration of systolic function^{5, 7}. Recent work has stimulated debate on the significance and efficiency of this model^8-11. Thus, it is important to present the apical resection clearly and in detail. To this end, this protocol vividly and specifically describes a video of how I did apical resection based on a previous protocol⁶.

Understanding the molecular mechanisms underlying cardiac regeneration is of importance for treatment of heart disease characterized by loss and/or injured cardiomyocytes, such as heart failure^{1, 2}. Given the current and promising progress of apical resection in the research of cardiac regeneration, this study could promote the use of this technique and its uses in cardiac regeneration research.

протокол

Все эксперименты мыши были утверждены уходу и использованию животных в программе Национального института здравоохранения (NIH) с номером протокола H0083R3. NHLBI IACUC утвердил протокол без анальгетиков.

1. Гипотермия Анестезия в неонатологии мышей

1. Стерилизовать губки и хирургическое оборудование в автоклаве до операции. Подготовьте все хирургические материалы и включите горячий шарик в стерилизатора 15-20 мин заранее достигать 240 ° C до 270 ° C.
2. Перенесите все C57BL / 6 щенков (возраст P1) от их кормящей матери к чистой клетке мыши свежим постельным бельем и гнездования материалов. После того, как щенки взяты в комнату хирургии, выполните операцию апикального оперативно сводить к минимуму их время, проведенное отделен от матери и снижения риска материнской раскулачивание.
3. Положите губки на кровати льда, а затем поместить один щенок на губку для ~ 3 мин до достижения гипотермии анестезии. Подтвердите анестезии, наблюдая APнеа и акинезия и щипать заднюю ножку. Проверьте состояние новорожденных часто, потому что слишком мало времени, не сделает щенка акинетичных и апноэ, и чрезмерная продолжительность анестезии может снизить выживаемость ^12.

2. Торакотомия

1. Перевести щенка с кровати льда на хирургической области настольной и использовать ленту для фиксации его руки, ноги, хвост и в положении лежа на спине.
2. Лечить грудь с помощью бетадин и осторожно очистите ее с помощью 70% спирта подготовительную площадку.
3. Сделайте поперечный разрез кожи вдоль межреберных вперед области грудной полости с использованием Vännäs весна ножницами, а затем притупить рассекать вперед межреберных мышц, чтобы облегчить доступ к сердцу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выживаемость улучшится, когда кровопотеря сводится к минимуму во время хирургической процесса.

3. Хирургическое Ампутация сердца желудочка Apex

1. По стороны, осторожно применять давление на живот, чтобы экстериоризоватьсяверхушке сердца. Поглощенный кровь вокруг хирургической области с стерильных хлопка наконечником аппликаторы-за четкой визуализации. Для ложнооперированных новорожденных управления, перейдите к шагу 4 (Шов и восстановление мышей).
2. Под увеличительным лампы и с помощью ножниц иридектомия, мягко выполнить по частям резекция левого желудочка (ЛЖ), пока камера Л.В. подвергается. Будьте осторожны, чтобы свести к минимуму Резецированная части ЛЖ. Примерно 15% резекции необходимо для достижения оптимальной экспозиции камеры ЛЖ.
3. Убедитесь, что сердце возвращается к грудной полости, как только камера Л.В. подвергается.

4. Шов и восстановление мышей

1. Шовный ребра и мышцы вместе, чтобы запечатать грудной полости с использованием стерильных шовных материалов Proline 6-0, а затем тщательно закрыть разрез кожи сайт с помощью клея кожи.
2. Теплый новорожденного под лампой тепло для ~ 3 мин для восстановления, а затем очистите кровь и следы клея, используя 70% спирта подготовительную площадку BefoRe повторного ее к своим помета. Попробуйте завершить всю хирургическую процедуру в течение 10 мин, потому что минимизировать время, затрачиваемое отделен от матери повышает выживаемость детенышей после апикальной резекции.
3. После каждого хирургического вмешательства, место хирургические инструменты в контакте с капельками горячего шарика стерилизатор в течение приблизительно 20 сек для полной стерилизации. Разрешить хирургические инструменты, чтобы охладить до комнатной температуры перед каждым хирургии.
4. После завершения операции для всех щенков в помете, смешать с постельными принадлежностями щенков и экскрементов матери перед их возвращением гнездо матери.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, ИРС / CD-1 мышей лучше приемные матери, чем C57BL / 6, но даже среди кормящих матерей той же генетический фон, поощряющих инстинкты меняться. Если изменения кормящей матери необходимо уменьшить смертность матерей раскулачивание, удалить P0 щенков для кормящей матери, а затем выполнить резекцию верхушечный в P1. Выполнять только либо имитации операции или верхушечного гesection в одном помете щенков, потому что смешивание обман и хирургические щенки могут уменьшить выживаемость в группе хирургического щенков ^6.

5. Послеоперационный анализ

1. Один день после операции, контролировать щенков, убедитесь, что нет никакой разницы между обманом и хирургических групп, и подсчитать количество щенков, чтобы измерить уровень выживания. Если операции выполняются должным образом, выживаемость должна быть похожа и больше, чем 60% в обоих обман и хирургических групп.
2. Изоляция Сердце и фиксация.
   1. Усыпить щенков в дни 1 и 2 после операции через обезглавливание день 21 после операции по CO2 с уверенностью смерти путем смещения шейных позвонков, затем очистите сундук с использованием 70% спирта преп.
   2. Надрезать кожу и мышцы средней линии грудной клетки, а затем открыть сундук.
   3. Вырезания целые сердца из грудной полости и зафиксировать все сердце каждого образца в 5 мл 4% параформальдегида O / N при комнатной температуре.
3. На следующий день, передача образцы 70% этанола. Образцы могут храниться до одного недели, прежде чем парафин.
4. Разрез 5 мкм срезы толщиной парафиновые через весь желудочка и выполнить стандартную гематоксилином и эозином (H & E) и трехцветный окрашивания Массона, чтобы исследовать регенеративный ответ ^{5, 7.} В частности, Н & Е пятно используется для проверки замену мышц и трехцветный краситель Массона используется изучить фиброзные ответов ^5.
5. Выберите область интересов и установить, по крайней мере три очаги на образец вручную с помощью слайд-сканера. Изображение и анализировать окрашивания слайдов на 40-кратном увеличении в соответствии с инструкциями изготовителя с параметрами по умолчанию.

Результаты

Щенки мыши были подвергнуты эвтаназии 1, 2 и 21 дней после резекции верхушечного, и их сердца были собраны для H & E и трехцветный пятно Массона. Синий цвет в Trichrome пятно Массона указывает отложение эпикардиальной внеклеточного матрикса ^5. С успешной апикальной резекции, сгусток кро?...

Обсуждение

Cardiac regeneration shows potential for the treatment and prevention of heart failure^{1, 2}. Animal models are indispensable and play a critical role in understanding how cardiac regeneration occurs^3-6. Many amphibians and fish regenerate heart tissue in response to injury, providing insight into our understanding of human cardiovascular disease^{13, 14}. In terms of evolution, however, the pathophysiology should be more conserved between a mouse model and humans. Heart regeneration in mammal...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Olsen-Hegar Needle Holders with Scissors, 1.5 mm	Fine Science Tools	12002-12
Vannas Spring Scissors - 2 mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-03	Iridectomy scissors
Hot Bead Sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Iris Forceps, Straight, Serrated	Fine Science Tools	11064-07
Iris Forceps, Curved, Serrated	Fine Science Tools	11065-07
Shea Scissors - Curved/Blunt-Blunt/12cm	Fine Science Tools	14105-12
Round Handled Suture Tying Forceps, Straight	Fine Science Tools	18025-12
Round Handled Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15400-12
Fine Hemostat	Fine Science Tools	13007-12
Magnifying Lamp	Luxolamp Corp	IM120
Heating lamp	Brandt Equipment llc	51152/3
6-0 Prolene sutures	Ethicon	8889H
Skin glue-Vetbond Tissue Adhesive	3M	1469
Sterile Cotton Tipped Applicators	Dynarex	4305
WEBCOL Alcohol Prep Pad	Covidien	6818	Medium 2 PLY, 200/BOX, Satured with 70% Isopropyl Alcohol
Curity All Purpose Sponges	Covidien	9024	Non-woven 4 PLY, 4"x4" (10.2cm×10.2cm)
Bench top protector sheet	KIMTECH SCIENCE	7546	18" x 19.5" (45.72cm x 49.53cm) x 50
0.9% Sodium Chloride, 250ml	Hospira Inc.	NDC 0409-6138-22
Betadine Solution Swabsticks	Purdue Products L.P.	NDC 67618-153-03
Autoclave	TOMY Digital Biology	SX-700	HIGH-PRESSURE STEAM STERILIZER
Slide scanner	HAMAMATSU	NanoZoomer 2.0-RS