JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Embryonic stages are the most susceptible to xenobiotics. Although chemical toxicity depends on salinity, no method exists to test the salinity dependence of toxicity to aquatic organisms. Here, we describe a new and high-throughput method for determining the salinity dependence of toxicity to aquatic embryos.

Аннотация

Соленость является важной характеристикой водной среды. Для водных организмов она определяет среду обитания пресной воды, солоноватой воды и морской воды. Испытания токсичности химических веществ и оценки их экологических рисков для водных организмов часто выполняются в пресной воде, но токсичность химических веществ для водных организмов зависит от рН, температуры и солености. Там не существует метода, однако, для проверки солености зависимость токсичности для водных организмов. Здесь мы использовали Оризии (Oryzias latipes) , потому что они могут приспособиться к пресной воде, соленой воды и морской воды. Различные концентрации эмбриона выращивания среды (ERM) (1x, 5x, 10x, 15x, 20x и 30x) были использованы для проверки токсичности частиц серебра nanocolloidal (ВНС) в Оризии яйца (1x ERM и 30x ERM имеют осмотического давления, эквивалентной к пресной и соленой воде, соответственно). В шести хорошо пластмассовых плит, 15 оризии яйца в трех экземплярах подвергались ВНС на 10 мг / л &# 8722; 1 в различных концентрациях ERM при рН 7 и 25 ° C в темноте.

Мы использовали рассекает микроскоп и микрометр для измерения частоты сердечных сокращений на 15 сек и глаз диаметра на 6-й день и всю длину тела личинок на вылупления день (раздел 4). Эмбрионы не наблюдалось до вылупления или 14-й день; Затем мы подсчитали штриховки скорость каждый день в течение 14 дней (раздел 4). Чтобы увидеть накопление серебра в эмбрионах, мы использовали индуктивно связанной плазмы масс-спектрометрии для измерения концентрации серебра тестовых растворов (раздел 5) и dechorionated эмбрионов (раздел 6) .The токсичность ВНС до оризии эмбрионов, очевидно, увеличивается с увеличением солености. Этот новый метод позволяет проверить токсичность химических веществ в различных соленостью.

Введение

С момента создания Организации экономического сотрудничества и принципами клинических испытаний развития (ОЭСР) для тестирования химических веществ в 1979 году, 38 руководящих принципов тестирования были опубликованы в разделе 2 руководящих принципов, воздействие на биотические системы 1. Все водные организмы тестируемых были из пресноводных сред обитания, а именно пресноводных растений; водоросли; беспозвоночные, такие как дафнии и хирономид; и рыбы, такие как оризии, данио и радужной форели. По сравнению с соленой водой окружающей среды, пресноводные среды более непосредственно влияют человека экономической и промышленной деятельности. Таким образом, пресноводные среды стали приоритетными для тестирования, потому что они подвергаются более высокому риску от загрязнения.

В прибрежных районах, в том числе лиманов, соленость колеблется от солоноватой воды и морской воды условий, и эти участки часто загрязнены промышленной деятельности 2. Прибрежные районы и связанные с ними водно-болотные угодья характеризуются чIGH экологическое биоразнообразие и продуктивность. Поэтому прибрежные экосистемы должны быть защищены от химического загрязнения. Тем не менее, было ограничено экотоксикологическую исследований в солоноватой воде сред обитания и морской воды.

Sakaizumi 3 изучали токсичные взаимодействия между метилртути и солености в японских яиц оризии и обнаружили , что увеличение осмотического давления исследуемого раствора повышается токсичность метилртути. . Sumitani и др 4 использовали Оризии яйца для исследования токсичности свалок; они обнаружили, что осмотическое эквивалентность фильтрате к яйцам было ключом к индукции аномалий во время эмбриогенеза. Кроме того, Kashiwada 5 сообщалось , что пластиковые наночастицы (39,4 нм в диаметре) легко проникшего через оризия яйца хориона при солоноватой условиях (15x эмбрион выращивания среды (ERM)).

Типичная маленькая модель рыбы, японские оризия (Oryzias latipes ) используется в фундаментальной биологии и экотоксикологии 6. Японские оризия могут жить в условиях , начиная от пресной воды в морскую воду из - за их высокоразвитых хлоридных клеток 7. Они, следовательно, могут быть полезны для тестирования в условиях с широким диапазоном соленостью.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Японские оризия, используемые в данном исследовании, были обработаны гуманно в соответствии с институциональными рекомендациями Тойо университета, с учетом для облегчения бедствия и дискомфорта.

1. Серебряный наноколлоиды (ВНС)

  1. Покупка очищенные вторые национальные (20 мг / л -1, 99,99% чистоты, частицы со средним диаметром около 28,4 ± 8,5 нм , взвешенных в дистиллированной воде).
  2. Проверка чистоты и концентрации серебра с индуктивно связанной плазмой масс - спектрометрии (МС-ИСП) анализ в соответствии с руководством по эксплуатации 8. Способ предварительной обработки для ICP-MS анализа описана в разделе 7.

2. Подготовка SNC Solutions (Смеси Silver коллоидов и Ag +) с различными соленостью

  1. Подготовка 60 × ERM , состоящий из 60 г NaCl, 1,8 г KCl, 2,4 г CaCl 2 · 2H 2 O и 9,78 г MgSO 4 · 7H 2 O в 1 л Ultrapure воды; доведения рН до 7,0 с помощью 1,25% раствора NaHCO 3 в сверхчистой воде.
  2. Перемешать раствор ERM при 25 ° С в течение ночи.
  3. Смешайте с разведенным вторые национальные ERM. Приготовьте 40 мл каждого SNC-ERM смешанного раствора. Конечная концентрация составляет 10 мг / л -1 ВНС в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x).
  4. Регулировка рН SNC-ERM смешанного раствора до 7,0 с помощью 0,625% NaHCO 3 в сверхчистой воде. регулирование рН очень важно при приготовлении раствора SNC, так как Ag + высвобождение облегчается кислой среды 9.
  5. Используйте AgNO 3 в качестве эталонного соединения для ВНС.
    1. Смешайте AgNO 3 с разбавленным ERM. Приготовьте 40 мл AgNO 3 -ERM смешанном растворе при концентрации AgNO 3 15.7 мг / л -1 (10 мг / л -1 серебра) в различных концентрациях ERM (1x, 5x, 10x, 15x, 20x, или 30x) ,
      Примечание: Для исследования токсичности серебра коллоидный, AgNO 3Решение, которое является источником растворимого серебра, используют в качестве эталонного соединения для ВНС, которые представляют собой смесь из серебра коллоидов и растворимого серебра.

3. Оризии Культура и яйца Уборка урожая

  1. Получить Оризии (О. latipes) (оранжево-красный штамм) (60 самцов и 60 самок).
  2. Культура оризия как группы (20 мужчин и 20 женщин в качестве одной группы) в 1x ERM в 3 л цистернах с использованием проточного системы культивирования Оризии.
    1. Культура при следующих условиях:
      Диапазон рН культуральной среды: 6,2 до 6,5
      свет: темно цикл: 16: 8 ч
      Температура культуральной среды: 24 ± 0,5 ° С
      Осмотическое давление питательной среды: 257 мОсм
  3. Поток Оризии на Артемия Салина науплиев в 10:00 (раз в день) и кормить искусственную сухой рыбы диету в 09:00, 11:00, 13:00, 15:00, 17:00 (пять раз в день).
    1. Получить А. заИпа науплии.
    2. Приготовьте 5 л 3,0% -ного раствора соли в пластиковый стакан.
    3. Добавьте 30 г артемии яйца в растворе соли в стакане.
    4. Инкубировать яйца при температуре 25 ° С в течение 48 ч при барботировании (4 л / мин -1) при помощи аэрации насоса.
    5. Через 48 ч остановить бульканье.
    6. Дайте раствору отстояться в течение от 5 до 10 мин , чтобы отделить вылупившихся А. салина Науплиусы (нижняя часть раствора) из Незаштрихованная яиц и яичной скорлупы (верхняя часть раствора).
    7. Удалите верхний слой раствора декантацией.
    8. Фильтр нижнюю часть раствора через сито с отверстиями 283 мкм, и собирают науплии, которые проходят через на сетку с отверстиями 198 мкм.
    9. Поток науплии к оризии в течение 6 часов.
  4. После того, как самка оризия породили, удалить внешние кластеры яйца аккуратно из тел самок »или собирать яйца из нижней части аквариума с помощью смвсе чистые (нетто размер 5 см х 5 см, размер отверстия 0,2 мм х 0,2 мм).
  5. Ополосните яйцо кластера проточной водопроводной водой в течение 5 сек.
  6. Добавьте все промытые кластеров яиц в растворе 30х ERM.
  7. Удалить кластеры из раствора через 1 мин и поместите кластеры яичные между сухие бумажные полотенца и рулон мягко.
  8. Положите яйца обратно в 30x ERM.
  9. Выберите оплодотворенную икру под рассекает микроскопом.
  10. Местом 810 яиц в 1x ERM в шесть-луночных пластиковых пластин с помощью щипцов.
  11. Инкубировать яйца при температуре 25 ± 0,1 ° С в термостате до стадии развития 21. (Стадии развития этих оризии эмбрионов были определены из работы Iwamatsu 10.)
  12. Выберите из инкубационных яиц на стадии развития 21 под рассекает микроскопом.
  13. Полоскание выбранные яйца с 1x ERM.
  14. Тема промытых яйца экспериментов по воздействию (раздел 4).

4. Токсичность Испытание ВНС или AgNO 3 При различных ERM соленостью

  1. Промыть Оризии яйца (этап 21) три раза с испытуемым раствором [ВНС (10 мг / л -1) или AgNO 3 (15.7 мг / л -1 , как 10 мг / л -1 серебра) при каждой концентрации ERM (1x, 5x , 10x, 15x, 20x или 30x) при рН 7]. В качестве контроля используют яйца в 1 × до 30 × ERM при рН 7.
  2. Добавьте 15 промытые яйца до 5 мл каждого испытуемого раствора в шести-луночных пластиковых пластин. (Выполните экспериментов по воздействию три раза для SNC или AgNO 3 токсичность тестирование с использованием каждого испытуемого раствора.)
  3. Оберните пластин в алюминиевую фольгу.
  4. Инкубируйте обернутые пластин при 25 ° С в темноте до вылупления или в течение 14 дней.
  5. Соблюдайте экспонированных яйца каждые 24 ч для биологических изменений и мертвых яиц (рисунки 1 и 2).
  6. Обмен испытуемых растворов каждые 24 ч.
  7. Выполните наблюдения следующим образом.
    1. На 6-й день воздействия, подсчитать частоту сердечных сокращений (за 15 сек) оF медака эмбрионы под микроскопом рассекает с помощью секундомера (фиг.3А).
    2. На 6 -й день воздействия, измерить размер глаз (диаметр) оризии эмбрионов под микроскопом рассекает с помощью микрометра (фигура 3В).
    3. На инкубационных день, измеряют полные длины тела личинок под препаративным микроскопом с помощью микрометра (рис 3в).
    4. Подсчитать общее количество выставленных яиц , которые люк в течение 14 дней (Рис 3).

5. Выделение серебра из растворимой SNC Solution и Silver Analysis

  1. Изолировать растворимого серебра из каждого раствора SNC (смесь серебра коллоидов и растворимого серебра) с помощью фильтрации через 3 кДа мембранный фильтр при 14000 х г и 4 ° С в течение 10 мин. С помощью 3 кДа мембранного фильтра для выделения растворимого серебра из ВНС, так как сообщенное средний диаметр агрегированных ВНС в 1x ERM составляет 67,8 нм 11 аго , что из Ag + составляет 0,162 нм 12; 3 кДа мембрана исключает частицы диаметром 2 нм или более 13.
  2. Измерьте концентрацию серебра в 50 мкл отфильтрованного раствора (= растворимая концентрации серебра) с помощью ICP-MS анализа (рис 3e) в соответствии с инструкцией по эксплуатации ICP-MS 8. Способ предварительной обработки для ИСП-МС анализа описана в разделе 7.

6. Измерение Серебряного биоаккумуляции в оризии Эмбрионы

  1. Expose Оризии яйца (стадия 21) ВНС или AgNO 3 , как описано в разделе 4.
  2. На 6 -й день воздействия, удалить хориона из яйца (то есть, dechorion) с использованием Оризии инкубационных фермента в соответствии с протоколом , описанным в оризии книге 14.
  3. Измерьте концентрацию серебра в dechorioned яиц путем анализа ICP-MS в соответствии с ИСП-МС Руководство по эксплуатации 8 (рис 3f). предварительная обработкаметод ICP-MS анализа описана в разделе 7.

7. Измерение серебра концентрации с помощью ICP-MS анализа

  1. Добавить примеры [50 мкл раствора серебра (для проверки концентрации серебра; раздел 1); три dechorionated эмбрионов (раздел 5); или 50 мкл отфильтрованного раствора (раздел 5)] в стакане тефлоновой 50 мл.
  2. Добавить 2,0 мл сверхчистой азотной кислоты в химический стакан емкостью 50 мл.
  3. Нагреть смесь на горячей плите при 110 ° С до тех пор, как раз, прежде чем она высыхает (около 3 ч).
  4. Для того, чтобы полностью растворить органическое вещество, добавьте 2,0 мл сверхчистой азотной кислоты и 0,5 мл перекиси водорода в стакан.
  5. Нагреть смесь снова на горячей плите, пока незадолго до ее высыхания (около 3 ч).
  6. Остаток растворяют в 4 мл 1,0% раствора сверхчистой азотной кислоты.
  7. Передача 4 мл раствора в пробирку для центрифугирования.
  8. Повторить от 7,6 до 7,7 раза (в общей сложности три раза). Конечный объем составляет 12,0мл.
  9. Измеряют концентрацию серебра в образце (растворенного в 1,0% сверхчистой азотной кислоты) , с помощью анализа ICP-MS в соответствии с руководством по эксплуатации 8.
    1. Используйте внутренний и внешний стандартное решение (см список материалов) для количественного определения концентрации серебра. Внутреннее и внешнее стандартное решение аккредитована Американской ассоциации по аккредитации лабораторий (A2LA). Пределы обнаружения серебра были 0,0018 нг / мл - 1 (раствор) и 0,016 нг мг-вес -1 (эмбриона тела).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Влияние солености на токсичность SNC была очень очевидна: индукция уродства или смерти была соленость зависимых (1 и 2). Мы измеряли фенотипических биомаркеров (частота сердечных сокращений, размер глаз, полная длина тела и скорость вылупления) в SNC (10 м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Оризии является пресноводная рыба, которая является весьма терпимы к морской воде; он не очень хорошо известно , что первоначальная естественная среда обитания этой рыбы была соленой воды у берегов Японии 6. Следовательно, оризии рыбы имеют хорошо развитые хлоридные клетки 7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that they have no competing financial interests.

Благодарности

We are grateful to Ms. Kaori Shimizu and Mr. Masaki Takasu of the Graduate School of Life Sciences, Toyo University, for their technical support. This project was supported by research grants from the Special Research Foundation and Bio-Nano Electronics Research Centre of Toyo University (to SK); by the Science Research Promotion Fund of the Promotion and Mutual Aid Corporation for Private Schools of Japan (to SK); by the New Project Fund for Risk Assessments, from the Ministry of Economy, Trade and Industry (to SK); by a Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research (award 23651028 to SK); by a Grant-in-Aid for Scientific Research (B) and (C) (award 23310026 and 26340030 to SK); and by a Grant-in-Aid for Strategic Research Base Project for Private Universities (award S1411016 to SK) from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology of Japan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Silver nanocolloidsUtopia Silver Supplements
NaClNacalai Tesque, Inc.31319-45For making ERM
KClNacalai Tesque, Inc.28513-85For making ERM
CaCl2·2H2ONacalai Tesque, Inc.06730-15For making ERM
MgSO4·7H2ONacalai Tesque, Inc.21002-85For making ERM
NaHCO3 Nacalai Tesque, Inc.31212-25For making ERM
AgNO3Nacalai Tesque, Inc.31018-72
pH meterHORIBA, Ltd.F-51S
BalanceMettler-Toledo International Inc.MS204S
medaka (Oryzias latipes) orange-red strainNational Institute for Environmental Studies
medaka flow-through culturing systemMeito Suien Co.MEITOsystem
Artemia salina nauplii eggsJapan pet design Co. Ltd4975677033759
aeration pumpJapan pet design Co. Ltdnon-noise w300
Otohime larval β-1Marubeni Nissin Feed Co. LtdOtohime larval β-1Artificial dry fish diet
dissecting microscopeLeica microsystemsM165FC
micrometerFujikogaku, Ltd.10450023
incubatorNksystemTG-180-5LB
shakerELMI Ltd.Aizkraukles 21-136
6-well plastic platesGreiner CELLSTARM8562-100EA
aluminum foilAS ONE Co.6-713-02
stopwatchDRETEC Co. Ltd.SW-111YE
3 kDa membrane filterEMD Millipore Corporation0.5 ml centrifugal-type filter
50 ml Teflon beakerAS ONE Co.33431097
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-538For internal standard
Custom claritas standardSPEXertificateZSTC-622For external standard
ultrapure nitric acidKanto Chemical Co.28163-5B
hydrogen peroxide Kanto Chemical Co.18084-1Bfor atomic absorption spectrometry
ICP-MSThermo ScientificThermo Scientific X Series 2 
hot plateTiger Co.CRC-A300

Ссылки

  1. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2 Effects on Biotic Systems. , OECD. Available from: http://www.oecd-ilibrary.org/environment/oecd-guidelines-for-the-testing-of-chemicals-section-2-effects-on-biotic-systems_20745761 (2015).
  2. National Coastal Condition Report. , Environmental Protection Agency, Office of Water and Office of Research and Development. Washington, DC. (2001).
  3. Sakaizumi, M. Effect of inorganic salts on mercury-compound toxicity to the embryos of the Medaka, Oryzias latipes. J. Fac. Sci. Univ. Tokyo. 14 (4), 369-384 (1980).
  4. Sumitani, K., Kashiwada, S., Osaki, K., Yamada, M., Mohri, S., Yasumasu, S., et al. Medaka (Oryzias latipes) Embryo toxicity of treated leachate from waste-landfill sites. J. Jpn. Soc. Waste Manage. Exp. 15 (6), 472-479 (2004).
  5. Kashiwada, S. Distribution of Nanoparticles in the See-through Medaka (Oryzias latipes). EHP. 114 (11), 1697-1702 (2006).
  6. Iwamatsu, T. The Integrated Book for the Biology of the Medaka. , University Education Press. Japan. (2006).
  7. Miyamoto, T., Machida, T., Kawashima, S. Influence of environmental salinity on the development of chloride cells of freshwater and brackish-water medaka, Oryzias latipes. Zoo. Sci. 3 (5), 859-865 (1986).
  8. XSERIES 2 ICP-MS Getting Started Guide Revision B - 121 9590. , Thermo Fisher Scientific Inc.. Available from: http://202.127.146.37/eWebEditor/uploadfile/20130314161434190.pdf (2007).
  9. Kashiwada, S., Ariza, M. E., Kawaguchi, T., Nakagame, Y., Jayasinghe, B. S., Gartner, K., et al. Silver nanocolloids disrupt medaka embryogenesis through vital gene expressions. ES & T. 46 (11), 6278-6287 (2012).
  10. Iwamatsu, T. Stages of normal development in the medaka Oryzias latipes. Mech. Dev. 121, 605-618 (2004).
  11. Kataoka, C., Ariyoshi, T., Kawaguchi, H., Nagasaka, S., Kashiwada, S. Salinity increases the toxicity of silver nanocolloids to Japanese medaka embryos. Environ. Sci.: Nano. 2, 94-103 (2014).
  12. Shannon, R. D. Revised effective ionic radii and systematic studies of interatomic distances in halides and chalcogenides. Acta Cryst. 32, 751-767 (1976).
  13. Pore size chart. , Spectrum Laboratories, Inc.. Available from: http://jp.spectrumlabs.com/dialysis/PoreSize.html (2015).
  14. Wakamatsu, Y. Medaka Book, 6.1: Preparation of hatching enzyme. , National BioResource Project (NBRP) Medaka. Available from: [cited 2015] https://shigen.nig.ac.jp/medaka/medakabook/index.php?6.1%20preparation%20of%20hatching%20enzyme (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

109

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены