Количественная оценка церебральной сосудистой архитектуры с использованием двухфотонного микроскопии в мышиной модели ВИЧ-индуцированной нейровоспаление

Резюме

This paper describes a method by which the vascular architecture in the brain can be quantified using in vivo and ex vivo two-photon microscopy.

Аннотация

Human Immunodeficiency Virus 1 (HIV-1) infection frequently results in HIV-1 Associated Neurocognitive Disorders (HAND), and is characterized by a chronic neuroinflammatory state within the central nervous system (CNS), thought to be driven principally by virally-mediated activation of microglia and brain resident macrophages. HIV-1 infection is also accompanied by changes in cerebrovascular blood flow (CBF), raising the possibility that HIV-associated chronic neuroinflammation may lead to changes in CBF and/or in cerebral vascular architecture. To address this question, we have used a mouse model for HIV-induced neuroinflammation, and we have tested whether long-term exposure to this inflammatory environment may damage brain vasculature and result in rarefaction of capillary networks. In this paper we describe a method to quantify changes in cortical capillary density in a mouse model of neuroinflammatory disease (HIV-1 Tat transgenic mice). This generalizable approach employs in vivo two-photon imaging of cortical capillaries through a thin-skull cortical window, as well as ex vivo two-photon imaging of cortical capillaries in mouse brain sections. These procedures produce images and z-stack files of capillary networks, respectively, which can be then subjected to quantitative analysis in order to assess changes in cerebral vascular architecture.

Введение

Вирус иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) вторгается в мозг во время острой фазы вирусной инфекции, и продуктивно инфицирует как микроглии и макрофагов головного мозга, что приводит к их активации - и выпуск обеих принимающих полученных медиаторов воспаления и растворимого ВИЧ-1 virotoxins, такие как Tat и gp120 (обзор ^в 1,2). Как следствие, хронический нейрогенный государство становится создан в ЦНС, который, как полагают внести свой ​​вклад в патогенезе ВИЧ-1 Associated Нейрокогнитивная расстройств (рука) ^3-5.

Хронический сверхэкспрессия ВИЧ-1 Tat или интерлейкина (IL) -17а в ЦНС мышей было показано, приводит к микрососудистой разрежения ^6,7. Это повышает вероятность, что хроническое нейровоспаление может внести свой вклад в патогенезе РУКИ через воздействие на церебральной сосудистой. В целях дальнейшего изучения этого вопроса, мы разработали методы для количественного церебральных сосудистых STRUCвания.

В этом документе описан способ количественного определения количества капиллярных узлов, капиллярных сегментов, значит длину сегмента, общую длину сегмента, значит капиллярную диаметре, и общий объем капиллярного использованием в естественных изображений капиллярных сетей через кортикальной окна тонкие черепа (модифицированный от ранее описанных протоколов) ^8,9, а также экс естественных изображений срезов головного мозга, используя двухфотонное микроскопии. Этот комбинированный подход обеспечивает целостного количественного мозговых сосудистых параметров, так как в естественных условиях тонкий череп корковых окно позволяет для сохранения головного среды, в то время как экс естественных изображений капиллярных сетей в срезах мозга позволяет реконструкцию полная трехмерная капиллярные сети - которые затем могут быть определены количественно с использованием коммерчески доступного программного обеспечения.

протокол

Университет Рочестера университета комитета по ресурсам животных одобрил все процедуры, выполняемые в этой статье.

1. Предоперационная подготовка (и мышей)

1. Подготовка хирургического области с всем необходимым оборудованием. Стерилизовать все инструменты, используемые во время процедуры заранее, используя 70% этанола. При желании, использовать стекло-шарик стерилизатор или автоклава для стерилизации инструментов.
2. Наведите в индукции камеры ИФ, подключенного к ИФ испаритель. Установите Isoflurane уровни до 4% в размере 1 л / мин.
   Примечание: для экспериментов, представленных здесь, у мышей с доксициклина (DOX), индуцируемый ВИЧ-1 Tat трансгенной приводом от астроцитов конкретных глиальных фибриллярного белка (GFAP), промотор (ВИЧ Тат-TG мышей) ¹⁰ были использованы для изучения влияния ВИЧ -1 индуцированной церебральной нейровоспаления на структуре сосудистой, как описано выше ^7,10.
3. Аккуратно наклоните камеру индукции наблюдать мыши и# 39, S рефлекса. После того, как рефлекса было подавлено, установить изофлуран уровня в 2%, а перенаправить поток воздуха от индукции камеры к носовой конус в хирургическом скамейке.
4. Быстро переместите мышь от индукции камеры к воде придают грелку. Продолжать применять изофлуран (1,5-2%) через носовой конус. Отрегулируйте анестезии в соответствии с индивидуальной переносимости мыши оценочной через частоту дыхания (RR) мониторинга.
   Примечание: депрессия рублей могут нарушать физиологические параметры газа Изменение мозгового кровотока и оценка диаметра сосуда. Попытка сохранить RR между 55-65 вдохов в минуту. Частота сердечных сокращений (HR) также могут быть использованы оценки глубины анестезии; держать HR между 300-450 ударов в минуту, чтобы предотвратить физиологические изменения в диаметре сосуда. Как правило, анестезия будет адекватным между 1,5-2,0% изофлуран в 1 л / мин для данной мыши.
5. Выполните ног щепотку для дальнейшего проверить глубину анестезии. Если мышь не отвечает, коммENCE хирургические процедуры.

2. Подготовка черепной Window Тонкие черепа

1. Применить искусственной слезы гель для глаз мыши. Полностью удалить волосы из головы мыши с помощью ножниц или электрической бритвой.
2. Стерилизовать кожу головы путем применения повидон-йод раствор; дать высохнуть. Затем, под световым микроскопом, удалить кожу от головы мыши, полностью обнажая теменных костей, хвостовой лобных костей, и темя маркировки.
3. Нанесите небольшое количество 10% -ного раствора хлорида железа к черепу, чтобы высушить мембраны для легкого удаления. Удалить высушенные мембраны с # 5/45 пинцета осторожно очищая череп.
4. Нанесите тонкий слой клея вокруг Headplate окне. Аккуратно нажмите Headplate против черепа мыши, удерживая сферу интересов в центре окна. Нанесите каплю зубной цемент в Headplate для полимеризации клея.
5. Нанесите тонкий слойклея вдоль края окна Headplate создать резервуар, в котором для хранения солевого раствора. После того, как клей высохнет, винт Headplate в жгуте мыши Headplate.
   Примечание: мышь Headplate жгут используется в этой процедуре является структура с металлической основы и двух металлических колонн. На каждой колонке есть один весной и одна гайка крыла. Headplate находится на вершине весной, и гайка затягивается крыло, пока головка не выровняется и не двигаться.
6. Удалите клей с Headplate окне, используя сверло, прикрепленный к MicroTorque сверла, установленного на 6000 оборотах в минуту. Стоп каждые 10-15 секунд, чтобы предотвратить перегрев мыши черепа, которые могут привести к структурным повреждениям сосудов.
   1. Использование новой сверло, поместите MicroTorque сверла 1,5 мм латерально от средней линии (одной трети диаметра окна Headplate). Начните тонкий череп вокруг этого места на 4000 оборотах в минуту. Перемещение дрель мягко по черепа без прямого понижательное давление.
   2. Перестаньте Drilлин каждые 10-15 сек для предотвращения перегрева череп мыши. В течение этого времени, удалить накопившуюся череп пыль с помощью сжатого воздуха канистру.
   3. Используйте капли физиологического раствора РТ для охлаждения череп в течение 5-10 сек. Аккуратно удалите всю жидкость с мягкой ткани, чтобы продолжить череп истончение.
7. Для окончательного истончение черепа, разместить небольшой объем физиологического раствора в резервуаре Headplate и слегка подметать зубной MicroBlade по интересующей области, пока мелкие сосуды четко видны.

3. Мониторинг физиологических параметров

1. После того, как череп полностью разбавленной, отсоедините мышь от держателя и положите его на спину. Аккуратно прикрепите вниз обе задние ноги, чтобы четко выставить медиальной бедра.
2. Удалить волосы на обе медиальной поверхности бедер с помощью ножниц или электрической бритвой. Лечить хирургической сайт, охватывающий бедра с повидон-йодом.
3. Зажмите кожу на медиальной правого бедра над бедренной веныи артерии с помощью # 5 щипцами. Осторожно потяните кожу вверх на и использовать ножницы, чтобы вырезать и удалить кожу.
   Примечание: левое бедро зарезервирован в случае хирургических осложнений (сосудистых аномалий, разрыв сосудов).
4. Применить около 3-5 капель 0,9% физиологического раствора к хирургическому сайте. Это позволяет большим увеличением судов, а также по поддержанию сайта увлажненной и предотвращения высыхания сосудов. Отделите бедренную вену от артерии прямо рассекает в бедренную сосудисто-нервного пучка с использованием двух # 5/45 пинцет.
5. Поместите два, 3 см кусочки хирургического шва под бедренную артерию примерно 1 см друг от друга. Поверните верхнюю шов по часовой стрелке, чтобы создать сосудистой жгут, который поможет предотвратить чрезмерное потери крови во время катетеризации.
6. Сделайте небольшой надрез в бедренной артерии с использованием пружинных ножниц. Поместите катетер в артерию через разрез и заранее, пока катетер надежно в артерии.
Untwist верхний шов (жгут) на предмет утечек и правильной установки катетера. Безопасный катетер в бедренную артерию, связывая два узла вокруг катетера в сосуде с использованием швов.
7. Вводят 10 мкл гепарина (100 МЕ / мл) через катетер, чтобы предотвратить свертывание крови. Затем хирургическим закрыть правое бедро при шитье кожи вместе с 4-0 шва в простой прерванного рисунка.
8. Вводят 50 мкл уретана (1,2 мг / г) внутрибрюшинно в правом нижнем квадранте. Пять минут спустя повторить с другой 50 мкл инъекции в левом нижнем квадранте в общей сложности 100 мкл внутрибрюшинной уретана. Медленно уменьшить Isoflurane уровни примерно 0,25%, а одновременно перепроверки мышь для глубины анестезии.
   Примечание: Следует иглу поверхностным в брюшную полость вдоль задней стенки живота так, чтобы он не перфорировать кишечника. Это может быть достигнуто, зажимая брюшной прямая муscles от внутренностей, а затем путем инъекций.
9. Использование капиллярную трубку, собрать 40 мкл пробы артериальной крови из катетера. Приложить катетер к преобразователю артериального давления, снабженную солевым заполненные четыре ходовой кран и гепарина заполненного шприца.
10. Лента преобразователь артериального давления в хирургическим устройством для предотвращения непреднамеренного удаления катетера. Начните мониторинг среднего артериального давления.
11. Вставьте крови заполнено капиллярную трубку в порт ввода анализатор газов крови. После того, как вся кровь была взята, извлеките капиллярной трубки из порта ввода. Уровни газа ₂ O ₂ в крови и CO появится на бумагу, напечатанную на газоанализатора крови.

4. Введение флуоресцентный краситель

1. Зажмите кожу на медиальной бедра с помощью левой кнопки № 5 пинцет. Осторожно потяните кожу вверх на и использовать ножницы, чтобы вырезать и удалить кожу. Подготовка декстран сопряженную красный излучающий родамин красителя(70 кДа) (10 мг / кг, растворенные в физиологическом растворе).
2. Найдите бедренной vein.Using в 1 мл шприц с 30 G иглой, рисовать заранее подготовленный раствор флуоресцентного красителя соответствующего для создания изображений на 130 мкл линии шприца. Удалить все пузырьки воздуха, опираясь краситель полностью в шприц и твердо стряхивая шприца стену.
   1. Согните G иглы 30 на примерно 30 градусов угол, прижимая его к твердой поверхности конических вверх. Заполните иглу с красителем и выбросить излишки жидкости, оставляя образец 100 мкл.
3. Вводят 100 мкл образца красителя медленно в бедренную вену. После удаления иглы, применяются устойчивый, осторожно, чтобы давление в месте инъекции, чтобы остановить кровотечение. Разрешить краситель циркулировать в течение 5 мин.
   Примечание: В качестве альтернативы, Правую бедренную вену может быть использован вместо для инъекций флуоресцентный краситель, чтобы предотвратить дальнейшее кровопотери путем создания другого хирургического участка. Кроме того, еслиживотное кровотечение неконтролируемо от места операции, это может быть признаком того, что слишком много гепарина было дано для промывки катетера. Если нет свертывания в пределах 10-15 мин, а мышь все еще кровотечение, рассмотреть перезапуска эксперимент с новым мыши.
4. Закройте левую ляжку при шитье кожи вместе с 4-0 шва, а затем тщательно переверните мышь на живот, и поместить его в упряжке мыши Headplate.

5. В Vivo Двухфотонные изображений

1. Перемещение хирургического аппарат двухфотонного микроскопа, убедившись, что для поддержания непрерывных уровни анестезии. Поместите небольшое количество 0,9% физиологического раствора в резервуаре Headplate и нижней объектива микроскопа так, что он входит в контакт с солевым раствором. Найдите область интереса с помощью светлого-просмотра цели
2. Установите два фотона лазерного возбуждения длины волны, подходящей для флуоресцентного красителя. Начните изображений двухфотонную помощью 25x OЕЛЬ.
   Следует отметить, что в этих экспериментах мы использовали декстран, конъюгированный с красным красителем родамин излучающей был возбужден, что при длине волны 780 нм. 607/36 полосовой фильтр излучения для обнаружения флуоресценции от красителя, и 480/20 полосовой фильтр излучения был использован для обнаружения артериальной аутофлюоресценция
3. Найдите капиллярного русла на экране просмотра, и увеличить эту область с помощью оптического зума 2. Получение изображений капилляров с помощью программного обеспечения визуализации двух фотонов.
4. После визуализации завершена, пожертвовать мышь цервикальным сдвигом с последующей декапитацией.

6. Экс Vivo Двухфотонное изображений

1. Использование дополнительных тонких ножниц, сделать надрез в коже головы от interparietal костей до лобных костей мыши. Безопасный кожу по бокам черепа с пальцем указателя и большим пальцем.
2. Поместите дополнительные тонких ножниц под медиальной кость инков и сократить череп по стреловидного шва, Остановите резки череп примерно 3 мм после брегма маркировки.
   Примечание: Нанесите восходящее давление при резке череп, чтобы предотвратить резки мозг.
3. Использование # 5 щипцами, отделите череп от мозга и аккуратно удалите все мозговые оболочки с поверхности мозга. Остальные оболочек может случайно разрывают мозг; крайнюю осторожность должны быть приняты, чтобы избежать этого. Аккуратно сдвиньте # 5 щипцы под мозга наступающей медленно вперед, пока мозг не свободен от черепа.
   Примечание: что направленное вниз давление должно использоваться для того, чтобы избежать прокалывания мозга.
4. Поместите мозг в мозг секционирования инструмента, специфического для мышей. Промыть мозг, применяя капли искусственной цереброспинальной жидкости через мозг.
5. Снимите 2 мм корональной раздел мозга от темени до темени 0 -2. Поместите короны раздел на вогнутой стекло, содержащих искусственные спинномозговой жидкости с 0 брегмы (наиболее черепной части секции) вверх. Аккуратно покрыть SL мозгалед с покровным стеклом.
   Примечание: Не нажимайте стекло После размещения на участке мозга, так как это может привести к деформации сосудов архитектуры.
6. Передача слайд столике микроскопа и поместите небольшое количество 0,9% физиологического раствора на покровное. Опустить объектива микроскопа, пока она не вступает в контакт с раствором. Найдите среднюю линию мозга с использованием светлого цели.
7. Начните изображений двухфотонную и найдите среднюю линию еще раз с помощью 25x цели. Выполнять это, глядя на продольной трещины на поверхности коры корональной разделе. Поместите правый край экрана изображений по средней линии и переместите экран просмотра более латерально три полных кадров (примерно 1,5 мм от средней линии).
   Следует отметить, что в этих экспериментах, параметры визуализации были идентичны тем, которые упомянуты в примечании в шаге 5.2.
8. Найдите глубину, на которой капилляры едва видны на экране просмотра. Опустите плоскость фокуса дополнительный 20мкм для определения верхней части стека г.
9. Установите толщину изображения до 1 мкм. Опустите экран просмотра для 100 мкм и настроить мощность лазера в течение, например, что менее 1% пикселей перенасыщены.
   Примечание: изображения г-стека составлен из серии 100 мкм 500x500x1 подряд изображений. Чем больше г-стек более точные расчеты постобработки будет. Как правило, попытка собрать Z-стек 100 мкм или больше.
10. Нажмите на иконку XY повторного затем по значку прилегающей XY. После того, как г-стек полный, нажмите значок серии урон и сохраните файл.

7. Обработка данных

1. Открыть в естественных условиях капиллярного изображение в программе ImageJ. Вручную установить пиксель соотношение расстояния на основе значений, полученных с помощью программного обеспечения двух фотонов.
   1. Выберите * * прямой иконку из меню инструментов. Нарисуйте линию, проходящую от одного капиллярной стенки к OPPOСайт стенки капилляра, и запишите длину, представленную ImageJ.
      Обратите внимание, что это может быть необходимо для увеличения изображения для того, чтобы четко визуализировать края стенок капилляров.
   2. Повторите шаг 7.1.1 в различных местах вдоль капилляра, а также для нескольких капилляров в изображении.
2. Откройте файл г-стека в аналитической программного обеспечения, таких как Amira. Выберите значок накаливания редактор из панели инструментов суб-приложений
   1. Установите толщину просмотра примерно 20. Переместить зрителя верхней или нижней части г-стека.
   2. Выберите значок трассировки и переместите курсор загруженного изображения. Место узлы капилляров в местах, описанных на рис 2С; сегменты будут автоматически появляться между соседними узлами. Проследите капилляры на протяжении всего г-стека.
      Примечание: необходимо будет разместить узлы между конечными точками и точками ветвления для того, чтобы проследить капилляры Четoughout г-стека.
   3. Для удаления этих узлов, нажмите Удалить промежуточный значок.
      Примечание: Это может создать ошибочное закольцованных сегментов, которые должны быть удалены вручную, выбрав цикл с помощью выбора отдельных значок, а затем выберите значок Удалить выбранное. Если петли продолжают появляться в том же районе в ходе трассировки, вполне вероятно, что узлы были размещены на разных капилляров.
   4. После того, как трассировка завершена, выберите значок График Info, чтобы открыть таблицу, содержащую извлеченные автоматически сосудистых параметров. Число узлов и сегментов доступны на главном экране просмотра.

Результаты

Кортикальный окно тонкой черепа позволяет в естественных условиях двухфотонного изображений корковых капилляров (рис 1). Подходящий область, чтобы изображение показывает многочисленные, различные капилляры (рис 1а). В то же поле зрения, нет клет...

Обсуждение

Способ, описанный здесь, может быть применена для анализа мозга микрососудистых структуры в широком диапазоне экспериментальных моделей / настроек. Для успеха этого метода, три критические шаги должны быть освоены. Во-первых, окно тонкой череп не должен повредить череп или основной мо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Leica Microscope	Leica Inc.	MZ8
High Intensity Illuminator	Dolan-Jenner	180
Heating Pad	Stryker	TP3E
T/PUMP	Gaymar Industries, Inc.	TP-500
TEC-4 Isoflurane Vaporizer	Datex Ohmeda	447
Artificial Tear Gel	Butler AHS	7312
Povidone-Iodine solution	Aplicare	52380-1855-9
Extra Fine Bonn Scissors	Fine Science Tools	14084-08
Dumot #5 Forceps	Fine Science Tools	11295-10
Dumont #5/45 Forceps	Fine Science Tools	11251-35
Ferric Chloride Solution	Ricca Chemical Company	3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel	Henkel	45404
Dental Cement	Stoelting	51459
Microtoruqe II Handpiece Kit	Pearson Dental	R14-0002
005 Burr for Micro Drill	Fine Science Tools	19007-05
Norland Blade (Dental Microblade)	Salvin Dental	6900
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500	Group 2B Carcinogen
Braided Suture	Ethicon	735G
Vannas Spring Scissors	Fine Science Tools	15000-03
Arterial Catheter	SAI Infusion Technologies	MAC-01	The end of the catheter was manually stretched out in order to decrease its diameter.
Blood Pressure Moniter	World Precision Intruments	SYS-BP1
Blood Pressure Transducer and Cable	World Precision Intruments	BLPR2
RAPIDLab Blood Gas Analyzer	Siemens	248
40 μl Capillary Tube	VWR	15401-413
Texas Red-dextran (70,000 MW, 10 mg/kg dissolved in saline)	Invitrogen	D-1830
Adult Mouse Brain Slicer Matrix	Zivic Instruments	BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM Multiphoton Microscope	Olypmus	FV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti:Sa laser	Spectra-Physics
ImageJ Software	National Institutes of Health (NIH)		Available at http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira Software	Visage Imaging