JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

We established the photoconvertible PSmOrange system as a powerful, straight-forward and cost inexpensive tool for in vivo cell tracking in GFP transgenic backgrounds. This protocol describes its application in the zebrafish model system.

Аннотация

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing developmental processes as they happen in the living animal. Cells of interest can be labeled by using a tissue specific promoter to drive the expression of a fluorescent protein (FP) for the generation of transgenic lines. Using fluorescent photoconvertible proteins for this purpose additionally allows to precisely follow defined structures within the expression domain. Illuminating the protein in the region of interest, changes its emission spectrum and highlights a particular cell or cell cluster leaving other transgenic cells in their original color. A major limitation is the lack of known promoters for a large number of tissues in the zebrafish. Conversely, gene- and enhancer trap screens have generated enormous transgenic resources discretely labeling literally all embryonic structures mostly with GFP or to a lesser extend red or yellow FPs. An approach to follow defined structures in such transgenic backgrounds would be to additionally introduce a ubiquitous photoconvertible protein, which could be converted in the cell(s) of interest. However, the photoconvertible proteins available involve a green and/or less frequently a red emission state1 and can therefore often not be used to track cells in the FP-background of existing transgenic lines. To circumvent this problem, we have established the PSmOrange system for the zebrafish2,3. Simple microinjection of synthetic mRNA encoding a nuclear form of this protein labels all cell nuclei with orange/red fluorescence. Upon targeted photoconversion of the protein, it switches its emission spectrum to far red. The quantum efficiency and stability of the protein makes PSmOrange a superb cell-tracking tool for zebrafish and possibly other teleost species.

Введение

Exponentially improving imaging techniques allow following developmental processes over time periods of up to about four consecutive days3. In zebrafish and many other animal model systems, specific cells, tissues, axonal or vascular structures are marked by transgenic green or sometimes red or yellow fluorescent proteins to facilitate visualization. However, in most transgenic lines the transgene is not specifically expressed in the cells of interest but also additional structures, which hinders the precise tracking of for instance single cells or groups of cells.

Fluorescent photoconvertible proteins are well suited for cell tracking during embryonic development. The prerequisites for the application of such proteins are a long-lived nature, a well-separated emission range upon conversion and bright fluorescence. Available photoconvertible proteins comprise those that change their emission range upon conversion such as Kaede4, KiGR5, mEos26, PS-CFP2 or Dendra27 and others which are only fluorescent when photoactivated (PAmCherry8, PAGFP9 or PATagRFP10). Their applications to track cells in existing FP-transgenic animals are however limited as they often involve a green fluorescent state or do not fulfill all of the above criteria. Only recently, Subach and colleagues reported the PSmOrange protein, which changes its emission from orange/red to far red upon photoconversion and was successfully applied in cells in culture and cultured cells injected into mice2.

To investigate the protein's suitability for cell tracking in a living embryo, we generated an expression construct for the microinjection of nuclear-tagged H2B-PSmOrange into zebrafish embryos. We find that the protein fulfills all prerequisites for successful cell tracking in GFP transgenic backgrounds during the first 4 (and possibly more) days of zebrafish embryonic development. During this time, most of the cell migratory events are completed in fish making the PSmOrange system an excellent addition to the zebrafish toolkit.

протокол

1. Н2В-PSmOrange мРНК In Vitro Транскрипция и мРНК Очистка

  1. Линеаризуем H2B-PSmOrange содержащий шт.2 + плазмиды с помощью фермента рестрикции NotI в соответствии с инструкциями изготовителя.
    Примечание: Выполните следующие шаги, используя соответствующие средства защиты, такие как перчатки и халате, чтобы предотвратить загрязнение и деградацию мРНК.
  2. Очищают линеаризованной ДНК с использованием набора для очистки или фенол-хлороформ методы, основанные ПЦР в соответствии с протоколами производителей.
  3. Используйте 1 мкг линеаризованной ДНК-матрицы для транскрипции Sp6-мРНК в соответствии с инструкциями изготовителя.
  4. Удалить ДНК добавлением 1,0 U РНКазы DNAseI в течение 10-20 мин при 37 ° С.
  5. Очистка мРНК с использованием РНК очистки на комплект в соответствии с протоколом производителя.
  6. Для повышения чистоты мРНК и концентрации, осаждения мРНК путем добавления 6 мкл ацетата натрия (3,0 М, рН 5,2) и 150 мкл 96% этанола. Выдержите мixed раствор при -20 ° С в течение по меньшей мере 30 мин и до 24 ч.
  7. Собирают мРНК, вращая раствора при 18.407 х г в течение 45 мин при 4 ° С. Отменить жидкость и ресуспендируют мРНК в 150 мкл 70% этанола. Смешайте и центрифугировать раствор в течение дополнительных 15 мин при 4 ° С. Откажитесь от жидкости, сушить гранулы в течение 5 минут на льду и ресуспендируют мРНК в 20 мкл сверхчистой РНКазы свободной воды.
  8. Оценка концентрации и чистоты мРНК фотометрического измерения 1: мРНК разбавления 100 (мРНК 1 мкл в 99 мкл сверхчистой РНКазы свободной воды).
  9. Для кратковременного хранения, держать решение мРНК при -20 ° С. Для длительного хранения, держать мРНК при -80 ° С.

2. Н2В-PSmOrange мРНК микроинъекции в эмбрионы рыбок данио

  1. Настройка спаривания парах ночь перед инъекцией с использованием TG (Foxd3: GFP); TG (FLH: GFP) дважды трансгенных рыб (или любой другой GFP трансгенных рыб). Оставьте рыбу разделенных размещения распоркумежду ними, чтобы контролировать время спаривания.
  2. Удалить прокладку утром впрыска и пусть сопряжение рыбы в течение 20 мин.
  3. Во время спаривания, разбавить мРНК Н2В-PSmOrange к конечной концентрации 130 пг / нл (в РНКазы свободной воды) и передача 6 мкл раствора для инъекций в микроинъекции капилляра с использованием наконечника microloader. Проверьте объем впрыска с помощью калиброванного стекло. Отрегулируйте давление впрыска до придать 2 NL решение мРНК (260 PG).
  4. Сбор яйца в стерилизованные пластиковые чашки Петри, содержащей 1x эмбрионов (E3) среде.
  5. Передача от 20 до 30 эмбрионов с инъекционной чашки с помощью пластиковой пипетки Пастера.
  6. Вводят 2 NL мРНК, содержащие раствор в клетке или чуть ниже ячейки в желток на стадии одной клетки 11.
  7. Передача вводили эмбрионы в чашке Петри, содержащей 1x E3 среду, удалить неоплодотворенные или нет нормально развивающихся эмбрионов и выращивать их при 28 ° С.
    Примечание: Светозащита Oе эмбрионов не требуется в течение всего эксперимента.
  8. Повысить эмбрионов данио в 1x E3 среды и добавить 0,2 мм ПТУ (1-фенил-2 тиомочевины) после гаструляции ингибировать пигментацию. Изменение среды дважды в день, чтобы свести к минимуму опасность бактериальных загрязнений.

3. Эмбрион Вложение

  1. Выберите GFP (зеленый) и PSmOrange (оранжевый / красный) коэкспрессирующей эмбрионов с использованием бинокулярного микроскопа, снабженного флуоресценции лампы и соответствующие фильтры выбросов. Перенесите положительные эмбрионов в стерильной чашке Петри, содержащей 1x E3 среду.
  2. Dechorionate эмбрионы под стереомикроскопа с помощью щипцов 12.
  3. Передача одного эмбриона в 1,5 мл пробирку, содержащую 1,0 мл подогретого 1,0% агарозы низкой температурой (LMA), полученного в сверхчистой воды с помощью отключения пипетки (P200). Примечание: Нагреть LMA до 80 ° С и остыть в течение 3-5 минут при комнатной температуре, прежде чем вложение эмбрион.
  4. Передача эмбриона в 150 мкл LMA впатрон покровного стекла и отрегулировать ориентацию эмбриона, например спинной стороной вниз в эксперименте, описанном в перевернутом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии A1R + (или любого другого подходящего микроскопом), с помощью тонкой пластмассовый наконечник. Когда LMA полимеризуется, заполнить камеру с рыбой в воде, содержащей 0,2 мм ПТУ и 0,02% этил-3-аминобензойной метансульфонат (Tricaine) для анестезии.
  5. Перед визуализации образца, подождите 15 минут, чтобы выяснить влияние Tricaine. Анестезии предотвращает движения эмбрион, который можно контролировать с помощью стереомикроскопа, снабженного светлого освещения.
    Примечание: Камеры могут быть повторно использованы в два раза.

4. PSmOrange фотоконверсии

  1. Поместите образец под микроскопом и конфокальной сканирования образца с указанием зоны, чтобы photoconvert использованием 488 нм и 561 нм лазеров для визуализации GFP и PSmOrange соответственно.
    Примечание: Используйте перевернутую конфокальной лазерной сканирующей микроскопии A1R + на перевернутой ГНАGE TiEcontrolled с помощью программного обеспечения визуализации микроскопа и оснащены 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров для фотоконверсии и визуализации. Однако применение, конечно, не ограничено этим микроскопом тех пор, пока лазерные линии для преобразования и обработки изображений доступны.
    1. Поместите цель 20X воздуха в месте (NA: 0,75; WD: 1.0 мм; угол обзора: 0,64 х 0,64 мм).
    2. Используйте следующие параметры микроскопа для обнаружения белка PSmOrange Перед фотоконверсии: 561 нм лазер, 0,74 мВт, измеренную при фокальной плоскости выше цели.
      Примечание: Это соответствует 40% от этой системы (измерение в фокальной плоскости является единственным способом для определения эффективной мощности). Регулировка мощности лазера согласно экспериментальным потребностей как эффективность инъекций Н2В-PSmOrange может меняться.
    3. Добавить факторы масштабирования, чтобы выделить интересующую область. Увеличениями сократить время получения изображений и, следовательно фототоксичности.
  2. Приобретать Z-стек, закрывающую структуруs интерес, используя 488 нм и 561 нм лазеров в последовательном режиме (режим линии 1-> 4). Закрепить Z-шаг между 1,0 и 2,0 мкм. Линия среднем и частота развертки может быть использован для оптимизации качества изображения.
  3. Сканирование образца и выберите интересующую область (ROI) инструмента, чтобы выделить область для photoconvert. Закрепить ROI как область стимуляции. Выберите модуль стока Активация / отбеливания, активировать 488 нм лазер, проверяя соответствующий флажок и установите 488 нм лазер до 80% (1 мВт мощности лазера, измеренный на цели). Установить скорость сканирования до 0,5 сек / кадр.
  4. Откройте фотопреобразования полезность (ND стимуляции) и задайте параметры фотоконверсии.
    1. Нажмите на команду "Добавить", чтобы указать протокол фотопреобразования.
    2. Набор "Фаза" 1 в меню "Приобретение / стимуляции» на «приобретение» и указать количество изображений, которые будут приобретены до фотоконверсии в меню "петли".
    3. Набор "Фаза" 2 "Stimulation "и ввести номер стимуляции событий должны быть выполнены.
    4. Регулировка "Фаза" 3, как описано для "Фаза" 1. Дополнительно, вставить ожидание "Фаза" после "Фаза" 2 при вводе времени, чтобы ждать до последнего раунда получения изображения.
    5. После того как все параметры заданы, применить настройку стимуляции и запустить фотоконверсии.
      Примечание: Мощность лазера, частота сканирования и число итераций для каждого раунда фотоконверсии может варьироваться и отличаться от эмбриона эмбриона. Установка для запуска с показан в таблице 1.
  5. Приобретать окончательное Z-стек, используя 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров применения настроек, как указано выше. Установите 640 нм лазер для визуализации преобразованный PSmOrange используя высокую мощность лазера (до 4,5 мВт).

5. Демонтаж эмбрионов от LMA

  1. Удалить эмбрион, содержащий камеру с микроскопом. Осторожно снимите эмбрион из агарозного Uпеть щипцов.
  2. Передача эмбриона в новом стерилизуют пластиковой чашке Петри или в стерилизованную 6-луночного планшета, содержащего 1x E3 и 0,2 мм ПТУ. Инкубируйте эмбрион при 28 ° С до желаемой стадии развития.

6. Анализируя судьбу Photoconverted PSmOrange белковых клеток, экспрессирующих

  1. Re-внедрить эмбрион, как описано в пунктах 3.3 и 3.4.
  2. Поместите образец под микроскопом и конфокальной сканирования образца для идентификации photoconverted клетки (640 нм) при GFP трансгенной интересующей структуры (488 нм).
  3. Приобретать Z-стек, охватывающий структур, представляющих интерес с помощью 488 нм, 561 нм и 640 нм лазеров в последовательном режиме (режим линии 1-> 4). Закрепить Z-шаг между 1,0 и 2,0 мкм. Линия среднем и частота развертки может быть использован для оптимизации качества изображения.
  4. Используйте один из следующих методов для идентификации клеток, которые взаимодействуют экспресс GFP и photoconverted белок.
    1. На заказ автоматические Фиджи ИзображениеJ Макро 3
      1. Размывания оригинальная стека с помощью "GaussianBlur" плагин (→ Процесс → Фильтры → GaussianBlur) и вычесть гладкую стеки от оригинала с помощью "изображение калькулятора" плагин (→ Процесс → Калькулятор Изображение). Используйте этот шаг, чтобы визуализировать структуры интереса и уменьшить время вычислений для анализа.
      2. Применить определенные пороговые значения на зеленые и дальней красной каналов для того, чтобы подчеркнуть photoconverted клетки (→ Изображение → Настройка → Порог). Используйте "Анализ частиц" инструмент для обнаружения пороговых областей с подходящей настройкой (→ Анализ → Анализ частиц).
      3. Откройте "Изображение Калькулятор" плагин и отображения перекрывающихся трансформирования в зеленом и дальнего красного канала в желтом (→ Процесс → Image Calculator).
    2. ПО для обработки изображений микроскоп для оценки данных 3D
      1. Отображение стека в3D с помощью опции просмотра шоу громкости (→ 3D Визуализация меню → Том View). Используйте графический интерфейс для выбора зеленый, красный и дальнего красного каналов, регулировки яркости и контрастности и обрезать 3D стек, чтобы выделить photoconverted область (рисунок 1).
        Примечание: Подобные методы анализа данных доступны в большинстве популярных программ для анализа изображений.

Результаты

Рисунок 1 иллюстрирует пример системы PSmOrange фотопреобразования. Шишковидной Комплекс представляет собой консервативный структура в позвоночных спинной промежуточного мозга. Как и во многих других позвоночных, этот комплекс состоит из шишковидной органа в ?...

Обсуждение

Трансгенные эмбрионы, несущие флуоресцентные журналистам помогли принципиально понять эмбриональное развитие. Тем не менее, есть еще насущную необходимость промоторов для облегчения конкретного визуализацию конкретных конструкций. В их отсутствие, исследователи опираются на метод...

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We thank O. Subach for providing the original H2B-PSmOrange plasmid and our fish facility team for fish care. We are grateful to the Nikon Imaging Center at the University of Heidelberg for access to microscopy equipment and analysis software. We acknowledge the support of the Core Facility Live Cell Imaging Mannheim at the CBTM (DFG INST 91027/10-1 FUGG). This work was supported by the Excellenzcluster CellNetworks, EcTop Spatio-temporal coordination of signaling processes (EcTop 2), University of Heidelberg to C.A.B. and the Medical Faculty Mannheim of the University Heidelberg and the DFG (FOR 1036/2, 298/3-1 and 298/6-1) to M.C.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
PCR Purification KitQiagen28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 Transcription kitAmbionAM1340
RNeasy MiniElute Cleanup kitQiagen74204
Plastic Pasteuralpha laboratoriesLW4000
Original H2B-PSmOrange PlasmidAddgene31920The plasmid described in the paper is available in the Carl lab
FemtoJet MicroinjectorEppendorf5247 000.013
Forceps (5 Inox)NeoLab2-1633
Lab-Tek II Chambered #1.5 German Coverglass System Nunc155382
Nikon A1R+Nikon GmbH GermanyNo Number
Nikon PLAN Apo λ 20X air objective Nikon GmbH GermanyNo Number
NIS Elements AR Software (v. 4.30.02)Nikon GmbH Germany/Laboratory ImagingNo Number

Ссылки

  1. Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (4350), (2012).
  2. Subach, O. M., et al. A photoswitchable orange-to-far-red fluorescent protein, PSmOrange. Nature Methods. 8, 771-777 (2011).
  3. Beretta, C. A., Dross, N., Bankhead, P., Carl, M. The ventral habenulae of zebrafish develop in prosomere 2 dependent on Tcf7l2 function. Neural Development. 8, 19 (2013).
  4. Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12651-12656 (2002).
  5. Habuchi, S., Tsutsui, H., Kochaniak, A. B., Miyawaki, A., van Oijen, A. M. mKikGR, a monomeric photoswitchable fluorescent protein. PLoS One. 3, e3944 (2008).
  6. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nature Methods. 6, 131-133 (2009).
  7. Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2. Nature Protocols. 2, 2024-2032 (2007).
  8. Subach, F. V., et al. Photoactivatable mCherry for high-resolution two-color fluorescence microscopy. Nature Methods. 6, 153-159 (2009).
  9. Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. Science. 297, 1873-1877 (2002).
  10. Subach, F. V., Patterson, G. H., Renz, M., Lippincott-Schwartz, J., Verkhusha, V. V. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color super-resolution sptPALM of live cells. J Am Chem Soc. 132, 6481-6491 (2010).
  11. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
  12. Concha, M. L., et al. Local tissue interactions across the dorsal midline of the forebrain establish CNS laterality. Neuron. 39, 423-438 (2003).
  13. Auer, T. O., Duroure, K., Concordet, J. P., Del Bene, F. CRISPR/Cas9-mediated conversion of eGFP- into Gal4-transgenic lines in zebrafish. Nature Protocols. 9, 2823-2840 (2014).
  14. Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome Research. 24, 142-153 (2014).
  15. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

108PSmOrange

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены