Разработка и проверка количественной ПЦР метод для Equid герпесвирусных-2 Диагностика в Респираторные жидкостям

Резюме

Here, we present a protocol for the development and validation of a quantitative PCR method used for the detection and quantification of EHV-2 DNA in equine respiratory fluids. The EHV-2 qRT-PCR validation protocol involves a three-part procedure: development, characterization of qRT-PCR assay alone, and characterization of the whole analytical method.

Аннотация

The protocol describes a quantitative RT-PCR method for the detection and quantification of EHV-2 in equine respiratory fluids according to the NF U47-600 norm. After the development and first validation step, two distinct characterization steps were performed according to the AFNOR norm: (a) characterization of the qRT-PCR assay alone and (b) characterization of the whole analytical method. The validation of the whole analytical method included the portrayal of all steps between the extraction of nucleic acids and the final PCR analysis.

Validation of the whole method is very important for virus detection by qRT-PCR in order to get an accurate determination of the viral genome load. Since the extraction step is the primary source of loss of biological material, it may be considered the main source of error of quantification between one protocol and another. For this reason, the AFNOR norm NF-U-47-600 recommends including the range of plasmid dilution before the extraction step. In addition, the limits of quantification depend on the source from which the virus is extracted. Viral genome load results, which are expressed in international units (IU), are easier to use in order to compare results between different laboratories.

This new method of characterization of qRT-PCR should facilitate the harmonization of data presentation and interpretation between laboratories.

Введение

Equid герпесвирус-2 (СВН-2) участвует в респираторный синдром, с возможными клиническими проявлениями , такими как выделения из носа, фарингит и увеличение лимфатических узлов ^1-3. Этот вирус также подозревается быть связаны с плохой производительности лошадей, которые могут привести к значительным и негативным экономическим последствиям для промышленности лошади ^2.

До сих пор золотым стандартом для гамма-СВН обнаружения (γ-СВН) был метод культивирования клеток. Первое неудобство этой процедуры было отсутствие дискриминации между СВН-2 и других g-СВН (например, СВН-5). Второе неудобство было медленное развитие цитопатического процесса, который занимает от 12 до 28 дней , чтобы проявить ^4,5.

Разработка проверенного и нормированной количественного в режиме реального времени полимеразной цепной реакции (QRT-PCR), метод поможет быстро обнаружить вирус, различать EHV-2 и EHV-5 и изучить взаимосвязь между вирусным геномом нагрузкой и болезнь благодаря аспекту квантификации.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) был описан впервые в 1986 году Маллис ⁶ и собирается стать новым золотым стандартом в большинстве областей биологической диагностики (человека, окружающей среды и ветеринарии). Этот метод, который основан на амплификации части генома патогенных микроорганизмов, имеет много преимуществ: точность, чувствительность и быстроту. Кроме того, риск загрязнения ампликона отступала с момента появления QRT-PCR и обеспечения качества ^7. Тем не менее, признание ПЦР в качестве нового метода золотого стандарта потребовало больше, чем просто улучшенные эксплуатационные данные, но и демонстрацией контроля разработки и валидации этапов всего метода без деградации производительности с течением времени.

Первые молекулярные инструменты, используемые для обнаружения СВН-2 были время Consuming и участвует неспецифическая амплификации с гнездовой ПЦР с последующим секвенированием ^8. Целевые гены вирусов герпеса были дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) полимеразы и ДНК упаковки ^9. Тем не менее, гнездовую ПЦР представляет высокий риск загрязнения ампликонов. С тех пор традиционные тесты ПЦР были разработаны , чтобы усилить интерлейкин 10-подобный ген или гликопротеина ген B, рецензия в 2009 году ^2. Совсем недавно, ПЦР в реальном времени характеристики были описаны для количественного определения СВН-2 ¹⁰ , но никакие данные не были доступны относительно проверки достоверности всего метода в том числе в процессе экстракции.

В этом протоколе, процедуры разработки и проверки описаны для количественного метода ПЦР для обнаружения и определения количества СВН-2 ДНК в лошадиных дыхательных жидкостях по данным Ассоциации Французское нормализации (AFNOR) норма NF U47-600 ^3,11,12, который является представителем Франции вмеждународный комитет по нормализации. Эта норма детализирует "Требования и рекомендации по внедрению, развитию и проверке ветеринарной ПЦР в методе анализа здоровья животных" ^11,12, в соответствии с NF EN ISO / CEI 17025, 2005 ¹³ и МЭБ (Всемирной организации по охране здоровья животных) . рекомендации, 2010 ¹⁴ протокол проверки QRT-PCR СВН-2 включает в себя процедуру , состоящую из трех частей: (а) развитие анализа QRT-PCR, (б) Характеристику QRT-ПЦР в покое и (с) характеристика целого аналитический метод (от экстракции нуклеиновых кислот из биологического образца ПЦР-анализа).

Характеристика анализа QRT-PCR и всего аналитического метода включают в себя определение двух пределов: предел обнаружения (LOD) и предел количественного определения (LOQ). УД _{95% ПЦР} представляет наименьшее количество копий нуклеиновых кислот в единице объема , которые могут быть обнаружены в 95% всех случаев КАСэс. ПКО _{95% ПЦР} представляет наименьшее количество копий нуклеиновых кислот , которые могут быть определены с учетом неопределенностей.

Этот метод QRT-ПЦР позволяет точное обнаружение и быстрое определение количества EHV-2 в дыхательных жидкостей. Кроме того, этот метод может быть применен и в других лабораториях, чтобы обеспечить стандартную процедуру и в качестве общего шаблона для разработки других новых анализов QRT-PCR.

протокол

Примечание: Обратитесь ко всем различным шагам , которые показаны на рисунке 1.

1. Извлечение нуклеиновых кислот

Примечание: Выполните извлечение под вытяжкой для ограничения загрязнения воздушной трассы с нуклеиновыми кислотами. Включите экстракционную отрицательный контроль с DEPC-обработанной воды, чтобы гарантировать, что ни один из реагентов не загрязнены нежелательной ДНК.

1. Экстракт нуклеиновых кислот из биологического образца , в соответствии с описанным ранее протоколом протокола ¹⁵ и изготовителя.
   1. Добавьте 140 мкл биологического образца до 560 мкл раствора для лизиса (AVL буфера) и инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре. Добавить 560 мкл этанола. Нанесите первый 630 мкл этого раствора (образец + + лизис раствор + этанол) на колонке с силикагелем и центрифугой.
   2. Применить оставшиеся 630 мкл этого раствора в той же колонке с диоксидом кремния и центрифуге. Затем колонку промывают 500 мклиз 2-х различных буферов промывки (AW1 и aw2).
2. Элюции нуклеиновой кислоты с 50 мкл буфера для элюции (ПР буфер) и уравновешивают до комнатной температуры. Закройте крышку и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 мин. Центрифуга при 6000 г в течение 1 мин.

2. Процедура Amplification

1. Готовят 22,5 мкл реакционной смеси для каждой реакции. Добавить 12,5 мкл ПЦР мастер-смеси, х мкл 20 мкМ прямого праймера, х мкл 20 мкМ обратного праймера, у мкл 10 мкМ зонда и Z мкл сверхчистой воды, необходимое для достижения 22,5 мкл (х, у и г объемы получаются после титрования, см разделы 3.2.3 и 3.2.6).
2. Аликвоты 22,5 мкл соответствующей реакционной смеси в каждой реакции на лунку в 96-луночный планшет.
   Примечание: Включите отрицательный контроль для экстракции и для ПЦР, чтобы гарантировать, что ни один из реагентов не загрязнены нежелательной ДНК.
3. Добавить 2,5 мкл образца, 2,5 мкл экстракционного Negativуправление е, 2,5 мкл ПЦР-отрицательного контроля и 2,5 мкл положительного образца (эталонного штамма или плазмиды) к соответствующей реакции скважины. После распределения, покрывают пластину с клейкой пластины уплотнения. Центрифуга пластину в течение 10 сек при 6000 г.
4. Поместите пластину в реальном времени системы ПЦР. Выберите шаблон для макета анализа и запустить прогон. С помощью установки программы PCR: 10 мин при 95 ° С , а затем 45 циклов 15 с при 95 ° С и 1 мин при 60 ° С (таблица 1).
5. Передача необработанных данных из системы реального времени ПЦР в электронную таблицу. Установите порог на графиках амплификации выше базовой линии и в пределах экспоненциальной области роста для получения порогового цикла для каждого образца. Сюжет каждой стандартной точки установить в качестве стандартной кривой для получения линейности. Подсчитайте число копий для различных образцов на основе стандартной кривой.

3. Разработка количественного RT-PCR

Примечание: Разработка теста QRT-PCR требует эталонных штаммов, специфическую титруемой плазмиды, а также различные элементы управления и влечет за собой титрование праймеров и зонда.

1. Предварительное испытание
   1. Дизайн праймеры и зонды с определенным программным обеспечением в соответствии с предыдущими рекомендациями ^16.
   2. Извлечение эталонных штаммов, как описано в разделе 1.
   3. Amplify, как описано в разделе 2, с 900 нМ для конечной концентрации праймеров и 250 нМ для конечной концентрации зонда. Анализ сигнала, как описано в разделе 2.5.
   4. В то же время, выполняют усиление эталонных штаммов ДНК (как описано в разделе 3.1.3) без зондов. Последовательность ампликонов , полученных методом Sanger ^17,18. Анализ последовательности, запустив нуклеотидную BLAST ^19.
2. Титрование грунтовок и Probe
   1. Подготовьте 3 различные смеси с 250 нМ конечной концентрации зонда и с разной окончательной Концференционных с прямого и обратного праймеров (50 нМ / 50 нМ, 300 нМ / 300 нм, 900 нм / 900 нм) в течение 3-х повторах положительного образца и отрицательного контроля. Для каждой смеси, добавить один и тот же соответствующий объем 20 мкМ прямого праймера и 20 мкМ обратного праймера (0,25 мкл для получения конечной концентрации 50 нМ, 1,5 мкл, чтобы получить 300 нм конечной концентрации или 4,5 мкл для получения конечной концентрации 900 нМ) , 50 мкл ПЦР-смеси мастер-микс, 2,5 мкл 10 мкМ зонда и сверхчистой воды по мере необходимости, чтобы достигнуть 90 мкл.
   2. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
   3. Выберите лучшие условия для получения высокого уровня усиления, ранний пороговый цикл (Ct) и лучший воспроизводимость между 3 условий. Определить лучшую концентрацию и объемом х мкл прямого и обратного праймеров.
   4. Подготовьте 5 различных смесей для 4 образцов (3 повторов положительного образца и отрицательного контроля)с 5 различных конечных концентраций зонда (50 нМ, 100 нМ, 150 нМ, 200 нМ, 250 нМ). Для каждой смеси, добавить х мкл 20 мкМ прямого праймера и х мкл 20 мкМ обратного праймера (ранее определенной в разделе 3.2.3), 50 мкл ПЦР смеси мастер-микс, соответствующий объем 10 мкМ зонда (0,5 мкл, чтобы получить 50 концентрация нМ, 1 мкл, чтобы получить концентрацию 100 нМ, 1,5 мкл, чтобы получить концентрацию 150 нМ, 2 мкл, чтобы получить концентрацию 200 нМ или 2,5 мкл, чтобы получить концентрацию 250 нМ) и сверхчистой воды, сколько требуется для достижения 90 мкл.
   5. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
   6. Выберите лучшие условия для получения самого высокого уровня усиления, ранний пороговый цикл (Ct) и лучшая повторяемость между 5 условий. Определить лучшую концентрацию и соответствующий объем у мкл для зонда.

4. Характеристика количественного Reaл времени ПЦР (QRT-PCR)

Примечание: После того, как стадия развития и определение наилучших условий для использования, стадия характеризации PCR включает специфичность, предел обнаружения, диапазон линейности и предел количественного QRT-PCR.

1. Приготовление и титрование плазмиды
   1. Заказать коммерческую плазмиду , содержащую соответствующий фрагмент ДНК - мишень гена , выбранного для ПЦР (в данном протоколе, нуклеотиды 2081-2381 из СВН-2 гена гликопротеина B, таблица 1).
      Примечание: Для того, чтобы ограничить риск загрязнения воздушной трассы с синтетической ДНК, выполняют серийные разведения плазмид под вытяжкой в ​​отдельной комнате и работать с разбавленным ДНК во всех этапах разработки и процедуры проверки.
   2. Повторное приостановить плазмиду сверхчистой водой, чтобы приготовить исходный раствор, при 50 нг / мл. Vortex и центрифуги кратко плазмиду раствор.
      Примечание: Определить реальную концентрацию плазмиды STOск раствор после повторного суспендирования для расчета количества копий плазмиды.
   3. Добавляют 1 мкл плазмиды в спектрофотометр. Считать оптическую плотность (OD) при 230 нм, 260 нм и 280 нм. Считать концентрацию ДНК на спектрофотометре программного обеспечения (OD, 260 нм).
   4. Подсчитайте число копий плазмиды , используя число Авогадро (N _A) и формулу:
      Номер экземпляра / мкл = (N _A [плазмида в нг / мкл]) / (плазмида длина х 10 ⁹ х средний вес пары оснований) = (6,022 х 10 ²³ х [плазмида]) / (плазмида длина х 10 ⁹ х 660)
2. Тестирование специфичностью (инклюзивности и эксклюзивности) в QRT-PCR
   1. Проверьте инклюзивность системы ПЦР. Выберите СВН-2 положительных образцов ДНК, ранее характеризуется секвенирования (установленный позитивный статус).
   2. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
   3. АнализируйтеПЦР-данные для каждого образца, как это описано в разделе 2.5. Проверьте наличие экспоненциальной кривой для всех образцов, выбранных в разделе 4.2.1 и подтвердить инклюзивность ПЦР.
   4. Испытание исключительность системы ПЦР с использованием экстрактов ДНК из патогенов с генетического сходства с мишенью (в данном случае, другие equid вирусы герпеса, такие как EHV-1, EHV-4, СВН-3, EHV-5 и ослиного герпесвирусов-5, как описано в таблице 2) и других патогенных микроорганизмов , участвующих в заболеваниях дыхательных путей хозяина (в данном случае, лошадиный вирус артериита, вирус гриппа лошадей, Coxiella burnetii, Rhodococcus оборудов, Streptococcus Equi обор, Streptococcus Equi zooepidemicus, Chlamydophila выкидыш и Klebsiella пневмонии, смотри таблицу 2).
   5. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
   6. Анализ данных ПЦР для каждого образца, как описано в разделе 2.5. Проверьте отсутствие экспоненциальной кривой для всех образцов выбраныраздел 4.2.4, чтобы подтвердить исключительность ПЦР.
3. Предел обнаружения QRT-PCR
   1. Распределить 90 мкл сверхчистой воды в 6 трубок.
   2. Выполните 6 десятикратных серийных разведений плазмиды для целевой зоны снижения степени загрязнения (обнаружение потери Ct). Перенесите 10 мкл из плазмиды готовый раствор в пробирку 90 мкл сверхчистой воды. Vortex и кратко центрифуге трубки. Повторите шаг 4.3.2 до последней трубки в серийном разведении получил плазмиду.
   3. Выполните усиление 6 десятикратных серийных разведений плазмиды, как описано в разделе 2.
   4. Определить зону борьбы с выбросами: зона между последним разведением плазмиды , представляющей положительный сигнал и первое разведение без обнаружения (см рисунок 2).
   5. Для того, чтобы начать 6 двукратных серийных разведений, выбирают последнее разведение плазмиды, которая дает положительный сигнал (смотри раздел 4.3.4).
      Примечание: Выполните 3 независимых три-ALS для определения предела обнаружения QRT-PCR (LOD _{95% ПЦР)}
   6. 25 мкл сверхчистой воды в 6 трубок.
   7. Выполните 6 двукратные серийные разведения плазмиды. Перенесите 25 мкл из готового раствора плазмиды, как определено в разделе 4.3.5, в пробирку 25 мкл сверхчистой воды. Vortex и кратко центрифуге трубки. Повторите шаг 4.3.7 до последней трубы в серийном разведении получил плазмиду.
   8. Выполните усиление 6 двукратных серийных разведений плазмиды, как описано в разделе 2. Повторите шаги 4.3.7 на 4.3.8 дважды, чтобы получить 3 испытания с 8 повторами (24 повторах) каждого из 6 десятикратном дублированные серийные разведения плазмиды.
      Примечание: Предел обнаружения QRT-PCR (LOD _{95% ПЦР)} определяется как наименьшее число копий ДНК единицей объема , который определяется в 95% случаев.
   9. Подсчитать количество положительных повторах из 24 повторах для каждого уровня плазмиды Concentraции.
   10. Определить LOD _{95% ПЦР.} УД _{95% ПЦР} является уровень , который приводит к обнаружению 23 положительных повторностях из 24 повторах.
4. Линейность Диапазон и предел Количественное QRT-PCR
   Примечание: Выполните 4 независимых испытаний 6 десятикратных серийных разведений плазмиды , чтобы гарантировать , что самая низкая концентрация , используемая в диапазоне соответствует УД _{95% ПЦР} предварительно определенной в 4.3.10.
   1. Распределить 45 мкл сверхчистой воды в 6 трубок.
   2. Запуск 6 десятикратном серийных разведений с концентрацией рабочего разведения плазмиды , соответствующей 10 ⁷ LOD _95% ПЦР.
   3. Выполните 6 десятикратных серийных разведений плазмиды. Передача 5 мкл из рабочего разведения плазмиды (определено в разделе 4.4.2) в пробирку с 45 мкл сверхчистой воды. Vortex и кратко центрифуге трубки. Повторите шаг 4.4.3 до последней трубы в серийном разведении получил рlasmid.
   4. Усиливающий 6 десятикратном серийные разведения плазмиды, как описано в разделе 2.
   5. Трассировка линейной регрессии у = ах + Ь с для наклона и Ь для перехвата (рисунок 3).
   6. Расчет эффективности амплификации (E) с угловым коэффициентом а стандартной кривой (см 4.4.5) с помощью уравнения:
      ,
      Повторите шаги 4.4.1 4.4.6 трижды.
      Примечание: эффективность амплификации представляет величину увеличения ПЦР-продукта после каждого цикла. Идеальная реакция достигает КПД, близкий к 100%. На практике, Е (%) составляет от 75% до 125%. Выше Е может указывать на усиление неспецифических продуктов или ошибки пипетирования в серийном разведении. Нижняя Е также может указывать на ошибку пипетирования в серийном разведении, плохой дизайн грунтовки или неоптимальных условиях реакции.
   7. Вычислить смещение (табл3). Проверьте , для каждого уровня плазмиды , что абсолютное значение смещения меньше критического значения смещения (0,25 log _10). Определить среднее смещение и линейность неопределенности (U _Лини) для каждого уровня плазмиды (таблица 3) , чтобы оценить производительность линейной регрессии для СВН-2 кПЦР (рисунок 4). U _Лини является неопределенность линейности определяется для каждого я плазмиде уровень рассчитывается от стандартного отклонения (SD'i) и средний уклон. Определить суммарную неопределенность линейности (U _Lin) из СВН-2 кПЦР , определяемая по формуле:
      
      Примечание: Прием смещения определяется лабораторией (в общем случае абсолютного смещения 0,25 log ₁₀₎ и соответствовать разнице между наименьшим значением и наибольшим значением 0,5 log ₁₀ (измеряемой величины в лог ₁₀ числа копий). U _LIN значение может помочь сравнить производительность кПЦР из разных лабораторий.
   8. Определить предел квантификации QRT-ПЦР (ПКО) _ПЦР: ПКО _ПЦР представляет собой наименьшую концентрацию с уклоном 0,25 log ₁₀ , используемый для диапазона линейности (таблица 3).

5. Характеристика полного аналитического метода (от ДНК к экстракции Результат QRT-PCR)

Примечание: Характеристика всего метода является проверка всех шагов , необходимых для получения данных QRT-PCR (т.е. от извлечения ДНК из дыхательного образца (смотри раздел 1) для амплификации и количественного определения мишени (смотри раздел 2 )).

1. Установить соответствие между числом копий в ПЦР-реакции и копии числа присутствующих в биологическом образце с формулой:
   ,
   Это число копий плазмиды в ПЦР-реакции, является объем образца добавляют к ПЦР для амплификации перемешайте, это объем буфера используется для AVE элюции нуклеиновых кислот и есть объем извлеченного образца.
2. Проверьте чувствительность и специфичность полного аналитического метода
   Примечание: Только известные СВН-2 положительных (или отрицательных) образцы используются в этом разделе.
   1. Тест «чувствительность» метода QRT-PCR путем анализа положительных образцов для мишени (EHV-2).
      1. Выберите СВН-2 положительных образцов ДНК, ранее охарактеризован (положительный статус).
      2. Извлечение нуклеиновой кислоты, как описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
      3. Определить количество реальных положительных результатов (положительных образцов, которые положительны при этом RT-PCR), а число ложно отрицательных результатов (известные положительные образцы, которые являются отрицательными при этом RT-PCR).
   2. Тест "специфичность" метода QRT-PCR путем анализа отрицательных образцов
      1. Выберите СВН-2 отрицательных образцов ДНК (отрицательный статус).
      2. Извлечение нуклеиновой кислоты, как описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
      3. Определить количество реальных негативов (отрицательные образцы, которые, как известно, быть отрицательным с этим RT-PCR) и количество ложных срабатываний (известные отрицательные образцы, которые являются положительными с этой RT-PCR).
   3. Вычислить "диагностическую чувствительность" (Se) и "Диагностическая специфичность" (Sp) всего метода (таблица 4) следующим образом : Se = число вещественных положительных / (число действительных положительных + ложных негативов) и Sp = число реальных негативы / (количество реального негативаs + ложных срабатываний) (таблица 4).
   4. Рассчитывают 95% доверительный интервал для чувствительности и специфичности всего метода с формулой Greiner и Гарднера отношение ^12,20:
      
      где е оцененная ошибка, θ является Se (или Sp) и п число анализируемых образцов.
      Примечание: Для небольшого количества образцов, с помощью таблицы Schwartz согласно AFNOR норме ¹² для расчета 95% доверительного интервала для чувствительности и специфичности всего метода.
3. Получение отрицательного материальных ресурсов для определения характеристик полного аналитического метода
   ВНИМАНИЕ: Для того, чтобы определить пределы обнаружения и количественного определения всего метода (LOD _метод и _метод ПКО), добавляют известные концентрации плазмиды биологических образцов , которые , как известно , чтобы быть свободныммишени (СВН-2 в данном случае). Эти образцы, наряду с количественной плазмиды, представляют собой положительные стандарты , с помощью которых для определения LOD _метода и _метода LOQ.
   1. Подтвердите отсутствие мишени (СВН-2) в биологических образцах, используемых для построения позитивных стандартов.
      1. Выберите различные известные отрицательные биологические образцы.
      2. Извлечение биологических образцов, как описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
      3. Подтвердить отсутствие цели отсутствием ПЦР-сигнала в этих образцах.
         Примечание: Используйте тот же отрицательный материал ресурса для всех шагов между 5.4 и 5.5.
   2. Объединяют различные отрицательные образцы, чтобы получить 15 мл отрицательного материала ресурса (тома, необходимую для полной проверки). Разлить 135 мкл этого негативного материала ресурсов в 100 труб. Хранить пробирки при температуре + 4 ° С или при -80 ° С для длительного хранения.
4. Limiт определение общего аналитического метода
   1. Определить зону борьбы с выбросами всего метода.
      1. Распределить 45 мкл сверхчистой воды в 6 трубок.
      2. Выполните 6 десятикратных серийных разведений плазмиды. Передача 5 мкл из готового раствора плазмиды , соответствующей 10 ⁷ LOD _{95% ПЦР} (как определено в разделе 4.3.10) в пробирку с 45 мкл сверхчистой воды. Vortex и кратко центрифуге трубки. Повторите шаг 5.4.1.2 до последней трубы в серийном разведении получил плазмиды.
      3. Передача 5 мкл из каждого разведения плазмиды 2 пробирки с 135 мкл отрицательного материала ресурса для получения 2 реплицируется для 6 положительных стандартов. Vortex и кратко центрифуге.
      4. Выполните извлечение из 2-х повторах для 6 положительных стандартов, как описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
      5. Определить зону борьбы с выбросами: зону между последним концentration плазмиды дает позитивный сигнал и первую концентрацию, которая не показывает никакого сигнала.
   2. Предел обнаружения метода (LOD _метод) Определяется 2 независимых испытаний
      Примечание: Выполните 2 независимых испытаний для определения предела обнаружения всего метода (LOD _метод).
      1. Запуск 6 двукратных серийных разведений с рабочим разведением плазмиды, что в 4 раза более концентрированным, что последняя концентрация плазмиды, которая дала положительный сигнал (смотри раздел 5.4.1.5).
      2. 25 мкл сверхчистой воды в 6 трубок.
      3. Выполните 5 двукратные серийные разведения плазмиды. Перенесите 25 мкл из плазмиды рабочее разведение (как определено в разделе 5.4.2.1) в пробирку 25 мкл сверхчистой воды. Vortex и кратко центрифуге трубки. Повторите шаг 5.4.2.3 до последней трубы в серийном разведении получил плазмиды.
      4. Передача 5 мкл из каждого разведения plasmid 4 пробирки с 135 мкл отрицательного материала ресурса для получения 4 повторов 5 позитивных стандартов. Vortex и кратко центрифуге трубки.
      5. Выполните извлечение из 4-х повторах для 5 положительных стандартов, как описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
      6. Повторите шаги 5.4.2.1 для 5.4.2.5 один раз, чтобы получить 8 повторов для каждого уровня концентрации плазмиды.
      7. Подсчитайте количество положительных повторах из 8 повторов для каждого уровня концентрации плазмиды.
      8. Определение _метода LOD. _Метод УД является последним уровнем , на котором 8 размножается из 8 повторности являются положительными (как описано в разделе 5.4.2.7).
5. Линейность Диапазон и предел количественного определения полного состава аналитического метода
   Примечание: Для определения предела количественного определения всего метода (ПКО _метод), добавляют известные концентрации плазмиды биологическимОбразцы, которые, как известно, быть свободным от цели (EHV-2 в данном случае). Эти образцы представляют собой положительные стандарты для определения _метода LOQ.
   1. Распределить 45 мкл сверхчистой воды в 6 трубок.
   2. Выполните 6 десятикратных серийных разведений плазмиды. Передача 5 мкл из готового раствора плазмиды , соответствующей 10 ⁷ LOD _метода (как определено в разделе 5.4.2.8) в пробирку с 45 мкл сверхчистой воды. Vortex и кратко центрифуге трубки. Повторите шаг 5.5.2 до последней трубы в серийном разведении получил плазмиду.
   3. Передача 5 мкл из каждого разведения плазмиды в 2 пробирки с 135 мкл отрицательного материала биологических ресурсов для получения 2 повторов 6 позитивных стандартов. Vortex и кратко центрифуге.
   4. Выполните извлечение из 2-х повторах для 6 положительных стандартов, как описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2. Повторите шаги 5.5.1до 5.5.4 трижды.
   5. Определение точности профиля с целью оценки и проверки достоверности количественных показателей метода.
      1. Определить границы приемлемости всего метода для лаборатории. В этом протоколе, пределы приемлемости определяются как ± 0,75 log ₁₀ по Лабеон Франк Duncombe.
      2. Для одного испытания, проследить первый линейной регрессии у = ах + Ь (а это наклон и б является перехватывать) с одной повторности значений Ct , соответствующих каждому расчетной стоимости стандартной кривой. С этой первой линейной регрессии, вычисляют экспериментальное значение числа копий для повторах значений Ct, используемых для этой первой стандартной кривой. Повторите шаг 5.5.5.2 со вторыми повторах значений Ct для получил второе линейной регрессии и рассчитать экспериментальное значение числа копий для второго повторах значений Ct, используемых для второй стандартной кривой.
      3. Повторите шаг 5.5.5.2 со вторым и третьим испытаний.
      4. Вычислить пределы точности, правильности и точности для каждого уровня плазмиды в соответствии с NF U47-600-2 ^12.
      5. Создайте таблицу, чтобы собрать информацию для всех стандартных точек (5.5.5.4) и создать профиль точности с ранее определенными пределами приемлемости в 5.5.5.1 и Достоверность данных вместе с нижним и верхние пределы точности, рассчитанного в 5,5 .5.4 (рисунок 5).
   6. Определение _метода LOQ: это соответствует самой низкой концентрации стандартной кривой с Достоверность 0,75 log _10, используемый для диапазона линейности , рассчитанной в 5.5.5.5.
6. Оценка повторяемости и воспроизводимости
   Примечание: Проверьте повторяемости и воспроизводимости результатов, используя соотношение между стандартным отклонением и среднее повторных измерений (коэффициент вариации, или CV = стандартное отклонение /имею в виду).
   1. Оценка воспроизводимости всего метода 1 Аналитик:
      1. Выберите 3 биологических образцов с 3-х различных вирусной нагрузки генома (ранее испытанных в ПЦР, например).
      2. Выдержка 8 повторов в 3-х образцах, как это описано в разделе 1. Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2.
      3. Рассчитывают среднее значение и стандартное отклонение величины Ct , собранных для каждого образца.
      4. Рассчитывают внутри анализа резюме с использованием формулы CV = стандартное отклонение / среднее.
   2. Оценка воспроизводимости всего метода на 3 Аналитики:
      1. Выберите 3 биологических образцов с 3-мя различными нагрузками вирусного генома (ранее испытанных в ПЦР, например)
      2. Извлечь 2 повторах из 3-х образцов, выбранных в 5.6.2.1 (как описано в разделе 1). Выполните процедуру амплификации, как описано в разделе 2. Повторите шаги 5.6.2.2 на 2 независимых аналитиков.
      3. Вычислить среднее и стандартное отклонениезначения Ct , собранных для каждого образца.
      4. Рассчитывают между анализами CV с использованием формулы CV = стандартное отклонение / среднее.

Результаты

Количественный метод RT-PCR, как описано выше, был осуществлен с целью выявления и количественной оценки equid вирус герпеса-2 в дыхательных жидкостях. На рисунке 1 показана схематическая диаграмма процесса для разработки и проверки количественного метода RT-PCR в соответствии с AFNOR норма NF U47-600. Специфичность праймеров и зондов в ходе разработки шаг за шагом ПЦР были подтверждены. Только СВН-2 штамма амплифицировали в этой системе. Впоследствии производительность QRT-PCR были быть охарактеризованы.

Во - первых, для оценки LOD _ПЦР, 6 десять раз серийное разведение было проведено с целью установления зоны борьбы с выбросами (Рисунок 2). В этом примере, были сделаны 6 десятикратном серийных разведений в диапазоне от 10 ^-5 до 10 ^-10 (между 26000 и 0,26 копий / 2,5 мкл образца) для оценки LOD _ПЦР. Зона борьбы с выбросами лх годов между разведениями 10 ^-9 до 10 ^-10 (от 2,6 до 0,26 копий / 2,5 мкл образца). Для определения значения LOD _ПЦР в данном случае, были сделаны 6 двукратные серийные разведения плазмиды в этой зоне очистного между 5,2 и 0,16 копий / 2,5 мкл образца. Значение LOD _PCR составил 2,6 копий / 2,5 мкл образца.

Для определения диапазона линейности и LOQ _ПЦР, значение LOD _ПЦР использовали , чтобы начать диапазон 6 десять-кратных серийных разведений, между 2,6 (LOD _ПЦР) и 260000 копий / 2,5 мкл образца. Рисунок 3 иллюстрирует линейную регрессию для EHV2 QRT-ПЦР из одного суда. Рабочие характеристики линейной регрессии (рисунок 4) проверяются в четырех экземплярах с помощью расчетов , описанных в таблице 3. Расчеты выполнены для определения диапазона линейности в соответствии с критериями абсолютной Уклон _I Вэлуе ≤0.25 log _10, независимо от уровня I плазмиды нагрузки. В этом случае линейности диапазона лежат между 2,6 и 260000 копий / 2,5 мкл образца. ПКО _ПЦР является самой низкой концентрации в диапазоне от линейности (т.е. 2,6 копий / 2,5 мкл образца в данном случае). У _ЛИН был определен как 0,12 log ₁₀ в диапазоне 2.6-260,000 копий / 2,5 мкл ДНК.

После развития (рисунок 1, синий) и характеристика QRT-PCR (фиг.1, желтый), то AFNOR NF U47-600 норма рекомендует характеристику всего аналитического метода экстракции ДНК из к QRT-PCR (фиг.1, оранжевый). Диагностическая чувствительность и специфичность были рассчитаны , как описано в таблице 4. Количественные характеристики целого аналитического метода QRT-ПЦР была оценена и подтверждена с профилем точности ( Рисунок 5).

Этот протокол, который использует состоянии самой современной технологии молекулярной, позволило выявить и количественно оценить уровень вирусной нагрузки генома СВН-2 в 172 носовых мазков, полученных от лошадей с дыхательными расстройствами и / или клиническим подозрением на инфекцию. Заболеваемость СВН-2 из полевых (биологических) образцов составила 50% (86/172) в этой группе населения. Количественные анализы показали , что вирусный геном нагрузок СВН-2 были значительно выше у молодых лошадей и передел вирусной нагрузки генома уменьшается с возрастом (рисунок 6). В настоящем исследовании, самый высокий СВН-2 вирусный геном нагрузки (1,9 × 10 ¹¹ копий / мл) был обнаружен у жеребят (рисунок 6).

Рисунок 1: Диаграмма рабочего процесса для разработки (синий), характеристика количественного RT-PCR(желтый) и характеристика всего аналитического метода экстракции ДНК из к QRT-PCR (оранжевый) в соответствии с нормой AFNOR NF U47-600-2. Диаграмма рабочего процесса возобновляет различные шаги для развития, характеристика количественного RT -PCR и характеристика всего аналитического метода экстракции ДНК из к QRT-PCR. Для каждого шага, рабочий процесс диаграмма показывает количество необходимых трасс, разбавление необходимо выполнить , и количество необходимых аналитиков. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Определение зоны борьбы с выбросами с представительными результатами в режиме реального времени кривых ПЦР , полученные с 6 десятикратных серийных разведений плазмиды. Для оценки зоны борьбы с выбросами, 6 десять раз серийныйразведений между 10 ^-5 (26000 копий / 2,5 мкл образца) и 10 ^-10 (0,26 копий / 2,5 мкл образца). Зона борьбы с выбросами лежит между разведениями 10 ^-9 (2,6 копий / 2,5 мкл образца) и 10 ^-10 (0,26 копий / 2,5 мкл образца). В этом случае, 6 двукратные серийные разведения плазмиды были сделаны в этой зоне борьбы с выбросами для определения LOD _{95% PCR,} между 5,2 и 0,16 копий / мкл образца 2.5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3:. Линейная регрессия для EHV2 QRT-PCR Линейность количественного тестирования является способность генерировать результаты , которые пропорциональны концентрации мишени , присутствующего в определенном диапазоне. Это может быть смоделированалинейной регрессии (у = ах + Ь) между инструментальным ответа (пороговый цикл или Ct) и логарифм количества мишени (количество целевых копий / 2,5 мкл образца). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть большую версию этой фигуры ,

Рис . 4: Выполнение линейной регрессии СВН-2 кПЦР среднего отклонения представляют собой разницу среднее между измеряемой величиной плазмиды ( ) И теоретическое количество плазмидной (х _'I) для каждого уровня плазмиды. Вертикальные столбики представляют неопределенности линейности (U _Лини) , определяемая по формуле

где SD'i стандартное отклонение о F измеряется плазмида количество. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 5: профили точности на основе результатов проверки метода QRT-PCR СВН-2 Зеленая линия (кружки) представляет собой Достоверность данных (систематическая ошибка, или смещение). Пределы приемлемости определяются с точностью ± 0,75 log ₁₀ лабораторией (пунктирные линии). Определены нижние и верхние пределы точности для каждого уровня плазмида нагрузки от среднего отклонения ± двойное стандартное отклонение данных надежности (красные линии). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1 ">
Рис . 6: Количественное вирусного генома нагрузок СВН-2 в зависимости от возраста Вирусный распределение нагрузки геном СВН-2 обнаружен в носовых мазков представлен для разных возрастных групп. Горизонтальные линии представляют собой средние значения в пределах стандартного отклонения (т = месяцев). * Значительно отличается от ANOVA с Newman-Keuls ретроспективном тесте (р <0,05). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

гена - мишени	Грунтовки, зондовые и плазмидой последовательности (5'-3 ')			позиция Нуклеотидная	Размер продукта (нуклеотиды)	Термические условия велоспорта		Рекомендации
EHV2 дв (HQ247755.1)	Вперед: GTGGCCAGCGGGGTGTTC			2113-2130	78	95 ° C 5 мин		11
	Реверс: CCCCCAAAGGGATTYTTGAA			2189-2170		95 ° C 15 сек	45 циклов
	Зонд: FAM-CCCTCTTTGGGAGCATAGTCTCGGGG-MGB			2132-2157		60 ° С 1 мин
	Плазмидную: ACCTGGGCACCATAGGCAAGGTGGTGGTCA ATGTGGCCAGCGGGGTGTTCTCCCTCTTTG GGAGCATAGTCTCGGGGGTGATAAGCTTTTT CAAAAATCCCTTTGGGGGCATGCTGCTCATA GTCCTCATCATAGCCGGGGTAGTGGTGGTG TACCTGTTTATGACCAGGTCCAGGAGCATAT ACTCTGCCCCCATTAGAATGCTCTACCCCGG GGTGGAGAGGGCGGCCCAGGAGCCGGGCG CGCACCCGGTGTCAGAAGACCAAATCAGGA ACATCCTGATGGGAATGCACCAATTTCAG			2081-2381

Таблица 1:. Последовательности праймеров, зондов и положительных синтетических контрольных ДНК , используемых в данном протоколе последовательность плазмиды (положительный синтетической ДНК) соответствует нуклеотидным позициям 2081-2381 последовательности EHV2gB (HQ247755.1). Конструкция праймеров и зондов, используемых в этом протоколе было получено с помощью специального программного обеспечения.

БОЛЕЗНЕТВОРНЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ	Ссылка (происхождение)	Количество штаммов	РЕЗУЛЬТАТЫ
			СВН-2
СВН-2	VR701 (АТСС)	20	положительный
	20 образцов (коллекции FDL)
СВН-5	KD05 (ГЕРЦ)	20	отрицательный
	20 образцов (коллекции FDL)
СВН-3	VR352 (АТСС)	2	отрицательный
	T934 WSV (ГЕРЦ)
СВН-1	Кентукки штамм Ky A (АТСС)	3	отрицательный
	2 образца (коллекция FDL)
СВН-4	VR2230 (АТСС)	1	отрицательный
Asinine герпесвирусов AHV5	FDL Коллекция	1	отрицательный
лошадиныйВирус гриппа	A / Коневодство / Jouars / 4/2006 (H3N8)	1	отрицательный
	(Инвентарный номер JX091752)
Коневодство Артериит Вирус	VR796 (АТСС)	2	отрицательный
Rhodococcus оборудов	FDL Коллекция	1	отрицательный
Streptococcus Equi подвид. Zooepidemicus	FDL Коллекция	1	отрицательный
Streptococcus Equi подвид. обор	FDL Коллекция	1	отрицательный
Coxiella burnetii	ADI-142-100 (Adiagene)	1	отрицательный
Chlamydophila выкидыш	ADI-211-50 (Adiagene)	1	отрицательный
Klebsiella Pneumoniae	FDL Коллекция	1	отрицательный

Таблица 2: Аналитическая специфичность QRT-PCR для EHV-2.

Таблица 3: Расчет смещения и линейности неопределенности (адаптировано из NF U47-600-2 ^12). Для каждого испытания, выступления линейной регрессии (у = ах + Ь) проверяются с помощью таблицы , где у является пороговый цикл получается, а есть наклон получается;. Х уровень плазмида и б является перехватывают я является плазмида уровень (я варьируется от 1 до уровней , к), к является количество уровней плазмиды используется (например, к = 6 в тего таблица); J является исследование (J изменяется от 1 до I испытаний), я это число испытаний, составляет от 3 ​​до 6 испытаний (например , I = 4 в этой таблице) х _я это расчетная величина плазмида для каждого из них. я плазмиде уровень. х _'я теоретическая величина Полученная плазмида с уравнением х' _г = log ₁₀ (х _я) для каждого я плазмиде уровень. Во время каждого J суда, пороговый цикл , полученный для каждого I Уровень плазмиды рассчитывается с линейной регрессии у _{I, J} = а _J х _{I, J} + _J Ь. это измеренное количество плазмидной во время пробного J. Уклон _я к югу> разница наблюдается между измеренным количеством плазмиды и теоретического количества плазмиды для каждого испытания и каждого уровня плазмиды. это среднее значение каждым я плазмиде уровень; SD _'я стандартное отклонение измеряемой величины для каждого I уровень плазмида, средний уклон является средним Bias _I; U _Лини является неопределенность линейности определяется для каждого я плазмиде уровень , рассчитанный из SD'i и среднего отклонения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1 "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "ВОК: Keep-с-next.within-странице =" всегда "> Реальный статус образца положительный отрицательный Результаты, полученные всем методом положительный RP (реальный положительный) FP (ложный положительный результат) отрицательный FN (ложный отрицательный результат) RN (реальный негатив) Всего RP + FN FP + RN Se = RP / (RP + FN) Sp = RN / (RN + FP)

Таблица 4:. ​​Расчет диагностической чувствительности (Se) и специфичность (Sp) всего метода Таблица Шварц был использован для расчета ConfIdENCE интервал на 95% чувствительность и специфичность всего метода, как описано в NF U47-600-2.

Обсуждение

С 2000-х годов, ПЦР в реальном времени была замена стандартных методов золото (культура клеток и методы культуре бактерий) во все большем числе лабораторий. Реализация метода является сравнительно легко. Однако проверка лабораторных методов имеет важное значение для молекулярного обнаружения и количественного определения патогенов для обеспечения точной, повторяемые и надежные данные.

Так как стадия экстракции является основным источником потерь биологического материала, его можно считать главным источником ошибок количественного определения между одним протоколом и другим. Таким образом, создание стандартной кривой ДНК плазмиды во время QRT-PCR, в основном, представлены в литературе, указывает на уровень вирусной нагрузки генома, но не принимает во внимание стадию экстракции.

Описание стратегии De Novo для всего процесса валидации метода в норме AFNOR NF U47-600-2 представляет собой значительный прогресс в этой области. Как показано наВ настоящем документе для EHV-2 у лошадей, или другими в пчелами ^21, это делает необходимым четкое разграничение между стадией развития и этапа проверки с характеристикой ПЦР и определения характеристик всего метода. Одним из ограничений в этом интересном подхода заключается в том, что любое изменение в протоколе приведет к обязанности возобновляют весь процесс, который может быть очень дорогостоящим. Это ограничение также свидетельствует тот факт , что пределы количественного определения зависят от источника , из которого вирус извлеченной (например, респираторных жидкостей, органов, крови или мочи). На самом деле, каждая матрица представляет различную специфичность в их физико-химических характеристик, и важно, чтобы определить независимо друг различные матрицы, используемой для вирусного обнаружения и количественного определения с помощью QRT-PCR. Таким образом, вирусный геном нагрузки каждого биологического образца, может быть определена количественно более точно от добычи. Характеристика также учитывает Термоциклер модэль и когда использование ранее хорошо охарактеризованного методом (например, СВН-2 метод КПЦР описанный в данной работе) требует нового типа машины в родительской лаборатории или другой лаборатории, необходимо подтвердить выполнение этого документа. Подтверждением выполнения анализа на КПЦР является обязательным условием для всех тестов принести в лабораторию. Обычно это достигается путем анализа эталонного образца с известными свойствами. Такая проверка является обязательным условием и считается обязательным в соответствии с просьбой нормы NF 47-600-1 AFNOR для того, чтобы подтвердить производительность (эффективность LOD, ПКО) КПЦР и надежность всего метода (LOD, ПКО). Мало того, во время стадий развития и определения характеристик, но и при использовании в исследованиях или для диагностических целей, факторы риска могут быть идентифицированы и хорошо контролируются для обеспечения стандартизации протокола. Особую озабоченность вызывает адекватное обучение персонала, высококвалифицированный персонал, контроль качества расходных материаловб и их хранение, контроль непосредственных условий окружающей среды и осознание метрологических условий, которые могут повлиять на выполнение научных инструментов, участвующих в анализе. Использование эталонных образцов для межлабораторных сравнений может также помочь контролировать неопределенности. Таким образом, сопоставление данных между лабораториями может быть облегчено. Действительно, межлабораторные тесты профессиональные навыки имеют важное значение для оценки и подтверждения воспроизводимости метода.

Вирусные результаты генома нагрузки, которые выражаются в международных единицах (МЕ) анализируемой биологической матрицы (IU: копий / мл для жидкостей или копий / г для тканей) легче использовать для сравнения результатов между различными лабораториями. Все результаты выше LOQ выражены в виде копий / мл и в результате между УД и LOQ берется в качестве не поддающихся количественной оценке положительного результата. Представление квантификационная данных генома таким образом соответствует более точно к предпосеs анализов (амплификации генома). На самом деле, в опытах на культуре клеток, экспрессию вирусной нагрузки с помощью TCID ₅₀ (средний показатель тканевой культуры инфекционная доза) зависит от природы клеток и штаммов вируса. Каждый штамм обладает линия его уникальная кинетика инфекции и некоторые вирусы, такие как СВН-2 может занять несколько дней до первого цитопатогенный эффект очевиден.

В заключение, этот новый метод определения характеристик QRT-PCR должно способствовать гармонизации представления и интерпретации данных между лабораториями. Это будет очень полезно для потенциальных новых применений QRT-PCR в будущем, как установление значения отсечения для декларации статуса болезни, а не просто от наличия или отсутствия возбудителя.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AB-1900 natural color ABgene 96 well plate	Dutsher	16924
Adhesive film qPCR Absolute	Dutsher	16629	Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run
0.5 ml microtubes, skirted, caps	Dutsher	039258
Ethanol 98%	Sodipro	SAF322941000
Primers	Eurofins	Custom order
Probe	Life Technologies	Custom order
Plasmid	Eurofins	Custom order
QIAamp  RNA viral Mini Kit (containing: QIAamp Mini column, AVL  buffer,  AW1 buffer, AW2 buffer, AVE buffer, collection tubes)	Qiagen	52906	AVL buffer: pre-warm 5 min at 72 °C
Sequencing by Sanger method	Eurofins	Custom order
Taqman Universal PCR Master Mix	Life Technologies	4364340
Tris-EDTA buffer solution	Santa Cruz	sc-296653A
NanoDrop 2000c Spectrophotometer	Thermoscientific	ND-2000C
StepOnePlus Real-Time PCR systems	Life Technologies	4376600	pre-warm 15 min