Экс Vivo Живая съемка Метастазы в легких и их микроокружения

Резюме

Опишем относительно простой метод экс виво живых изображений опухолевых клеток стромы взаимодействий внутри метастазов в легких, используя флуоресцентные репортеров у мышей. Используя спиннинг-диска конфокальной микроскопии, эта методика позволяет визуализировать живых клеток в течение по крайней мере 4 ч и могут быть адаптированы для изучения других воспалительных состояний легких.

Аннотация

Метастазы являются основной причиной для рака, связанных с заболеваемостью и смертностью. Метастазы многоэтапный процесс, и из-за его сложности, точные клеточные и молекулярные процессы, которые регулируют метастатического распространения и роста по-прежнему не удается. Живая изображений позволяет визуализировать динамические и пространственные взаимодействия клеток и их микроокружения. Солидные опухоли обычно метастазируют в легкие. Тем не менее, анатомического расположения легких бросает вызов прижизненной визуализации. Этот протокол обеспечивает относительно простой и быстрый способ экс естественных живых изображений динамических взаимодействий между опухолевыми клетками и окружающей их стромы в метастазов в легких. С помощью этого метода, подвижность раковых клеток, а также взаимодействия между раковыми клетками и клетками стромы в их микросреде могут быть визуализированы в реальном времени в течение нескольких часов. При использовании трансгенных флуоресцентных мышей репортер, флуоресцентный клеточная линия, инъекционный флуоресцентную меткуМолекулы и / или антитела, множественные компоненты микросреды легких могут быть визуализированы, например, кровеносных сосудов и иммунных клеток. Чтобы создать образ различных типов клеток, был использован вращающийся диск конфокальной микроскопии, который позволяет долгосрочное непрерывное изображений с быстрым, четыре цвета захвата изображений. С интервальной фильмы собраны из изображений, собранных в течение нескольких позициях и фокальных плоскостях показать взаимодействие между живой метастатическим и иммунных клеток в течение по крайней мере 4 часа. Эта методика может быть дополнительно использован для тестирования химиотерапию или целевой терапии. Кроме того, этот метод может быть адаптирован для изучения других патологий легких, связанных которые могут повлиять на микросреду легких.

Введение

The deadliest aspect of cancer is metastasis, which accounts for more than 90% of cancer-related morbidity and mortality¹. Metastasis is a multistep process and due to its complexity, the exact cellular and molecular mechanisms that govern metastatic dissemination and growth are still elusive. To metastasize, tumor cells in the primary tumor must detach from their neighboring cells and basement membrane, cross through the extracellular matrix, intravasate, travel via blood or lymphatic vessels, extravasate at the secondary site, and finally, survive and establish secondary tumors. In addition to the properties of the tumor cells, the contribution from the microenvironment, which includes the adjacent stroma along with the normal counterparts of the cancer cells, is crucial for the seeding and establishment of metastatic lesions².

Traditional methods to study metastatic seeding and growth examine static states, as tissues are excised and sectioned for histology. These data only generate a snapshot of this highly dynamic process. Although some useful information can be gained from these studies, the complicated process by which tumor and stromal cells interact during metastatic formation cannot be adequately assessed by these methods. Furthermore, it is not possible to gain insights into tumor or stromal cell migration patterns, which are important in establishing a colony at the distant site. In order to effectively study the metastatic process, it is essential to visualize various interactions between cancer cells and their microenvironment in a continuous manner and at real time.

The lung is a common site for metastases from solid tumors as breast, colorectal, pancreatic cancer, melanoma and sarcoma³. Intravital imaging was previously used to study cell-cell interaction in various primary tumor and metastatic models^4,5. Methods of lung imaging in mice, including intravital imaging, lung section imaging, and an ex vivo pulmonary metastasis assay have been published^6–9. Intravital imaging of mouse lungs utilizes a thoracic suction window to stabilize the lungs⁶. This method is used for time-lapse imaging of the lung microcirculation and alveolar spaces. The anatomical location of the lungs poses a challenge to intravital imaging. In order to access the lungs, the chest cavity must be opened which leads to loss of negative pressure and collapsed lungs. This method only allows the visualization of a small part of the lungs and is technically demanding; an unnecessary complication in studies that examine processes that are independent of blood flow. Moreover, this method also requires gating out movement caused by breathing. This is done either by collecting images between breaths or during post image acquisition analyses¹⁰. The alternative ex vivo lung section imaging provides stability and depth, and also prepares lung parenchyma for immunostaining⁷. However, the lengthy sectioning process leads to an extensive delay between the time of animal sacrifice and the start of the imaging session. Moreover, the process of sectioning a mouse lung causes considerable amount of cell death⁸, thus interfering with the quality and quantity of imaging samples and perhaps needlessly altering tumor-stroma interactions. In order to technically bridge between the methods of intravital imaging and lung section imaging, while exploiting the advantages of the two techniques, a relatively fast and easy method for ex vivo lung imaging was developed. This method was achieved by imaging of non-sectioned whole lung lobes. Using this method, the motility of cancer cells as well as interactions between cancer cells and stromal cells in their microenvironment can be visualized in real time for several hours.

протокол

Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с действующими нормами и правилами по использованию позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения со стороны местного Институциональные уходу и использованию животных комитета (IACUC).

1. Генерация метастазов в легких для Ex Vivo Живая съемка (Трансгенные или хвостовую вену для инъекций)

Примечание: метастазов в легких могут быть сгенерированы путем использования генной инженерии мышиные модели или путем внутривенной (IV) инъекции раковых клеток.

1. Генерация легочные метастазы для визуализации путем скрещивания генетически измененных мышах опухоли в трансгенных репортера мыши, например, пересечь рак молочной железы мышиной модели мыши вируса опухоли молочной железы длинный концевой повтор полиома среднего Т-антиген (MMTV-PyMT) ^{11 в} ACTB-ECFP мышиная модель ^12.
   Примечание: Модель ACTB-ECFP выражает усиливается голубой флуоресцентный белок (ECFP) под бета-актав промотора, такого, что все клетки светиться в голубом, канал CFP. Тем не менее, раковые клетки являются на сегодняшний день наиболее известных и появляются как основная часть ECFP-позитивных клеток под микроскопом. Мышиная модель MMTV-PyMT развивает прогрессирующее заболевание, при котором рост опухоли молочной железы, связанный с распространением раковых клеток к периферии, особенно в легкие. У мышей MMTV-PyMT на FvB / н фоне, микрометастазов может наблюдаться вокруг 10-11-недельного возраста. Как правило, это прогресс macrometastases на отметке 14-недельного возраста ^13.
   ИЛИ
2. Создать экспериментальные метастазы, используя первичные клетки или сингенных клеточных линий. Использование в пробирке манипулировать первичной опухолевых клеток или клеточных линий (например., Трансдукции) с последующей инъекцией ¹⁴ IV.
   1. Вкратце, в этом протоколе, придать зеленый флуоресцентный белок (GFP) -expressing (+) клеточную линию ВОМЖМ-PyMT в люминесцентных мышей репортер (ACTB-ECFP) или мышей дикого типа. Затем,визуализировать эти клетки, называемые VO-PyMT клеток ^15, используя зеленый, GFP канала.
      Примечание: Оригинальный клеточная линия В.О.-PyMT была определена на Вандербильта ортопедии в Нэшвилле, штат Теннесси. ВО означает Vanderbilt ортопедии.
   2. После инъекции 10 ⁶ клеток (в 200 мкл), наблюдается раковых клеток экстравазации немедленно и до нескольких часов после инъекции; наблюдать микрометастазов между 1-3 недель после инъекции и обнаружения macrometastases 3 недели после инъекции ^15.
      Примечание: Менее клетки могут быть введены, чтобы продлить время от инъекции рост метастазов.

2. Маркировка интересующих компонентов в метастатической микроокружения (трансгенных и / или инъекций)

Примечание: Маркировка может быть достигнуто путем трансгенных мышей и / или различными инъекций. Удостоверьтесь, чтобы использовать различные флуоресцентные цвета для маркировки различных типов клеток.

1. Компоненты метку метастатическим микросреды с использованием трансгенных мышей. Замечательная ранее упомянутый модель опухоли мыши (например., ВОМЖМ-PyMT х ACTB-ECFP) в трансгенных мышах, в которых клетки стромы интересных помечены с помощью флуоресцентного белка, который не является ECFP., Например, гр-FMS-EGFP ^4,16.
   Примечание: В дополнение к визуализации раковых клеток в канале CFP, это позволяет визуализировать миелоидных клеток в канале GFP ^4.
   И / ИЛИ
2. Добавьте различные компоненты метастатическим микросреды с использованием инъекционных в трансгенных мышах флуоресцентный репортер или (нефлуоресцирующих) мышей дикого типа.
   Примечание: Некоторые соединения могут быть введены для обозначения различных компонентов метастатического микросреды, например, AF647-конъюгированные Gr-1 антитело, используемого здесь, чтобы маркировать нейтрофилы и моноциты некоторые ^{13 и} различные декстраны рные используемогомаркировать капилляры легких. Для подготовки этих инъекций смотрите шаг 4.

3. Подготовка материалов Перед Вскрытие

1. 2% агарозном
   1. Взвесить 0,2 г агарозы и добавить до 10 мл 1 х PBS. Нагреть, чтобы растворить агарозы. Агарозном будет затвердевать при комнатной температуре, так поддерживать его в C водяной бане 37 ° С до использования для инфляции.
2. CO _{2 и} регулятор температуры
   1. Проверьте DDh _{2 O} в влажную камеру. Пополнение в случае необходимости. Вставьте конфигурации пластину в температурном держателя этап пластины (климатическая камера). Включите контроллер _{СО 2} и _{СО 2} установлен на уровне 5%. Убедитесь, что расход воздуха устанавливается на уровне 0,4 л / мин.
   2. Откройте воздух и CO ₂ клапанами. Включите контроллер температуры. Убедитесь, что температура климатической камере, и крышка установлены при 37 ° C.
   3. Отпустите давление воздуха на _{СО 2} метра. Проверьте CO ₂ увеличивается, электроннойquilibration может занять до 30 минут.
3. Вращающийся диск конфокальной микроскопии
   Примечание: Подробная информация о микроскопа настройке были описаны ранее ^4,17.
   1. Включите лазеров (аргонового лазера для 488 нм возбуждения и твердотельный 405 нм, 561 нм и 640 нм лазеров). Включите микроскоп, камеры, блока управления диска прядении AOTF, блок управления лазером и контроллером камеры.
   2. Откройте микроскопа затвор, включите компьютер работает микроскоп и откройте программное обеспечение.
4. Подготовка инструментов и рассечение платформы.
   1. Включите горячую борта стерилизатора и пусть он достигнет 250 ° C. Чистые 2 пары хирургических ножниц и щипцов с помощью воды и мыла. Стерилизация инструментов в течение по крайней мере 30 сек. Пусть инструменты остыть. Используйте полистирола крышку как рассечение платформы. Накройте его куском лаборатории Soaker.

4. Подготовка инъекций

Примечание: В зависимости от периода полураспада и предпочтительного ответ, вводят флуоресцентно меченных антител и / или флуоресцентных молекул либо непосредственно перед жертвоприношении или пару часов до нескольких дней раньше.

1. Чтобы изображение Gr1-положительных нейтрофилов и моноцитов, подготовить шприц с 7 мкл фондовом AF647-конъюгированные Gr-1 антитела (1 мг / мл) в 100 мкл стерильного PBS под капотом. Поместите 27 G ½ иглу на шприц.
2. Для изображения легочных капиллярах, подготовить вторую и третью шприц с 100 мкл либо 70 кДа родамина-сопряженных декстрана (4 мг / мл) или 10 кДа AF647-сопряженного декстрана (4 мг / мл). Поместите 27 G ½ иглу на шприцах.
3. Вводят AF647-сопряженных раствора антител IV 5 часов перед удалением легких.
4. Вводят один или оба декстран решения IV непосредственно до удаления легких.

5. Получение легких для Ex Vivo Живая съемка

Примечание: Старайтесь работать как стерильные и осторожно, насколько это возможно, чтобы избежать ненужных проблем иммунных клеток в легких.

1. Вводят внутрибрюшинно мыши (IP) с летальным передозировки анестетика, разрешенной протоколом животных утвержденным IACUC., Например, 1 мл 2,5% Avertin. Подождите мыши, чтобы остановить дыхание и быть полностью нечувствительной к вредных раздражителей (заднюю лапу пинч).
   Примечание: смещения шейных позвонков и эвтаназии диоксидом углерода следует избегать, поскольку это может негативно влиять на жизнеспособность клеток легких.
2. Остановите курсор мыши над рассечение борту и стерилизовать мышь с 70% этанола.
3. Используйте хирургические ножницы, чтобы сначала сделать поперечную эпигастрии разрез через кожу, а затем аналогичным разреза через брюшину. Удерживая рассечение доска в вертикальном положении и сократить нисходящей аорты, так что пулы крови вниз в живот и не в грудной полости.
4. Sпресечь небольшое отверстие в диафрагме, чтобы освободить вакуум. Сокращение вдоль 10-й и 12-го ребра, чтобы вырезать диафрагму и получить визуальный доступ к легким.
5. Используйте хирургические ножницы, чтобы вырезать кожу до трахеи над грудной клетки, но оставить грудную клетку нетронутыми. Отделить кожу от грудной клетки. Expose трахеи путем удаления окружающий соединительной ткани, соблюдая осторожность, чтобы не повредить саму (1А) трахеи.
6. Надрез небольшое отверстие около 1 мм в диаметре в открытой трахеи параллельно хрящевых колец, как можно ближе к гортани, насколько возможно (рис 1б). Будьте осторожны, чтобы не полностью прорезать трахеи.
7. Возьмите 20 G иглу и аккуратно вставьте иглу 4-5 мм в трахею без каких-либо противодействующей силы (рис 1D). Конец иглы должен быть виден через трахею (рисунок 1С). Используйте пинцет, чтобы стабилизировать иглу в трахею. Альтернативно, шовный могут быть привязаны Ароунд трахею провести иглу на месте.
   Примечание: При введении слишком глубоко, то киль может быть травмированы или только одна сторона легких может быть завышены.
8. Заполните шприц с 400 мкл 37 ° C 2% агарозы легкоплавки температур (взятой непосредственно из ванны с постоянной температурой). Убедитесь, что рассечение доска встает и медленно привить теплую агарозы через иглу в легкие, использовать ~ 400 мкл раздуть легкие.
   Примечание: Смотрите легкие надувать внутри грудной клетки. Не слишком раздувать легкие, как это приведет к разрыву.
9. После того, как легкие раздуваются, заполняя ~ ⅔ части грудной клетки, отсоединить шприц и держать иглу внутри трахеи, чтобы предотвратить любую утечку агарозы.
10. Налейте примерно 50 мл 20 ° C PBS более надутых легких, чтобы позволить агарозы внутри легких для установки и затвердеть. Медленно извлеките иглу и закрыть трахеи пинцетом, чтобы предотвратить любой не затвердевает агарозы от утечки.
11. Expose легкие, выполняя стернотомию и впоследствии вырезать легкие. Для удаления легких, провести на трахею при резке через трахею полностью. Осторожно потяните трахеи вверх, отрезать соединительную ткань и пищевод, потянув легкие из грудной полости, пока легкие не отделяется от мыши (рис 1E).
12. Погрузитесь в легкие в теплой RPMI-1640, чтобы смыть избыточную кровь и осторожно отделить лепестки с помощью ножниц и щипцов, чтобы сократить главном стебле бронхов лепестков "на воротах (рис 1F).
13. Поместите лепестки, с плоской поверхностью вниз, чтобы максимизировать поверхность формирования изображения, в лунке изображений пластины 24-луночного (рис 1G). Добавьте 100 мкл 37 ° C RPMI-1640 на верхней части лопастей. Место несколько 15 мм круглой микроскоп крышки скользит по верхней части мочки, чтобы предотвратить его плавающим.
14. Налейте теплую PBS в окружающие скважин для предотвращения RPMI-1640 с EVAPorating. Вставьте 24-луночного планшета в уравновешенную климатической камере и поддерживать долей легких при 37 ° С с воздушным и _{5% CO 2.} Вставьте климатической камере на стадии конфокальной микроскопии.
    Примечание: Другие газовые смеси (например, 5% O _2, 5% СО ₂ в _{N 2} для изучения поведение клеток в условиях гипоксии / нижней кислорода) также может быть рассмотрен.

Рисунок 1. Протокол для приготовления легких для живого изображения. (А) Воздействие на трахею после приготовления мыши. (Б) Малый надрез выполнен в открытой трахеи параллельно хрящевых колец. (C) 20 G иглы вставляются 4-5 мм в трахею. (D) Инстилляции 400 мкл 2% легкоплавких температуре агарозы в легкие. (Е) Влиянованные легкие отделены от мыши. (F) Лопасти отделяют после инфляции. (G) лепестков помещают в лунку пластины изображения 24-луночного. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуре.

6. Приобретение и анализа изображений

Примечание: Изображения могут быть приобретены с различными вращающийся диск конфокальной микроскопы, поддерживаемые различными программами. В этом протоколе, либо μManager с заказного вращающийся диск конфокальной микроскопии или дзен с коммерчески доступного вращающийся диск конфокальной микроскопии используется для получения изображения, в то время как Imaris используется для редактирования и анализа фильма.

1. Получение изображений с помощью μManager. Подробное пошаговое протокола для приобретения изображений с использованием программного обеспечения μManager предварительно описано ^18.
   ИЛИ
2. Получение изображенийиспользуя программное обеспечение для анализа изображений, например Zen (рис S1).
   1. Нажмите на вкладку "Расположить", и выбрать цель (10x или 20x) в 'световой путь' инструмента (рис S1A, красное поле). Впоследствии, нажмите на кнопку "глаза - DAPI ', чтобы посмотреть на канале CFP через окуляр (Рисунок S1A, синей коробке). Локализация образца вручную с помощью микроскопа. Нажмите "Все Off'after ткани является центром поля зрения.
   2. Нажмите на вкладку "Приобретение", чтобы установить все параметры для получения изображения.
   3. В инструменте 'Каналы', нажмите кнопку "+" (рис s1b, выделена красным). Всплывающее меню появляется и поиск красителя (ов), присутствующего в образце в 'Dye Database' (рис s1b). Выберите краситель и нажмите кнопку "Добавить".
      Примечание: Программа будет установлена ​​все фильтры должны быть оптимизированы. Краситель может быть удаленавыбрав его последующим нажатием кнопки корзины (рис s1b, квадрат желтого цвета).
   4. В меню "Режим захвата 'установите' Биннинг ', чтобы 5x5. Двойной щелчок по ECFP в меню каналов, чтобы выбрать его. Опустите мощность лазера до 20%, так что выборка не будет беленой при настройке параметров для получения изображения.
   5. Установите флажок "плиток в разделе" Эксперимент менеджер 'и инструмент плитки появляется в группе инструментов "многомерные Acquisition" (рис S1C). Нажмите на кнопку 'Advanced Setup', чтобы посмотреть живое изображение с камеры. Нажмите на кнопку "Добавить" в разделе "позиции", чтобы добавить 4 до 6 позиции в эксперименте. Чтобы удалить позицию, выберите эту позицию и нажмите на кнопку мусорного ведра.
   6. В группе инструментов "Приобретение Параметр ', открыть инструмент" Плата стратегия », и выберите« Absolutе Исправлена ​​Z-позицию "из выпадающего списка.
   7. Установите флажок Z-Stack в разделе "Эксперимент менеджер» и инструмента Z-Stack появляется в группе инструментов в 'многомерных приобретения' (рис S1D). Двойной щелчок по одному из положений в разделе "Позиции" и нажмите кнопку "Live". Вручную установить первый и установить последнюю позицию области изображения. Установить интервал в 4 мкм.
      Примечание: Программа будет определить число срезов для выбранного диапазона и интервала. В идеале, 5-7 ломтика удобны, чтобы обеспечить достаточное визуализации и быстрого получения изображения.
   8. Проверьте флажок "Временные ряды" в разделе "Эксперимент менеджер '. Установите желаемый 'Продолжительность' и 'Интервал' раз в инструментальной временные ряды ', которая появилась в группе инструментов "многомерные Acquisition" (рис s1e).
   9. В «Acquisiным образом Mode 'меню, установить "Биннинг', чтобы 2x2. Двойной щелчок на флуорофора в меню каналов, чтобы выбрать его и увеличить мощность лазера до 100%. Нажмите 'Живая' и отрегулировать 'Время экспозиции'. Повторите эту процедуру для каждого флуорофора.
   10. Установите флажок "Разрешить Автосохранение 'окно. Выберите папку и введите имя файла. Все полученные изображения будут автоматически сохранены в этой папке.
   11. Нажмите на кнопку 'Пуск' эксперимента в разделе «Эксперимент менеджер", чтобы начать сканирование изображения.
3. После получения изображения, компилировать исходные данные в программном обеспечении Imaris. Преобразование изображения в .ims файлы и настройки могут быть сделаны. Подробное пошаговое протокола для преобразования файлов, внося коррективы и сохранения фильмов с помощью Imaris предварительно описано ^18.
4. При сохранении фильма, установить 'Frame Rate' 5 кадров в секунду (FPS).

Результаты

Используя спиннинг-диска конфокальной микроскопии, различные модели мыши системы и уколы, метастатической микросреда могут быть визуализированы и проследить во времени. Использование MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; гр-FMS-EGFP тройной трансгенная мышиная модель, разные клеточные компоненты флуоресце...

Обсуждение

Эта рукопись описывает подробную способ экс естественных живых изображений метастазов в легких в мышиных моделях метастазов. Этот протокол изображений обеспечивает прямой визуализации динамических и пространственных взаимодействий опухолевых клеток стромы внутри микросреды ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
MMTV-PyMT/FVB mice	Jackson Laboratory	2374	Female mice
ACTB-ECFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
c-fms-EGFP/FVB mice	UCSF Werb lab		Female mice
FVB mice	Jackson Laboratory	1800	Female mice
GFP+ VO-PyMT cells	UCSF Werb lab
70,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D1818	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
10,000 kDa Dextran, Alexa Fluor 647 conjugated	Invitrogen	D22914	Dilute to  4mg/ml in 1 x PBS and store at -20  °C. Use 0.4 mg per animal.
Anti-mouse Gr-1 antibody Alexa Fluor 647	UCSF Monoclonal antibody core		Stock 1mg/ml. Use 7 ug per animal.
Anesthetic			Anesthesia approved by IACUC, used for anesthesia and/or euthanesia
1X PBS	UCSF cell culture facility
PBS, USP sterile	Amresco INC	K813-500ML	Ultra pure grade for i.v. injection
Styrofoam platform			Will be used as dissection board
Fine scissors sharp	Fine Science Tools	14060-11
Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5135
Hot bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45	Turn ON 30min before use
Air	UCSF
Oxygen	UCSF
Carbon dioxide	UCSF
1 mL syringe without needle	BD	309659
27 G x 1/2 needle	BD	305109	for i.v. injection
20 G x 1 needle, short bevel	BD	305178
Low-melting-temperature agarose	Lonza	50111	To make 10 ml of solution, weigh 0.2 g of agarose, add to 10 ml 1 x PBS, and heat to dissolve. Agarose will solidify at room temperature, so maintain in a 37 °C water bath until used for inflation.
RPMI-1640 medium without phenol red	Life Technologies	11835-030
24 well Imaging plate	E&K scientific	EK-42892
Glass cover slides, 15 mm	Fisher Scientific	22-031-144
Digital CO2 and temperature controller	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
Climate chamber	Okolab		http://www.oko-lab.com
Cell Observer spinning disk confocal microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Inverted microscope	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
ICCD camera	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal scan-head	Yokogawa Corporation	CSU-10b
Imaris	Bitplane
mManager	Vale lab, UCSF		Open-source software