Использование Комбинированные методики для определения роли плазмалеммы доставкой в ​​Axon ветвление и морфогенеза нейронов

Резюме

Light microscopy techniques coupled with biochemical assays elucidate the involvement of SNARE-mediated exocytosis in netrin-dependent axon branching. This combination of techniques permits identification of molecular mechanisms controlling axon branching and cell shape change.

Аннотация

During neural development, growing axons extend to multiple synaptic partners by elaborating axonal branches. Axon branching is promoted by extracellular guidance cues like netrin-1 and results in dramatic increases to the surface area of the axonal plasma membrane. Netrin-1-dependent axon branching likely involves temporal and spatial control of plasma membrane expansion, the components of which are supplied through exocytic vesicle fusion. These fusion events are preceded by formation of SNARE complexes, comprising a v-SNARE, such as VAMP2 (vesicle-associated membrane protein 2), and plasma membrane t-SNAREs, syntaxin-1 and SNAP25 (synaptosomal-associated protein 25). Detailed herein isa multi-pronged approach used to examine the role of SNARE mediated exocytosis in axon branching. The strength of the combined approach is data acquisition at a range of spatial and temporal resolutions, spanning from the dynamics of single vesicle fusion events in individual neurons to SNARE complex formation and axon branching in populations of cultured neurons. This protocol takes advantage of established biochemical approaches to assay levels of endogenous SNARE complexes and Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy of cortical neurons expressing VAMP2 tagged with a pH-sensitive GFP (VAMP2-pHlourin) to identify netrin-1 dependent changes in exocytic activity in individual neurons. To elucidate the timing of netrin-1-dependent branching, time-lapse differential interference contrast (DIC) microscopy of single neurons over the order of hours is utilized. Fixed cell immunofluorescence paired with botulinum neurotoxins that cleave SNARE machinery and block exocytosis demonstrates that netrin-1 dependent axon branching requires SNARE-mediated exocytic activity.

Введение

Recent estimates suggest that the human brain contains 10¹¹ neurons with 10¹⁴ synaptic connections¹, highlighting the importance of axon branching in vivo. Extracellular axon guidance cues such as netrin-1 guide axons to appropriate synaptic partners and stimulate axonal branching, thereby increasing synaptic capacity^2-5. Netrin-1-dependent axonal arborization involves substantial plasma membrane expansion⁶, which we hypothesized requires delivery of additional membrane components via SNARE complex dependent exocytic vesicle fusion⁷.

Investigating the role of SNARE-mediated exocytosis in netrin-1 dependent axon branching is complicated by several factors. First, the heterogeneity of cortical neurons increases the sample size required to identify significant effects, complicating single cell techniques like imaging. Second, although biochemical techniques permit observation of changes that occur at the population level, they lack the temporal and spatial resolution necessary to localize plasma membrane expansion to the axon in the time frame of axon branching. Lastly, although axon branches form over hours, the cellular changes that contribute to axonal extension may begin within minutes and occur on the order of seconds, thus extending the temporal scope for experimental consideration.

We outline a multi-technique approach that addresses these diverse temporal and spatial scales of exocytosis and axon branching, and thus enhances our understanding of the fundamental cellular mechanisms. Utilizing these approaches provides evidence that supports a critical role for SNARE-mediated exocytosis in axon branching.

протокол

Постановка исследовательской этики: Все эксперименты с участием животных , описанные здесь, могут быть с правилами и положениями UNC комитета по уходу за животными и стандартам NIH по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Подготовка и покрытие диссоциированных корковых нейронов

1. Эвтаназии приуроченные-беременных самок СО ₂ ингаляции с последующим смещением шейных позвонков. Удалить весь мозг из черепов эмбриональных день 15,5 (E15.5) мышей и microdissect кортикальных из каждого полушария. Для получения подробных инструкций относительно микродиссекции эмбрионального мозга мыши смотрите , пожалуйста Viesselmann и др ^8.
2. Поместите не более 4 в 1 кору мл рассекающих сред в стерильном 1,6 мл микропробирок. Добавьте 120 мкл 10х трипсина и переверните трубку 3 - 5 раз перемешать.
3. С помощью гемоцитометра, подсчет клеток семян культуры клеток блюда. Примечание: 1 корковое полушарие обеспечивает окoximately три миллиона клеток.
   1. Для SNARE комплекса биохимического анализа SDS-резистентных, плиты шесть миллионов клеток на 35 мм блюдо и использовать два блюда на каждый вариант. Примечание: Это упрощается при использовании 6-луночные планшеты при сравнении нескольких условий.
   2. Для разветвлений анализов, нейроны пластина на азотную кислоту промывают круговыми покровные при плотности 250000 клеток на 35 мм чашку для DIC визуализации аксона ветвления пластины при плотности 150000. Эти плотности избежать переполненности и упростить анализ.
4. Для живых клеток TIRF микроскопии, ресуспендирования два миллиона нейронов за трансфекцией в nucleofection растворе при комнатной температуре.
   1. Добавляют 100 мкл суспензии клеток в микропробирки , содержащей 10 мкг плазмиды экспрессии и электропорации VAMP2-pHlourin с Nucleofector в соответствии с протоколом производителя ^9.
   2. После того, как трансфекцию немедленно добавить 500 мкл трипсина закалкой сред, удалить суспензию из кювет и пластинчатых клеток в берлогеплотность 400000 клеток на 35 мм стеклянной PDL покрытием нижней тарелки.
5. Тарелка все нейроны коры в 2 мл бессывороточной среды.

2. SNARE комплекс Формирование Пробирной

Примечание: SDS-стойкие SNARE комплексы были обработаны и проанализированы как первоначально описано ¹⁰ с изменениями , подробно описанных ниже. Для проверенных альтернативных антител к тем, которые используются здесь, в разделе материалов.

1. Стимулируют E15.5 корковых нейронов 2 дня в пробирке (DIV) с 250 нг / мл Netrin-1 или мнимого управления в течение 1 ч до лизиса.
2. До обработки проб, охлаждают центрифуге до 4 ° C, установленная температура и водяной бане до 37 ° С, и тепло блока до 100 ° С.
3. Удалить клеточные блюда из инкубатора и место на льду.
   1. Вытяжку средств массовой информации из клеток, заменить ~ 2 мл охлажденного льдом фосфатно-солевой буфер (PBS) нежно 2 раза в течение 1 - 2 мин на каждую промывку.
   2. Для этого теста с помощью 2 скважин в кондition.
   3. Отберите PBS от первой скважины состояния и заменить 250 мкл буфера для гомогенизации. Оставьте на льду в течение 5 мин, а затем с помощью мобильного толкатель, гомогенизацию клеток на льду.
   4. Аспирируйте PBS из следующей скважины того же условия и добавьте недавно гомогенизированной смеси в скважину. Это приведет к увеличению концентрации белка. Повторите эти действия для всех условий.
   5. После завершения пипетку гомогенизируют раствор до предварительно охлажденный 1,6 мл микропробирок на льду и добавляют 20% Тритон Х-100 до конечной концентрации 1% Тритон Х-100. Triturate смешать 10 раз с 1000 мкл пипетки при сведении к минимуму пузырьки.
4. Инкубируйте пробирки на льду в течение 2 мин для солюбилизации белков. После инкубации Центрифуга в течение 10 мин при 6,010 RCF при 4 ° С до гранул, не солюбилизированный материал. Перемещение лизата супернатант в новую охлажденной 1,6 мл пробирку на льду.
5. Выполнить анализ концентрации белка с использованием Бредфорда ¹¹ и разбавленные образцы в FINAл концентрация белка в 3 - 5 мг / мл с оставшимся гомогенизацию буфера с добавлением 1% Тритон Х-100 и 5X буфера для образцов, дополненной B-Mercaptethanol (BME).
6. Разделите каждый опытный образец равномерно в 2 пробирки. Выдержите один образец при температуре 37 ° С в течение 30 мин (SNARE комплексы), а другой при температуре 100 ° С в течение 30 мин (SNARE мономеров). Обратить трубки с перерывами, чтобы сохранить образцы в растворе.
7. Замораживание образцов при -20 ° С до готовности разделить с помощью SDS-PAGE. Перед запуском образцов с помощью электрофореза с использованием стандартных методик, Reboil ранее вареных образцов в течение 5 мин при 100 ° С, но оттаивают 37 ° С образцов при комнатной температуре.
8. Запуск дубликатами образцов (30 - 40 мкг белка на образец) на обоих 8% и 15% геле; 8% обеспечивает идеальное разделение комплекса, в то время как 15% используют для количественного определения SNARE белковых мономеров (SNAP-25 ~ 25kDa, VAMP2 ~ 18kDa, синтаксин-1 ~ 35kDa). Поддерживать источник питания на 70 V, пока линия красителя через НТККкороль геля и повышение напряжения до 90V. Запуск гели, пока краска не стекает.
9. Чтобы сохранить мономеры, переносить белки на нитроцеллюлозную мембрану 0,2 мкм на льду с использованием буфера передачи холода с добавлением 20% -ного метанола (MeOH), при 70 В в течение 45 мин.
10. Сухая мембрана в закрытой чашке в течение 2 ч до O / N при комнатной температуре (O / N обеспечивает лучшие результаты).
11. Блок SNARE сложных мембран в 10% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в течение 1 ч при комнатной температуре.
12. Подготовка первичных антител (распознающие специфические компоненты SNARE комплекс) в разведении 1: 1000 и зонда O / N при 4 ° С на ротационном шейкере.
    1. Промыть блотов в Трис буферным раствором плюс 0,1% Tween-20 (TBS-T) 3 раза в течение 5 минут каждый.
13. Готовят флуоресцентные растворы вторичными антителами в разведении 1: 20000 в 1% БСА в TBS-T и зонд в течение 1 ч, охватываемого при комнатной температуре. Повторите шаг 2.12.1 после 1 ч.
14. Изображение кляксы на флуоресцентной сканирования машины оснащены программным пакетом и количественно оцениваются как SNARE белка COmplex (иммунореактивных полос выше 40 кДа) и мономерных полосы (иммунореактивного полосы при 25 кДа, 18 кДа, 35 кДа для SNAP-25, VAMP2 и синтаксин-1, соответственно), используя инструкции производителя для рисования прямоугольных трансформирования.

3. Exocytic визуализации событий с помощью TIRF микроскопии

Примечание: Этот протокол требует специальной микроскопии оборудования , включая климатическую камеру для поддержания температуры, влажности и CO _2, инвертированный TIRF микроскоп , снабженный эпифлуоресцентной подсветкой, / высокой числовой апертурой (NA) TIRF цели высокого увеличения, автоматизированной стадии XYZ, и чувствительный прибор с зарядовой связью (CCD) детектор. Этот протокол использует полностью автоматизированный инвертированный микроскоп, снабженный 100x 1.49NA TIRF объективного твердого состояния 491 нм лазера и электронного умножителя CCD (EM-CCD). Все оборудование управляется с помощью получения изображения и управления лазером программного обеспечения. До начала питания протокол формирования изображения на Environmental камера, сцена, лампа, компьютер и фотоаппарат.

1. Выберите цель в ПО для обработки изображений. После того, как цель находится в месте, закрепить объективный нагреватель вокруг воротника.
2. Убедитесь, что цель полностью опущенной до обеспечения стадии инкубатора в пазу стадии. Залить дистиллированную воду в стадии инкубатора входные отверстия равномерно для предотвращения разлива.
3. Включите систему инкубации. Откройте клапан в CO ₂ бака и убедитесь , что давление соответствует системе , в соответствии с инструкциями изготовителя. Дайте камере из некоторое время , чтобы достичь 5% CO ₂ и 37 ° C. Перед тем как добавить блюдо изображения, поместить пустое блюдо в инкубаторе, чтобы избежать конденсации воды на цели.
4. Питание от источника лазерного излучения.
5. Открытая сцена инкубатора и добавить масло погружения в объектив. Поместите образец в инкубатор и стабилизации с оружием стабильности или веса тарелки. Повысить цель, пока масло не вступает в контакт с нижней части образца. печ к проходящего света освещения и найти нейронную фокальной плоскости, проходящей через окуляры.
6. Запустите лазерное программное обеспечение и подключить к программному обеспечению управления лазером. Установить подсветку Widefield и выбрать цель используется (100X 1,49 NA TIRF рекомендуется). Установка показателя преломления образца (клетки ~ 1,38). Регулировка интенсивности лазерного излучения, отключив "TTL" на 491 нм лазер. Установите ползунок 100 затем вернуть его обратно вниз до значения между 20 - 40%. Перепроверьте "TTL".
7. Фокус на образце снова в проходящем свете освещения. Перейти к ПО для обработки изображений и выберите 491 нм лазерного излучения и открытого затвора. Точная настройка точки фокусировки лазера на потолке и в центре точки в центре замкнутого поля диафрагмы с конденсатором удалены. Поместите конденсатор вверх дном на оптической скамье, чтобы не поцарапать линзы.
8. Заменить конденсатор и перейти к TIRF и настройка программного обеспечения глубины проникновения (PD) до 110 нм. Переход от Widefield освещения до TIRF IllumРежим минации для работы с изображениями.
9. Найти VAMP2-phluorin, выражающую клетки через окуляры с использованием эпифлуоресцентной с широким полем зрения источника света эпифлуоресцентной.
   1. Настройте параметры изображения (время экспозиции, усиления и мощности лазера), чтобы максимально увеличить соотношение сигнал-шум и динамический диапазон, используя минимальное время экспозиции и интенсивность лазерного излучения, чтобы уменьшить фотообесцвечивания и фототоксичности (например: экспозиции между 50 - 100 мс, с 15 - 30 получить на 30% максимум мощности лазера).
   2. Установка непрерывной автоматической фокусировки на одну ячейку. Приобретают интервальной съемки изображение, установленное с приобретением происходит каждые 0,5 сек в течение 5 мин. Для вынужденного состояния Netrin-1, добавить 500 нг / мл Netrin-1 блюдо из клеток в ламинарный и вернуть блюдо в инкубаторе в течение 1 ч до визуализации.
10. Для количественной оценки частоты exocytic событий , нормированные на единицу площади и времени ячейки, открытые стеки изображений в ImageJ путем перетаскивания файла в окно или перейдите в меню Файл> Открыть> Имя файла (рис0; 2А врезке 1).
    1. Для удаления устойчивых сигналов флуоресцентные, которые не представляют слияние пузырьков события, создают среднюю г проекцию всего стека с помощью Image> Стопка> Z-Project> Тип проекции: Средняя интенсивность. Вычтите это среднее изображение от каждого изображения в интервальной съемки с помощью процесса> Calculator Image> image1: ваш стек Операция: Вычтите image2 вновь созданный средняя проекция г. Это подчеркивает exocytic события (рис 2A Врезка 2 - 3).
    2. Граф exocytic слитые события на глаз. Exocytic события определяются как появление сигнала флуоресценции дифракционной расходимостью , который быстро диффундирует в качестве VAMP2-phluorin диффундирует в плазматической мембране (рис 2А Inset 6).
    3. С помощью команды Threshold для выделения первого изображения с помощью Image> Adjust> Threshold> отрегулируйте ползунок , пока вся ячейка не является порог выделенный (рисунок 2A Inset 7 - 8).
    4. Под Anaлизировать, выберите SetMeasurements и проверить область и метку дисплея. Выберите порогами сотовой области с помощью инструмента отслеживания палочки и нажмите на кнопку "М" для измерения (рис 2A Inset 7 - 8).
    5. Передача , как отсчитывать exocytic слитые события, измерения площади ячейки, а также время , прошедшее изображения в электронную таблицу для подсчета количества exocytic событий / мм ² / времени (рис 2A Inset 9).

4. Дифференциальная интерференционного контраста (DIC) Timelapse микроскопия Axon ветвящихся

Примечание: Полный протокол и демонстрация для общего подхода к визуализации DIC доступно ^12. Хотя этот протокол использует DIC, другие проходящем свете методы микроскопии могут быть использованы для тех же целей (например, фазовый контраст).

1. На 2 DIV, место со стеклянным дном тарелки формирования изображения, содержащего нетрансфецированные нейроны в подогретого экологической камере для поддержания влажного окрironment с 5% CO ₂ и 37 ° С. Использование микроскопа, оснащенного 60X Plan-Apochromat, 1.4 NA DIC объектива и высокой конденсатор NA для лучшего качества изображения и разрешение.
2. Регулировка фокальной плоскости, чтобы найти нейроны через окуляры с использованием проходящего света освещения.
3. Использование функции мультимиллионера приобретения область на ПО для обработки изображений, найти и сохранить места XYZ, по крайней мере, 6 ячеек. Расположите стадию так, что нейроны, представляющие интерес вписываются в поле зрения для достижения наилучших результатов.
   1. Стимулируют с 250 нг / мл Netrin-1 и нажмите кнопку 'начать мульти приобретения области. Последовательно получать изображения в каждой позиции через каждые 20 секунд в течение 24 часов, делая паузу приобретение и переориентацию по мере необходимости.
4. Обзор изображений в ПО для обработки изображений с помощью Программы> Обзор многомерные данных> имя файла открытого. Определить стабильные аксонов ветви (20 мкм в длину), которые образуются во время сеанса визуализации. С помощью инструмента Линия вытяжки для измерения stableaxon Brancч от основания на аксона к наконечнику, чтобы обеспечить 20 мкм длина квалификации удовлетворяется.
   1. В таблице, запишите номер кадра после Netrin стимуляции, когда мембранные выступы инициируют в тех областях, где ветви позже форме, а также номер кадра после Netrin стимуляции, когда нарождающиеся ветви достигают 20 мкм в длину.
   2. Умножьте количество кадров между протрузии и формирования ветви на 20 сек, чтобы вычислить время формирования каждой ветви.

5. токсинного Манипуляции и фиксированной ячейки Immunofluoresence

1. На 2 DIV, лечить нейроны в условиях эксперимента с 250 нг / мл Нетрин-1 и / или 10 нМ ботулинический токсин А (ботулотоксина А ), который расщепляет силки белка SNAP-25 и эффективно ингибирует опосредованную SNARE экзоцитоза ^13, плюс 250 нг / мл netrin- 1. Оставьте один набор необработанных нейронов в качестве контрольной группы.
   ВНИМАНИЕ: ботулотоксина требует использования глаз и средств защиты органов дыхания при подготовке и использованиирешения. Поддерживать все загрязненные материалы, как и биологически опасными материалами автоклава как можно скорее.
2. В 3 -х DIV (24 ч после обработки) аспирата средств массовой информации, и немедленно заменить, по меньшей мере , 1 мл ФЭУ FIX (см таблицу 1 для деталей) нагревали до 37 ° С. Инкубировать в течение 20 мин в темноте при комнатной температуре.
3. Промыть 3 раза с PBS (для будущего использования печати с парафином и хранить при температуре 4 ° С).
4. Место покровные в темном, увлажненной камере окрашивания и проницаемыми клеточные мембраны в течение 10 мин в свеже разбавленного 0,2% Тритон Х-100 в PBS (получен с 10% Тритон Х-100 штока).
5. Удалить пермеабилизирующего раствор и промыть 50 мкл 1x с PBS. Блок в течение 30 мин в ~ 50 мкл 10% бычьим сывороточным альбумином в PBS (BSA-PBS), или 10% Вареный Donkey сыворотки в PBS при комнатной температуре.
6. Полоскание с 1x PBS снова. Инкубируйте покровные в 50 мкл первичного антитела (1: 1000 βIII тубулина, чтобы подтвердить идентичность нейронную) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч при комнатной температуре, во тьме.
7. Выполните 3x 5 мин промывок в PBS. Инкубируйте покровные в 50 мкл спектрально-различных вторичных антител для тубулина (1: 400) и флуоресцентного фаллоидином (варьируется в зависимости от возбуждения: 488 фаллоидином в соотношении 1: 400, 647 фаллоидином в соотношении 1: 100) в 1% BSA-PBS в течение 1 ч ,
8. Вымойте 3x 5 мин в 1x PBS и смонтировать покровные на слайды в монтажных средах.
9. Вакуумный избыток монтажа средств массовой информации от краев покровного и печатью с прозрачным лаком для ногтей.
10. Сбор Widefield изображения эпифлуоресцентной на инвертированный микроскоп с объективом 40X 1.4NA, эпифлуоресцентной возможностей и EM-CCD.
    1. Вручную анализировать ветвления с помощью ImageJ. Открытые стеки изображений в ImageJ путем перетаскивания файла в окно или перейдите в меню Файл> Открыть> Имя файла (рис 4A Врезка 1).
    2. Используя линию> сегментированный линию, проследить аксона, определяемый как самый длинный нейритов , простирающейся от сомы (рис 4A врезке 2 - 3).
    3. Использование Анализ> Инструменты> Диспетчер ROI, сохранить аксона трассировку в интересующей области. Трассировка и сохранить каждую ветвь аксона, определяемой как аксонов ≥20 мкм в длину. Только основные ветви (наросты непосредственно отростков аксона) в анализе (рис 4A врезке 3 - 4).
    4. Нажмите 'M' для измерения сохраненных областей, представляющих интерес, и передавать длину в пикселях в электронную таблицу для расчета длины в мкм.
    5. Разделить количество аксонов ветвей ≥20 мкм в длину, по длине аксона в мкм, деленный на 100, чтобы получить число аксонов ответвлений на длине 100 мкм.

Результаты

Использование в пробирке биохимических методов для анализа количества SDS-устойчивых комплексов SNARE в популяции нейронов. На рисунке 1 показан результат Вестерн - блот после завершения SDS-стойкого SNARE комплекса анализа зондировали SNAP-25, syntaxin1A и VAMP2.

Обсуждение

Axon branching is a fundamental neurodevelopmental process and underpins the vast neuroconnectivity of the mammalian nervous system. Understanding the mechanisms involved in localized plasma membrane expansion is integral to our understanding of both normal and pathological neurodevelopment. The use of a multipronged approach incorporating both population level and single cell level methodologies enhances reproducibility and increases spatial and temporal resolution without compromising population level analysis. At the ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture treated plates	Olympus Plastics	25-105
glass coverslips	Fisher scientific	12-545-81	12CIR-1.5; must be nitric acid treated for 24 hours, rinsed in DI water 2x, and dried prior to use. Must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells.
Amaxa nucleofection solution	Lonza	VPG-1001	100 ml/transfection
Amaxa Nucleofector/electroporator	Lonza		program O-005
35 mm Glass bottom live cell imaging dishes	Matek Corporation	p356-1.5-14-C	must be coated with 1 mg/ml Poly-d-lysine and rinsed prior to plating cells
Olympus IX81-ZDC2 inverted microscope	Olympus
Lambda LS xenon lamp	Sutter Instruments Company
Environmental Stage top incubator	Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF objective	Olympus
Andor iXon EM-CCD	Andor
Odyssey Licor Infrared Imaging System	LI-COR	Odyssey CL-X	Used for scanning blots
Image studio software suite	LI-COR		Used for scanning on the Odyssey Infrared system; Image studio lite used for offline analysis of blots
Metamorph for Olympus	Molecular devices, LLC	version 7.7.6.0	Software used for all imaging and the analysis of DIC timelapse
CELL TIRF control software	Olympus		Software used to control lasers for TIRF imaging
Fiji (Image J)	NIH	ImageJ Version 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA objective	Olympus
40x 1.4 NA Plan Apochromat objective	Olympus
Neurobasal media	GIBCO	21103-049	Base solution for both serum free and trypsin quenching media
Supplement B27	GIBCO	17504-044	500 ml/50 ml Serum free media and Trypsin Quenching media
L-Glutamine		35050-061	1 ml/50 ml Serum free media
Bovine serum albumin	Bio Basic Incorporated	9048-46-8	10% solution in 1x PBS for blocking coverslips; 5% solution in TBS-T for blocking nitrocellulose membranes.
10x  trypsin	Sigma	59427C
HEPES	CELLGRO	25-060-Cl
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS)+ Ca + Mg	Corning	21-030-cm
Fetal bovine serum	Corning/CELLGRO	35-010-CV
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning/CELLGRO	20-021-CV
NaCl	Fisher scientific	BP358-10
EGTA	Fisher scientific	CAS67-42-5
MgCl2	Fisher scientific	BP214-500
TRIS HCl	Sigma	T5941-500
TRIS base	Fisher scientific	BP152-5
N-Propyl Gallate	MP Biomedicals	102747
Glycerol Photometric grade	Acros Organics	18469-5000
Glycerol (non optics grade)	Fisher scientific	CAS56-81-5
B-mercaptoethonal	Fisher scientific	BP176-100
SDS	Fisher scientific	BP166-500
Distilled Water	GIBCO	152340-147
Poly-D-Lysine	Sigma	p-7886	Dissolved in sterile water at 1 mg/ml
Botulinum A toxin BoNTA	List Biological Laboratories	128-A
Rabbit polyclonal anti human VAMP2	Cell signaling	11829
Mouse monoclonal anti rat Syntaxin1A	Santa Cruz Biotechnology	sc-12736
Goat polyclonal anti human SNAP-25	Santa Cruz Biotechnology	sc-7538
Mouse monoclonal anti human βIII-tubulin	Covance	MMS-435P
Alexa Fluor 568 and Alexa Fluor 488 phalloidin, or Alexa Fluor 647	Invitrogen
LI-COR IR-dye secondary antibodies	LI-COR	P/N 925-32212,P/N 925-68023, P/N 926-68022	800 donkey anti-mouse, 680 donkey anti rabbit, 680 donkey anti goat
0.2 μm pore size nitrocellulose membrane	Biorad	9004-70-0
Tween-20	Fisher scientific	BP337-500
Methanol	Fisher scientific	S25426A
Bromphenol Blue	Sigma	B5525-5G
Sucrose	Fisher scientific	S6-212
Paraformaldehyde	Fisher scientific	O-4042-500
Triton-X100	Fisher scientific	BP151-500
TEMED	Fisher scientific	BP150-20
40% Bis-Acrylimide	Fisher scientific	BP1408-1
Name	Company	Catalog Number	Comments
Alternative Validated Antibodies
Mouse Monoclonal Anti-Syntaxin HPC-1 clone	Sigma Aldrich	S0664
Mouse Monoclonal Synaptobrevin 2 (VAMP2)	Synaptic Systems	104-211
Mouse Monoclonal SNAP25	Synaptic Systems	111-011