Чрескожная Оценка функции почек в сознательном Грызуны

Резюме

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Аннотация

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Введение

Скорость клубочковой фильтрации (СКФ) является лучшим показателем для оценки общей функции почек. Золотым стандартом для определения СКФ зависит от мочевой или плазменной очистки экзогенных почечных маркеров, таких как инулин ^1. Тем не менее, эти процедуры требуют много времени и сложна, что требует сбора серийному крови и / или образцах мочи и задней лабораторных тестах на его анализа. Кроме того, эти методы являются инвазивными и стресс у животных, ограничивая количество раз, и частоты, в которых измерения могут быть повторены. Целый ряд альтернативных подходов были разработаны для упрощения процедуры классического для определения СКФ, но они по- прежнему полагаться на мочи и плазмы выборки ^2-4 и / или требуют глубокой анестезии ^5,6, которое известно, влияет на почечную гемодинамику и функцию ^{7, 8.} Конечные продукты обмена веществ, такие как креатинин, также широко используется для оценки функции почек. Тем не менее, известно, что в accurНКД этих эндогенных маркеров не является оптимальным и, кроме того, чтобы анализировать их, моча или забор крови также необходимы.

Здесь мы опишем транскутанная методику оценки функции почек у находящихся в сознании животных. Этот метод проще и быстрее, чем традиционные методы, а также минимально инвазивным. С помощью данной методики, с помощью миниатюрного оптического устройства и экзогенную почечную маркер флуоресцеинизотиоцианата (FITC) -sinistrin, можно определить функцию почек практически в режиме реального времени без необходимости в плазме или пробе мочи и без хирургического катетеризацией для введения препарата. Благодаря этим характеристикам, способ пригоден для выполнения последовательных измерений в том же животном.

FITC-sinistrin является маркером почечной свободно фильтруется в клубочках, без канальцевой реабсорбции или секреции. Оптическая часть миниатюрного устройства состоит из двух светодиодов (LED), которые возбуждаютвводимая маркер и фотодиод для обнаружения флуоресценции, испускаемой через кожу. Записанные данные сохраняются во внутренней памяти, встроенной в устройство, и они могут быть использованы для генерации FITC-sinistrin кинетику элиминации кривой. Питание осуществляется от небольшой литиевый аккумулятор. Для получения более подробной информации об устройстве и его отдельных компонентов относятся к Schreiber и др. ^9. Прибор легко устанавливается на организм животного с помощью двусторонней клейкой патч с прозрачным окном для оптических компонентов. Результаты легко доступны после окончания периода записи закончена.

С помощью метода и протоколом, здесь мы вводим многообещающую технологию, которая могла бы заменить нынешний золотой стандарт для определения СКФ, а не только в научных исследованиях, но и в клинической практике.

протокол

Необходимые эксперименты по разработке протокола были выполнены в соответствии с национальными правилами и были утверждены местным этическим комитетом науки (Regierungspräsidium Карлсруэ).

1. Получение FITC-sinistrin инъекции решения

1. Растворите FITC-sinistrin в физиологическом растворе, чтобы приготовить раствор. Рекомендуемая доза у мышей составляет 7,5 мг / 100 г массы тела (МТ), в то время как у крыс, 5 мг / 100 г BW ФИТЦ-sinistrin предпочтительнее. Для мышей, готовят раствор ФИТЦ-sinistrin маточного раствора 15 мг / мл, в то время как для крыс готовят в концентрации 40 мг / мл.
   Примечание: FITC-sinistrin маточный раствор можно приготовить заранее и хранить при -20 ° С в защищенном от света месте .

2. Подготовка животных

1. Акклиматизироваться животных, по крайней мере, за одну неделю до введения их в любом эксперименте.
2. Обезболить животное , используя 5% изофлуран на 5 л / мин O ₂ Потока в течение 2 мин.
3. Убедитесь, что животное правильно наркозом, наблюдая его дыхание, которое становится все медленнее и глубже, и проверить невосприимчивость с отсутствием ответа пальца ноги.
4. После того , как животное спит, уменьшить анестезию до 2,5% изофлуран в 2 л / мин O ₂ скорости доставки и возьмите BW.
5. Удалить мех с крыла в задней части животного, используя электрическую бритву. Бритье площадь немного больше, чем область, которая будет использоваться для размещения двухсторонней клейкой патч, который имеет размеры 3 см х 6 см.
6. Впоследствии применять депиляции крем в течение короткого периода (2-3 мин) для удаления оставшегося меха.
7. Тщательно промыть водой область, пока крем не будет полностью удален, поскольку сам по себе крем может быть флуоресцентный.
   Примечание: Во избежание появления царапин на коже животного , как это может вызвать раздражение / отек. Если область показывает лишили волос пигментации на коже, не бреют большую площадь, пока неокрашенной место дляОптическая часть устройства находится. Рекомендуется брить через 24 часа заранее, чтобы свести к минимуму воздействие анестезии.

3. Устройство подготовки

1. Поместите оптический прибор для измерения почечной функции на одной стороне двухсторонней клейкой патч, позиционировании оптической части над прозрачным окном (рисунок 1) , выходящий из противоположной части с защитной пленкой.
   Примечание: При работе с мелкими грызунами, уменьшить размер пластыря , как показано на рисунке 2.
2. Прикрепите кусок двухсторонней клейкой патч соответствующего размера к батарее , как показано на рисунке 3.

4. Фиксация устройства на животных

1. Рассчитывают соответствующий объем инъекции в расчете на массу тела животного.
2. Обезболить животное с изофлуран, как указано ранее на участках 2.1-2.3.
3. Отрежьте кусок трубчатой ​​эластичной марлевой повязки Oе около 1 см длиннее ширины двусторонней клейкой патч для использования.
4. Потяните эластичное марлевую повязку на голову животного и место на его спине, оставляя выбритый участок раскрытой.
   Примечание: В качестве альтернативы, установить устройство , используя только липкую ленту, но имейте в виду неправомерного давления на устройстве.
5. Подключите аккумулятор к устройству, подключив разъем батареи к соответствующему порту на устройстве. После этого снимите защитную пленку с кусочком пластыря и установите батарею на верхней поверхности устройства (рис 4A). Убедитесь в том, что аккумулятор правильно подключен, проверяя, что устройство начинает мигать.
   Примечание: У крыс, батарея может быть также присоединен непосредственно на пластыря, рядом с устройством (рис 4В).
6. Снимите защитную крышку с пластыря с устройством управления и поместите его на выбритый участок на задней части животного держа егос кромками, пока не будет правильно закреплен.
7. Накройте устройство с трубчатой ​​эластичной марлевой повязки приставшей ее к клейкой поверхности пластыря (рисунок 5).
8. Правильно растянуть трубчатую повязку на животе животного, гарантируя, что конечности могут свободно перемещаться.
9. Для лучшей фиксации и защиты устройства, наклейте полоску клейкой ленты следующей формы устройства и покрытия проводов батареи.
10. Мера фона для 1 до 3 мин, без оказания давления на устройстве

5. FITC-sinistrin Администрирование и Процедура измерения

1. При необходимости разогреть хвост животного с использованием теплой воды перед инъекцией или с регулируемой температурой нагревательной пластины вдоль всей процедуры.
2. Вводят через хвостовую вену соответствующего объема FITC-sinistrin исходного раствора. Объем инъекции зависит от животного BW и, следовательно, должны рассчитываться для каждого отдельного минусыidering желаемую дозу и концентрацию раствора, упомянутого выше в разделе 1.1.
3. Убедитесь в том, что все FITC-sinistrin раствор вводят внутривенно, а не подкожно.
   Примечание: В качестве альтернативы, ФИТЦ-sinistrin можно вводить , используя предварительно имплантировали внутривенный катетер возбужденное по затылку у грызунов или через ретро - орбитальное инъекции у мышей.
4. Осторожно, вернуть животное в родную клетку, избегая сильных движений и никакого давления на устройстве, поскольку это вводит артефакты движения.
5. Поместите домашнюю клетку в спокойном месте, чтобы избежать этого нарушается животное.
6. Выполните измерение в течение не менее 1 ч при работе с мышами и 2 ч при использовании крыс. В течение этого периода, оптическое устройство будет измерять через кожу флуоресценции, испускаемого FITC-sinistrin.
   Примечание: В течение периода записи должны быть размещены в одиночку животное. Кроме подачи воды, а также выступающиеструктуры, такие как проволочные крышками, должны быть удалены, чтобы избежать повреждения электронных устройств и двигательных артефактов из-за воздействий с объектами.

6. Устройство для удаления

1. После того, как период записи закончится, удалите устройство без анестезии; Тем не менее, в случае необходимости, анестезию животного на короткое время под 5% изофлуран на 5 л / мин O ₂ скорости доставки в течение 2 мин.
2. Осторожно, снять клейкую ленту, а затем трубчатый бинт.
3. Аккуратно отделить двустороннюю клейкую патч из кожи и вернуть животное к своей нормальной домашней клетке.

7. Чтение данных из

1. Отсоедините батарею от устройства и снимите пластыря.
   Примечание: Данные сохраняются на устройстве , пока не начнется новое измерение. Когда батарея подключена сохраненные данные будут перезаписаны новыми записями. Поэтому не следует подключать батарею перед загрузкой данных изустройство. Существует 10 сек льготный период, предназначенный для случайных пересоединения батареи.
2. Подключите устройство к компьютеру с помощью микро-USB кабель и загружать данные с помощью программного обеспечения. Выходной файл представляет собой файл .csv, который может быть открыт и модифицирован с электронными таблицами.
3. Открыть файл данных с конкретным программным обеспечением для оптического устройства и генерировать кривую кинетики элиминации с использованием протоколов программного обеспечения.
4. Анализировать кривую, следуя инструкциям, поставляемым с оптическим устройством. Вскоре, для оценки данных, установить фоновый сигнал, измеренный перед FITC-sinistrin администрации и отмечают начало экспоненциальной фазы экскреции маркера, которое обычно происходит через 15 мин и 45 мин после болюсной инъекции, у мышей и крыс, соответственно, ,
   Примечание: Программное обеспечение будет автоматически отображать FITC-sinistrin период полураспада (Т _1/2) вместе со значением R ^2, определяется 1-Compartment модель. T _1/2 может быть использован для расчета СКФ с использованием коэффициента ^9,10 преобразования.

Результаты

Установка чрескожного измерения очень просто и быстро: устройство помещается на двусторонней пластыря (рисунок 1) и корректируются по размеру , если это необходимо (Рисунок 2), аккумулятор готов (Рисунок 3) и соединены (рис 4).

Этот метод для оценки функции почек было уже подтверждено у разных видов по сравнению с традиционным подходом плазменной очистки ^9,11,12. После протокола подвергается здесь, Schreiber и др. продемонстрировали правильность техники в различных моделях мышей, показывая весьма сопоставимые результаты среди чрескожного измерения и плазменной очистки для всех изученных групп (таблица 1) ^9. В этой работе получено т _1/2 был преобразован в СКФ с помощью мыши конкретных полуэмпирическое преобразованияфактор.

Консистенция чрескожной оценки функции почек также была доказана с использованием различных штаммов мышей. Последовательные измерения в течение 3 -х дней в том же животном показал коэффициент дисперсии 3.0-6.2% ^13. В данном исследовании не было никакого преобразования в GFR , но были выражены и интерпретируются непосредственно в терминах T _1/2 результаты.

Возможность иметь результаты почти в режиме реального времени является одним из больших преимуществ этого метода. После периода записи, результаты сразу же становятся доступными для анализа и прилагающееся программное обеспечение отображает экскреции кривую FITC-sinistrin мгновенно (рисунок 6). В то же программное обеспечение Т _1/2 из FITC-sinistrin могут быть получены, которые могут быть непосредственно использованы в качестве параметра для оценки функции почек превращенного в терминах СКФ. Рисунок 7 показывает, как это выглядит FITC-sinistrin кривой экскреции измеренное транскутанно у животного с нарушением функции почек. Когда функция почек зависит, FITC-sinistrin T _1/2 увеличивается в связи с уменьшением выделения вещества и появления кривой меняется. Как правило, измеренная кривая не возвращается к уровню фона и представляет собой увеличенную площадь под кривой. В том же животном, измерения от предварительно до посттравматической может наблюдаться увеличение максимальной интенсивности флуоресценции из-за скопления маркера, вызванного его восстановленном экскреции. При наличии почечной недостаточности, транскутанно измеренная кривая FITC-sinistrin может показать устойчивое состояние в связи с тяжелыми нарушениями функции (рис 7В).

Использование миниатюрного устройства в нескольких штаммов грызунов с различным состоянием здоровья показал, что этот метод подходит и достаточно чувствительным, чтобы обнаружить изменения dвследствии почечной болезни и старения. Таблица 2 показывает краткую информацию о мышиных моделях изученных к настоящему времени с помощью этого метода.

Рисунок 1. Размещение устройства на двусторонней липкой пластыря. Устройство монтируется на позиционировании патч клеевой оптическую часть в прозрачном окне.

Рисунок 2. Корректирование пластыря для мелких грызунов. Для использования в небольших животных , рекомендуется уменьшить размер пластыря. A: Используйте устройство в качестве руководства, чтобы вырезать патч правильно. Б: Как только желаемый размер был получен, устройство может быть помещен на липкой поверхности пластыря. Рсдавать в аренду, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. Подготовка батареи. Чтобы подключить батарею к устройству, вырезать небольшой кусочек двусторонней клейкой патч (A и B) и поместите его на поверхности батареи (C). Пожалуйста , нажмите здесь для просмотра большая версия этой фигуры.

Рисунок 4. Подключение и размещение батареи во время измерения. (A) В мелких грызунов , таких как мыши, в связи с уменьшением пространства, батарея должна быть размещена на верхней части устройства. (В) В более крупных животных , батарея Cбыть помещены рядом с устройством. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Размещение трубчатой ​​эластичной марлевую повязку в крысу. Трубчатая повязка должна покрывать двустороннюю клейкую патч без вмешательства со свободным движением конечностей для комфорта животного. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версию эта фигура.

Рисунок 6. Представитель образ ликвидации кривой FITC-sinistrin. Сигнал , генерируемый FITC-sinistrin обнаружен transcuновременно и хранятся во внутренней памяти устройства. Когда записанные данные будут загружены на ПК, программное обеспечение формирует кривую, сравнимую с той, представленной на изображении. Y-ось показывает записанную интенсивность флуоресценции [AU], испускаемого закачиваемой FITC-sinistrin маркера, а по оси Х представляет длительность измерения во времени [мин]. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7. Представитель образ ликвидации кривой FITC-sinistrin у животных с нарушенной функцией почек. (А) FITC-sinistrin кривая выведения у животных со сниженной функцией почек , как правило , показывает увеличенную площадь под кривой и неспособность достичь базовой линии в пределах нормальный период измерения , (Б) В сильно обесцененных животных транскутанно измеренная кривая может показать устойчивое состояние , которое указывает на почечную недостаточность. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1. Проверка чрескожного измерения путем сравнения с традиционным клиренса плазмы. Чрескожного измерения почечной функции была подтверждена в различных мышиных моделях (здоровые и в одностороннем порядке нефрэктомированных (UNX) C57BL / 6-129 С.В. мышей и мышиную модель nephronophthisis ( PCY)) по сравнению с зазором плазмы. Значения являются средние значения ± SD. СКФ, скорость клубочковой фильтрации ^9.

/53767/53767table2.jpg "/>
Таблица 2. Мышиные модели изучали с помощью чрескожной измерений UNX, в одностороннем порядке нефрэктомированных. АПФ, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента; T ^{gumodwt / вес,} трансгенная uromodulin нокаута, SD, Спрэг Dawley крыс; ДОК, поликистоз почек.

Обсуждение

В настоящем документе описывается процедура определения функции почек у сознательных грызунов с помощью миниатюрного устройства и экзогенный почек маркер FITC-sinistrin. Как было сказано выше, этот метод имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными процедурами, недержания и плазменной очистки. Одним из них является независимость от забора крови и мочи, что приводит к значительной экономии с точки зрения расходных материалов, времени и, конечно же, животных стресс.

Как показано в таблице 2, экзогенный почечную маркер FITC-sinistrin и измерение его кинетики элиминации через кожу позволяют воздействие почечной патологии на функцию почек изучаться ^9,10,14-18. Последовательный сбор образцов крови, необходимых для оценки плазменной очистки или биомаркеров заболеваний почек вызывают стресс для животного, громоздкий и отнимает много времени для исследователей. Таким образом, последовательные измерения в пределах того же животного были LimITED по благосостоянию животных и методологических причин. Оказалось внутри-животного воспроизводимости чрескожного измерения ¹³ делает его идеальным метод для обнаружения изменений в функции почек из - за прогрессирования заболевания или старения. По той же причине, она также может быть чрезвычайно полезным для изучения эффективности терапевтических подходов.

Два важных шагов для успешного применения этой технологии являются фиксация оптического устройства на животном и правильном введении маркера. Устройство должно быть соответствующим образом закреплены, чтобы исключить артефакты движения. Для этой цели, предотвращая прикрепление и отсоединение двухсторонней липкой пластыря имеет решающее значение, поскольку это может привести к потере его адгезионных свойств и в конечном счете несоответствующей фиксации на животном. Как было упомянуто в протоколе, иммобилизации и защиты оптического устройства, покрывая его с помощью клейкой ленты является эффективным подходом для обеспечения ADEQUATэлектронной фиксации. При выполнении инъекции болюса FITC-sinistrin важно вводить все вещества внутривенно, а не подкожно. Выпуск маркера в подкожной клетчатке могут быть легко идентифицированы с помощью желтого кольца кружили хвост животного, полученного путем собственного цвета FITC-sinistrin в. Подкожная инъекция, как правило, проявляется в виде кривой льстить и длительное время маркер экскреции. Возможное ограничение этого метода состоит в большей степени связана с маркером используемого , чем с технологией как таковой. Когда отек присутствует в коже животного, чрескожного оценка функции почек не рекомендуется, так как есть дополнительный отсек, который может изменить динамику экскреции FITC-sinistrin. Точно так же, пигментированная кожа может ограничить использование техники из-за перекрывания возбуждения и излучения FITC-sinistrin и меланина. Тем не менее, у животных с пигментации кожи в виде пятен, проблема решается путем размещения оптическогочасть устройства в непигментированной области.

Можно модифицировать различные аспекты чрескожного оценки функции почек с целью адаптации процедуры к различным видам и / или подходов животных. Например, рекомендуемая доза ФИТЦ-sinistrin или длина измерения может быть отрегулирована в зависимости от цели эксперимента, а также для различных видов или моделей на животных. Эта адаптируемость метода уже подтверждена его успешного применения у различных видов грызунов и нескольких типов штаммов с различными заболеваниями. Кроме того, чрескожная оценка функции почек , одобренное недавно у собак и кошек ¹² с отличными результатами. Из несомненных различий между этими животными и грызунами, это исследование определило соответствующую дозу FITC-sinistrin для обоих, собак и кошек, и это выполняется значительно больше времени для измерения, 4 часа вместо 1 или 2 часа использованияd у грызунов.

Взятые вместе, использование этого метода может помочь нам, чтобы получить более точные идеи в нефрологии, в том числе лучшего понимания прогрессирования заболевания почек и эффект терапии. Характеристики чрескожной оценки функции почек помещает его в качестве подходящей методики, которая будет применяться в человеческих и ветеринарных клинических областях в будущем, и их следует рассматривать в качестве перспективной технологии для замены традиционных подходов.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
NIC-Kidney device	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Software, batteries and chargers are provided together with the device/s. Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
FITC-sinistrin	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Double-sided adhesive patch	Mannheim Pharma & Diagnostics GmbH		Orderings should be done through info@mapdiagnostics.com
Isis Rodent electric shaver	Braun Aesculap	GT420
Isoflurane	Abbott GmbH	PZN4831850
Leukosilk adhesive tape	BSN medical	102200
Tubular elastic gauze bandage	MaiMed Medical GmbH	73012	There are different sizes available. Size 1 is recommended for mice.
Veet depilation cream	Reckitt Benckiser	PZN7768307	Sensitive skin formulation is recommended as is more gentle with the skin of the animals
Micro USB cable	Samsung	APCBU10BBE
Deltajonin Physiologic solution	AlleMan Pharma GmbH	3366954	Alternatively, it can be used saline or PBS