Анализ<em&gt; В Vivo</em&gt; Миграция клеток с использованием мобильных трансплантаций и время покадровой визуализации у эмбрионов данио рерио

Резюме

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

Аннотация

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Введение

В многоклеточных организмах, миграция клеток имеет важное значение как для развития эмбриона, где он обеспечивает организацию клеток в ткани и органы, а также для взрослой жизни, где он принимает участие в гомеостазе ткани (заживления ран) и иммунитета. В дополнение к этим физиологические функции, миграция клеток также участвует в различных патологических ситуациях, в том числе, в частности, раковых метастаз.

Миграция клеток была проанализирована в пробирке в течение многих десятилетий, обеспечивая общее понимание молекулярных механизмов , обеспечивающих движения клеток на плоских поверхностях. В естественных условиях , однако, клетки сталкиваются с более сложной среде. Это явно появились в последние годы, что миграция в организме может влиять внешние сигналы, такие как внеклеточный матрикс, соседние клетки или секретируемые хемокинов миграцию направляющих, и что механизмы, движущие миграции клеток может отличаться в зависимости от того, что было описано в пробирке ^1,2. Механизмы , обеспечивающие в миграции естественных клеток уделялось меньше внимания до сих пор, в основном , из-за повышенной технической сложности, по сравнению с исследованиями в лабораторных условиях . В естественных условиях анализа миграции клеток , в частности , требует прямого оптического доступа к мигрирующие клетки, методы , чтобы маркировать уникальные клетки чтобы видеть их динамику и морфологию, а также усиление или потеря функции подходит для проверки роли генов-кандидатов. До сих пор лишь несколько модельных систем , несущие эти характеристики были использованы для рассекают в естественных условиях миграции клеток ^3.

Недавно мы использовали миграцию перспективной прехордальной пластины в ранних эмбрионов данио рерио в качестве новой системы удобная модель для оценки функции генов - кандидатов в контроле миграции клеток естественных условиях ^4,5. Перспективное прехордальная пластины (также известный как передний mesendoderm) представляет собой группу клеток, образующих в начале Gastrulation на спинной стороне зародыша. Во время гаструляции эта группа коллективно мигрирует к анимальной эмбриона ^6-8, чтобы сформировать прехордальную пластину, mesendodermal утолщение, кпереди от хорды, и лежащие в основе нервной пластинки. Передняя часть прехордальной пластины будет приводить к инкубационной железы, в то время как его задняя часть , вероятно , способствует головы мезодермы ^9. Благодаря внешнему развитию и оптической прозрачности рыбы эмбриона, миграция клеток может быть непосредственно и легко наблюдать в этой структуре.

Клеточная трансплантация является очень мощным методом , который позволяет быстро и легко создавать мозаики эмбрионов ^10. Выражая флуоресцентные маркеры цитоскелета в трансплантированных клеток приводит в классификации выделенных клеток, морфологии и динамика которого можно легко наблюдать. В сочетании с потерей или усилением функции подходов позволяет анализировать клеточных автономных функций банкиdidate ген.

Представленный протокол описывает , как мы оценивали функцию компонента SIN1 TORC2 в контроле клеточной миграции и актина динамики в естественных условиях ^5. Но, как уже упоминалось в результатах и дальнейшего обсуждения, он может быть использован для анализа потенциального импликации любого гена - кандидата в контроле миграции клеток в естественных условиях.

протокол

Примечание: На рисунке 1 представлен контур протокола.

1. Подготовка иглы для инъекций и трансплантологии

Примечание: Иглы могут быть получены в любое время и хранится. Держите их в чашку Петри, на полосе пластилина. Печать блюдо с парафином для защиты от пыли.

1. Для инъекционных игл, тянуть стеклянный капилляр (наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,58 мм, без нити (см список материалов)) с микропипетки съемник (список материалов). Предпочитают короткие и тонкие иглы (коническую часть около 5 мм), поскольку они являются более эффективными для пирсинга хориона.
   Примечание: инъекционные иглы являются одноразовым.
2. Игла для клеточной трансплантации
   1. Вытяните стеклянный капилляр (наружный диаметр 1,0 мм, внутренний диаметр 0,78 мм, без нити (см список материалов)) с микропипетки съемник.
   2. Uпоют microforge (список материалов), разрезать кончик иглы в точке, где внутренний диаметр 35 мкм (чуть больше, чем диаметр клеток для трансплантации).
   3. Скос разрез оконечность капилляра с микромельница (список материалов) с углом 45 °.
   4. При желании, тянуть зубец на конце иглы, используя microforge. Для этого прикоснуться к горячей нити с кончиком скоса и быстро вытащить его, создавая зубец, который может помочь проникнуть в зародыш.
   5. Установите иглу на держателе иглы, прикрепленной к шприцу. С помощью шприца, промыть внутреннюю поверхность иглы три раза с 2% фтористоводородной кислотой с целью устранения остатков стекла, а затем промыть три раза ацетоном.
      Внимание: плавиковой кислоты является токсичным, манипулировать под капотом, в перчатках.
      Примечание: Иглы трансплантации клеток может быть использована несколько раз.

2. ПодготовкаПосуда для инъекций и клеточной трансплантологии

1. Тепло 50 мл эмбрионом среды ¹¹ , содержащего 0,5 г агарозы в микроволновой печи в течение 1 мин при полной мощности , чтобы получить 1% агарозы в среде эмбриона. Охлаждают в агарозном геле, приблизительно 60 ° С и залить 50 мл в 90 мм чашки Петри. Поместите на поверхности геля специально разработанной формы (список материалов), либо с линиями для инжекционного блюдо или с колодцами для клеточной трансплантационной Петри.
   1. Обратите внимание на поплавок плесени на агарозы, если агарозы не слишком жарко. После того , как гель агарозы установлен, удалить плесень с пинцетом (фиг.2А - B).
      Примечание: блюда можно хранить при температуре 4 ° С, до нескольких недель. Храните их в закрытой влажной коробке, чтобы избежать высыхания.
2. Поместите блюдо в 28 ° C инкубатор 30 мин перед использованием.

3. Сбор эмбрионы и инъекций

1. Инъекции Приготовление раствора
   Примечание: актин-связывающий домендрожжевой актин-связывающего белка 140 (АВР-140), такие как Lifeact, связанный с mCherry (называемый ABP140-mCherry) используется для визуализации полимеризованный актин внутри клетки, для того, чтобы проанализировать протрузии активность. Добавить еще одно соединение , чтобы проверить функцию кандидата гена (например , мРНК доминирующего отрицательного или конститутивно активной конструкции, или морфолино олигонуклеотиды). Для оценки функции SIN1 , как описано в результатах (рис 3), которые мы использовали морфолино олигонуклеотиды. В качестве контроля использовали морфолино , идентичный SIN1 морфолино , но в течение 5 нуклеотидов , распределенных по последовательности таким образом , чтобы этот элемент управления морфолино не соответствует РНК - мишени.
   1. Оттепель SIN1 и Morpholinos управления 5-рассогласования (2 мМ исходные растворы) и ABP140-mCherry мРНК на льду. Добавьте 375 нг мРНК (75 нг / мкл конечный) и 0,75 мкл либо SIN1 или 5-рассогласования управления морфолино (0,3 мМ конечная) в Danieau буфере (58 мМ NaCl, 0,7 мМKCl, 0,4 мМ MgSO _4, 0,6 мМ Са (NO _{3) 2,} 5,0 мМ HEPES , рН 7,6), чтобы достичь общего объема 5 мкл.
2. Эмбрион Коллекция
   Примечание: для этого Экспериментальная установка обоих доноров и принимающих эмбрионы являются трансгенными, выражающая GFP под контролем goosecoid (РКГ) промотора для того , чтобы визуализировать предполагаемую прехордальную пластину ^11.
   1. Соберите Tg (GSC: GFP) яйца. Поместите около 80 яиц в 90 мм чашке Петри заполнены эмбрион средой и инкубировать при 28 ° С.
3. Вводят доноров зародыши
   1. Под стереомикроскопа, осторожно выдавить накопившиеся эмбрионов с пинцетом в линиях инжекционного Петри заполнены эмбрион среде. Использование щипцов, ориентировать эмбрионов с клетками к вершине. Поместите инъекции блюдо в инкубаторе при температуре 28 ° C, пока зародыши не достигли стадии 4-клеток (1 час после оплодотворения).
   2. Загрузите инъекционной иглой с 2 ​​мклраствор для инъекций. Вставьте иглу в держатель иглы (см перечень материалов) , который помещается в микро-манипулятором (см перечень материалов) и связанного с политетрафторэтилена (PTFE) трубки (список материалов) к воздушному трансжекторного (см перечень материалов ).
   3. Откройте капилляр, осторожно касаясь кончиком с тонким пинцетом. При необходимости отрежьте капилляр открытую зажимая его конечность.
   4. Введите один из четырех клеток с иглой и вводят раствор внутри клетки, чтобы заполнить 70% от объема ячейки (2 NL). Вводят 30 эмбрионов.
      Примечание: Получение иглы в клетке может быть затруднено, так как плазма мембрана мягкая. Прицеливание на стыке между клеткой и желтка облегчает проникновение иглы.
   5. Поместите эмбрионы в 28 ° C инкубатор, пока они не достигли стадии сферы (4 часа после оплодотворения).

4. Подготовка эмбрионы для Cell трансплантатион

1. Приготовьте 20 мл среды эмбриона с 200 мкл пенициллин / стрептомицин (список материалов) (Pen / Strep EM).
2. Dechorionation эмбрионов на стадии сферы (4 ч после оплодотворения)
   Примечание: Dechorionated эмбрионы очень хрупкие и взрывается при контакте с воздухом или пластика. Таким образом, они должны быть помещены в агарозном покрытием блюд, и переносили с пожарными-полированного стекла Пастера пипеток.
   1. С помощью пластмассовой пипетки Пастера передачи хост эмбрионов, собранных на этапе 3.2 и эмбрионов доноров впрыскивают на шаге 3.3 на два 35 мм чашки Петри с покрытием из 1% агарозы в среде эмбриона и наполненными Pen / Strep EM. Держите хозяев эмбрионов и эмбрионов доноров в виде двух отдельных блюд.
   2. Вручную извлечь из эмбрионов их хорионов с мелкими пинцетом (см список материалов).
   3. Поместите эмбрионов в 28 ° C инкубаторе, пока они не достигли стадии щита (6 часов после оплодотворения).

5. клеточной трансплантации

1. Устройте эмбрионы для трансплантации клеток.
   1. Под флуоресцентным стереомикроскопа, выберите эмбрионы донорские выражения ABP140-mCherry (красный) внутри щита (зеленого цвета).
   2. Использование огневой полировкой пипетки Пастера, передача эмбрионов в лунки трансплантации клеток Петри заполнены Pen / Strep EM. Поместите хост эмбрионов в одном ряду и эмбрионов доноров в соседнем ряду.
   3. Использование ресничку, тщательно ориентируют эмбрионов с щитом.
      Примечание: положение щита может быть оценена с помощью экспрессии GFP или анатомически.
2. Трансплантация настройки системы.
   Примечание: Система трансплантации состоит из держателя иглы (см перечень материалов) , связанных с тефлоновой трубкой (список материалов) и разъем для подключения трубки (список материалов) в Гамильтон шприц , снабженный микро-диск (см список материалов). Держатель иглымонтируется на 3-ходовым микроманипулятором (см список материалов).
   1. Используя держатель иглы, присоединенную к шприцу, промойте иглу для трансплантации клеток с 70% -ным этанолом. Высушите подлизываться воздух в иглу. Не сушить продуванием, так как это может привести к пыли застрять в суженной части иглы.
   2. Вставьте иглу в держателе иглы, соединенного с шприца Гамильтона, с фаской вверх.
3. Щит-к-щит Клеточная трансплантация
   1. Введите щит донора эмбриона с трансплантационной иглы и составлять около 10-20 клеток, меченных ABP140-mCherry. Тщательно избегать рисования желток.
   2. Пересадка клеток в щит эмбриона хозяина. Повторяйте, пока все эмбрионы хозяева не были пересажены.
   3. Удалите все поврежденные эмбрионы с огнем полированные пипетку Пастера. Поместите пересаженных эмбрионов в инкубаторе при температуре 28 ° С, и пусть они восстановить в течение примерно 30 мин.
   4. С помощью иглыдержатель прикреплен к шприцу, прополоскать перевивки иглу с водой и поместить его обратно в чашку Петри на диапазон формовочной глины. Печать блюдо с парафином.

6. (Необязательно) Single Cell Трансплантация

Примечание: В эмбрионе клетки прилипают друг к другу, так что трудно провести только одну клетку в трансплантационной иглы. Мы разработали модифицированный протокол легко трансплантации одиночных клеток прехордальная пластины предшественников. Идея заключается в том, чтобы отделить клетки перед трансплантацией. Поскольку изолированные прехордальная клетки-предшественники пластины, как правило, теряют свою идентичность, мы генетически налагают их предполагаемый прехордальная идентичность пластины, путем активации узловой сигнального пути, в отсутствие фактора транскрипции Sox32. Мы проверили , что эти индуцированные клетки ведут себя как эндогенных прехордальная клеток - предшественников пластины ^8. Ниже приведены конкретные шаги для выполнения одиночных трансплантаций клеток. Cell dissociaции достигается за счет размещения эмбрионов в бескальциевой Ringer ^11, рассекает эксплантате и механически перемешивая.

1. На этапе 2.1, подготовить трансплантацию блюдо с 1% агарозы в бескальциевой Ringer вместо Эмбрион среды.
2. На этапе 3.1, в дополнение к ABP140-mCherry РНК и SIN1 морфолино, добавьте 3 нг РНК , кодирующей активную форму Узловой рецептора Taram-A (0,6 нг / мкл конечной) и 1,25 мкл морфолино против sox32 (основной раствор на 2 мМ, следовательно, 0,5 мМ конечная).
3. После шага 4, передача трех выбранных эмбрионов донора в чашке для клеточной трансплантации, наполненную Pen / Strep бескальциевой Ringer с использованием огневой полировкой пипетки Пастера. С тонкой пинцетом, рассекают эксплантате, содержащий клетки (инъекционные ABP140-mCherry меченые клетки). Быстро отбросить остальную часть эмбрионов.
4. С ресниц, осторожно перемешать эксплантов, пока клетки не диссоциируют.
5. Оформи одной изолированной клетки в трансплантационной иглыи пересадить его в щит хозяина эмбриона.
6. Использование огневой полировкой пипетки Пастера, перенесите эмбрионы в чашке агарозном покрытием, заполненного Pen / Strep EM. Поместите эмбрионов в инкубаторе при 28 ° С в течение 30 мин.

7. Эмбрион Монтаж

1. Камерный обработки изображений
   1. Способ 1: использовать камеру формирования изображения , состоящего из пластиковой горкой (75 * 25 * 0,5 мм) пронзил с 4 отверстиями (диаметр 5,5 мм), с 3 мм высокими краями , с одной стороны (рис 2C - D). Клей покровного стекла на задней стороне, с цианакриловый клей (супер клей).
      Примечание: В конце эксперимента, поместите камеру в воду на одну ночь, чтобы удалить покровное и избавиться от остатков клея с наждачной бумагой.
   2. Способ 2: использование 35 мм Маттек со стеклянным дном блюда (список материалов) с 10 мм отверстие диаметром .
2. Эмбрион Монтажное
   1. Заполните стеклянную пробирку с 1 мл горячего 0,2% агарозы в среде эмбриона.Хранить ее при температуре 42 ° C в плавки- блоке.
   2. Под флуоресцентным стереомикроскопа, выберите эмбрион , в котором Red пересаженные клетки являются частью предполагаемой прехордальной пластины с надписью зеленым цветом (т.е. красные пересаженные клетки находятся в пределах зеленой предполагаемой прехордальной пластины, и начали мигрировать к анимальной).
   3. Перенос выбранного эмбриона в раствор агарозы с огневой полировкой пипетки Пастера. Откажитесь избыток эмбриона среды из пипетки. Нарисуйте эмбрион в пипетку с агарозы, и перенести эмбрион в камере формирования изображения, осаждения капли агарозы. Перед агарозном устанавливается, сориентировать эмбриона с ресницах. Поместите перспективный прехордальную пластину вверх для получения изображения с использованием вертикального микроскопа, или на стеклянным дном для визуализации с помощью инвертированного микроскопа. Подождите, пока агароза не установлен (около 1 мин, в зависимости от комнатной температуры) перед установкой другого эмбриона в следующую лунку камеры.
      Примечание: тя изображенияmber, содержащий 4 скважины позволяет устанавливать до 4-х эмбрионов.
   4. Когда агарозном установлено, заполнить камеру с ручкой / Strep EM, чтобы избежать высыхания.

8. Живая съемка

1. Используйте 40X воды погружения на большие расстояния объективом. Используйте соответствующие наборы фильтров для изображений GFP и mCherry (для GFP: возбуждения BP 470/40, светоделителе FT 510 и эмиссии BP 540/50; для mCherry: возбуждения BP 578/21, светоделителе FT 596 и LP эмиссии 641 / 75). Регулировка длительности экспозиции с целью оптимизации динамики изображения.
2. Для изображения всех ячеек в пластине, приобретают Z-стеки, начиная несколько микрометров выше предполагаемой прехордальной пластины (в эктодермы) и заканчивая несколько микрометров ниже предполагаемой прехордальной пластины (в желтке). Используйте Z-шаг 2 мкм. Для оптимизации скорости сбора данных, переключение цветов между Z-стеки, а не между кадрами.
   Примечание: Это может привести к небольшим различиям между зеленым и красным изображений, но это не проблема, так как нет точного сотрудничества-локализацией между зелеными и красными сигналами требуется. Для дальнейшего сокращения времени формирования изображений и воздействия света, зеленый может быть приобретен только один раз каждые 5 очков времени, которое достаточно для идентификации прехордальная клеток-предшественников пластины.
3. С помощью таких параметров, изображение до 4-х эмбрионов в течение двухминутного интервала времени, который необходимо проанализировать частоту протрузии и ориентацию. Для анализа жизни протрузии, сократить временной интервал до 30 секунд, чтобы получить более высокое разрешение по времени. Изображение от 60% эпиболии до 80% эпиболии.

9. Анализ динамики клеток

1. Загрузка 4D изображений в ImageJ
   Примечание: В зависимости от используемого программного обеспечения для сбора, изображения сохраняются в различных форматах (один файл на изображения, один файл на г-стек, один файл для всего эксперимента). Некоторые плагины ImageJ доступны в Интернете, чтобы открыть 4D стеки. Наши данные хранятся в виде одного файла на г-стека. Поскольку набор данных может быть большим, это может быть удобно открывать только его часть (некоторые тиме точки, или подразделу Z-стека, или 8-битные изображения преобразуются ...). Мы используем на заказ ImageJ плагин, чтобы сделать так, что мы были бы рады, чтобы распределить по запросу.
2. Анализ ориентации и частоты клеточных выпячиваний
   1. Используйте GFP изображения для определения основного направления перспективного прехордальной миграции пластины. Возьмите это в качестве эталона для измерения угловых ячеек выступающих частей. Поворотом стек, так что эта ссылка направление параллельно одной стороне изображения.
   2. Выполните одну ячейку. Выбор инструмента угол. Для каждого кадра и каждого выступа, с помощью инструмента угол для измерения угла между выступом и опорным направлением (фиг.3А). С помощью команды Analyze / Measure для хранения значения (или нажмите M на клавиатуре). Сохранить результаты в виде текстового файла. Повторите следующую ячейку.
   3. Импорт данных в распределении R и угол участка как гистограмм. С помощью теста Колмогорова-Смирнова (ks.test в R) для сравнения различных условий.
      Примечание: Инструмент угол обеспечивает значения в диапазоне между 0 ° и 180 °, что позволяет использовать классические статистические тесты и не круговых испытаний.
   4. С помощью этого набора данных, вычислить частоту излучения, как количество выступов на клетку в минуту. Использование Student T-тест (t.test в R) для сравнения различных условий.
3. Анализ клеточного Выступы Lifetime
   1. Для каждой ячейки и каждого выступа, мера длительности протрузия (количество кадров, в течение которых протрузия присутствует х временной интервал между кадрами).
   2. Импорт данных в R. Использование Стьюдента (t.test в R) для сравнения различных условий.
      Примечание: Другие функции миграции может быть интересно проанализировать, с тем чтобы охарактеризовать клеточную миграцию. К ним относятся клеточные дорожки, для скорости, направления и измерения постоянства или морфологии клеток. Некоторые коммерческие программные приложения доступны для измерения этих функций, но большое количество программного обеспечения приме с открытым исходным кодомкатионы и плагинов ImageJ также доступны, как, например , ADAPT для анализа морфодинамики ^12, DiPer смотреть на клеточных траекторий и направленного настойчивостью ^13, CellTrack отслеживать границы ячеек во время миграции ^14.

Результаты

Представленная методика была использована для анализа роли SIN1, одного из основных компонентов Тор комплекс 2 (TORC2), в контроле миграции естественных клеток. Применение трансплантации клеток позволяет маркировать изолированных клеток и анализа клеточных автоном?...

Обсуждение

Этот протокол представляет собой простой способ для изучения роли гена - кандидата в миграции клеток в живом организме , путем объединения создания химерных эмбрионов с использованием клеточной трансплантации с живого изображения.

Создание мозаики эмбрионов

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.58 mm)	Harvard Apparatus	300085	standard thickness
Glass capillaries (outside diameter 1.0 mm, inside diameter 0.78 mm)	Harvard Apparatus	300085	thin-walled
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	10 000 units penicillin and 10 mg streptomycin per ml
fine tweezers	Dumont Fine Science Tools	11254-20	5F
glass bottom dishes	MatTek	P35G-0-10-C
Air transjector	Eppendorf	5246
Micro-forge	Narishige	MF-900
Microgrinder	Narishige	EG-44
Micromanipulator (for injection)	Narishige	MN-151
Micromanipulator (for cell transplantation)	Leica	Leica Micromanipulator
Hammilton Syringe	Narishige	IM-9B
Micropipette puller	David Kopf Instruments	Model 720
Transplantation mold	Adapative Science Tools	PT-1
Needle holder	Narishige	HI-7
Tube connector	Narishige	CI-1
PTFE tubing	Narishige	CT-1