Помощью лазера микродиссекция (LAM) в качестве инструмента для транскрипционные Профилирование отдельных типов клеток

Резюме

Here we present a protocol for laser-assisted microdissection of specific plant cell types for transcriptional profiling. While the protocol is suitable for different species and cell types, the focus is on highly inaccessible cells of the female germline important for sexual and apomictic reproduction in the crucifer genus Boechera.

Аннотация

The understanding of developmental processes at the molecular level requires insights into transcriptional regulation, and thus the transcriptome, at the level of individual cell types. While the methods described here are generally applicable to a wide range of species and cell types, our research focuses on plant reproduction. Plant cultivation and seed production is of crucial importance for human and animal nutrition. A detailed understanding of the regulatory networks that govern the formation of the reproductive lineage (germline) and ultimately of seeds is a precondition for the targeted manipulation of plant reproduction. In particular, the engineering of apomixis (asexual reproduction through seeds) into crop plants promises great improvements, as it leads to the formation of clonal seeds that are genetically identical to the mother plant. Consequently, the cell types of the female germline are of major importance for the understanding and engineering of apomixis. However, as the corresponding cells are deeply embedded within the floral tissues, they are very difficult to access for experimental analyses, including cell-type specific transcriptomics. To overcome this limitation, sections of individual cells can be isolated by laser-assisted microdissection (LAM). While LAM in combination with transcriptional profiling allows the identification of genes and pathways active in any cell type with high specificity, establishing a suitable protocol can be challenging. Specifically, the quality of RNA obtained after LAM can be compromised, especially when small, single cells are targeted. To circumvent this problem, we have established a workflow for LAM that reproducibly results in high RNA quality that is well suitable for transcriptomics, as exemplified here by the isolation of cells of the female germline in apomictic Boechera. In this protocol, procedures are described for tissue preparation and LAM, also with regard to RNA extraction and quality control.

Введение

В транскрипционных исследованиях, проведенных на уровне тканей, Транскриптом узкоспециализированных, но редких типов клеток часто маскируется более обильными окружающих клеток. Примером таких узкоспециализированных типов клеток являются клетки женской репродуктивной линии (зародышевой) в растениях. Самка зародышевой задается в развивающихся яйцеклеток, предшественники семян внутри гинецеем цветочной ^1,2. Мегаспор материнская клетка (MMC) является первой ячейкой женского зародышевых. Он подвергается мейоза с образованием тетраду восстановленных мегаспор. Как правило, только один из этих мегаспор выживает и делит митотически без цитокинеза, то есть, в синцитий. Эти митозы следуют cellularization с образованием зрелого гаметофит, который, как правило, состоит из четырех типов клеток: три antipodals, два synergid клетки, яйца и центральной клетки. Яичные и центральные клетки являются женские гаметы, которые получают оплодотворенные двумя сперматозоидами во время доуBLE оплодотворение , чтобы дать начало зародыша и эндосперма Проявочной семян ^1,2. В сексуальной модели системы Резуховидка Таля, только ~ 50 семян развиваются на цветок в то время как около 50 - 80 семян развиваются на цветок в тесно связанного рода Boechera. Таким образом, самка зародышевой состоит из всего лишь нескольких узкоспециализированных типов клеток, что делает его отличной моделью для изучения процессов развития, такие как спецификации и дифференцировки клеток.

Кроме того, способность проникновения в суть регуляторных процессов генов, регулирующих размножение растений может быть прикладной ценности. У растений, как половое и бесполое размножение через семена (апомиксису) может произойти. В то время как половое размножение создает генетическое разнообразие в популяции, апомиксис приводит к образованию клонального потомства, генетически идентичны материнского растения. Поэтому апомиксису имеет большой потенциал для применения в сельском хозяйстве и производстве семян, так как даже сложные материнские генотипы могутподдерживаться неизменным на протяжении нескольких поколений ^3,4,5. Поскольку апомиксису , естественно , не происходит ни в одном основных видов сельскохозяйственных культур, инженерный апомиксиса в посевах представляет большой интерес ^3,4,5. Тем не менее, это долгосрочная цель трудно достичь , потому что основной генетический и молекулярная основа апомиксисом не понята достаточно подробно ^6.

Для того, чтобы получить представление о транскрипционной основе , регулирующие апомиктическое воспроизводства, типа клеток специфических транскрипционных профилирование с помощью с помощью лазера микродиссекции (LAM) и следующего поколения секвенирования (NGS) представляет собой очень мощный подход ^7,8. LAM сначала был создан для животных и биомедицинских исследований. За последние несколько лет LAM также применяется к биологии растений ^6,9,10. В отличие от других способов , позволяющих профилирование отдельных клеток и тканей типов, Lam не требует генерации маркерных линий ^6,9,10. Таким образом, это может быть приложениелгал любой клетки или ткани типа без предварительного молекулярного знания. Еще одним преимуществом является то, что LAM он может быть применен к любому типу клеток до тех пор, как клетка может быть распознана в сухих участках в зависимости от положения и / или структурных характеристик. LAM имеет дополнительное преимущество в том, что используются фиксированные ткани, что предотвращает изменения транскрипционного профиля во время обработки.

Ткани интерес, например, цветочной ткани, фиксируется в несшивающий закрепителя до встраивания в парафин. Вложение в парафин может быть сделано вручную, в соответствии с установленными протоколами ^9,11. Тем не менее, использование автоматизированного процессора ткани для дегидратации и инфильтрации с воском обычно приводит к более высокой воспроизводимостью с точки зрения сохранения качества РНК и морфологии тканей. Альтернативная стратегия встраивания ткани в смолу также успешно используется для анализа типа специфических клеточных LAM ^8. Тем не менее, использование автомПроцессор ткани ованные для встраивания в воске очень много времени эффективным, так как многие образцы могут быть обработаны сразу же требует как минимум практического времени. В то время как, как правило, нет значительной потери качества РНК происходит во время фиксации и встраивание, приготовление тонких срезов с микротома и, в частности, монтаж на frameslides, используемых для LAM остается важным шагом для сохранения качества РНК. Это ранее было отмечено , и использование системы передачи ленты была описана в более высокое качество РНК на данном этапе ^12. Тем не менее, это добавляет еще один шаг больших затрат времени при подготовке слайдов, а также требует специального оборудования. Оптимизированный протокол , описанный ниже воспроизводимо производит РНК , которая обладает достаточным качеством для транскрипционного профилирования с GeneChips и следующего поколения секвенирования (NGS) подходы ^7,11,13,14. Кроме того, с помощью лазерного микроскопа микродиссекции, используемого, высокая чистота выделенных типов клеток является беспорядочное бегствоinely производства ^7,11,13,14.

Род Boechera является отличной моделью системы для изучения ключевых шагов апомиктическому воспроизводства. В Boechera, множество различных сексуальных и апомиктических присоединений были идентифицированы и могут быть использованы для сравнительного анализа ^15,16,17. При сравнении типа клеток специфических Транскриптом клеток из женских зародышевых от сексуальных Arabidopsis и апомиктическому Boechera, мы идентифицировали гены и пути , которые дифференцированно выражены, выявляя тем самым новые аспекты регуляторных процессов , определяющих апомиксис ^7. Кроме того, это исследование проверяется пригодность LAM для транскрипции типоспецифичной клеток анализ малых и редких типов клеток. Мы уже использовали этот протокол для анализа различных типов клеток в различных видов растений, но видо- и ткане-специфические модификации протокола может потребоваться в некоторых случаях.

протокол

Примечание: Этот протокол описывает подготовку тканей, с помощью лазера микродиссекции и экстракции РНК для транскрипции профилирования. Всегда используйте перчатки на протяжении всех этапов протокола. Исследование и рассмотреть инструкции по технике безопасности для каждого химического вещества, используемого. В частности, иметь в виду, что ксилола вредно и может проникать перчатки и что метанол является токсичным. Для всех используемых инструментов, пожалуйста, обратитесь к соответствующим руководствам пользователя.

1. Удаление РНКазы деятельности из стеклянной посуды и другого оборудования

1. Перед использованием обернуть любую стеклянную посуду в алюминиевую фольгу Перед выпечкой в ​​течение ~ 8 ч при 180 ° С для обеспечения РНКазы качества.
2. Лечить любые металлические поверхности (например, пара пинцетов), а также работа скамейка и нагревательная пластина с соответствующим обеззараживающим раствором РНКазы. После этого промойте поверхность с РНКазы водой, чтобы удалить обеззараживающим раствором. Затем очистите поверхности дополнительно с 70% этанола.
3. Используйте все товарные объявленияTIC расходные материалы (например, трубы) совершенно новый без предварительной обработки. Если есть возможность, используйте пластиковые расходные материалы, которые сертифицированы быть РНКазы.

2. Ткань Фиксирование

1. Приготовьте 10 мл фиксаторе фермера (3: 1, об / об этанол: уксусная кислота) в свежем 15 мл пробирку на льду. (Всегда готовьте закрепитель свежей Фермера перед использованием). В качестве альтернативы, несшивающий закрепителя этанол: уксусная кислота (5: 1 об / об) может быть использовано ^18.
2. Используйте тонкую пару пинцета, чтобы собрать почки на стадии развития интереса. Немедленно погрузите почки в ледяной закрепителя. Используйте 10 мл закрепитель для фиксации ~ 20 бутоны или цветы из Arabidopsis или Boechera Примечание. При использовании видов растений с более крупными цветами рекомендуется рассекать цветы с лезвием бритвы , чтобы генерировать более мелкие куски до фиксации.
   1. Для того чтобы получить зрелые гаметофиты, выхолостить 2 - 3-х крупнейших цветочных почек на inflorценции 2 дня до сбора урожая.
3. Заполните дно эксикаторе со льдом. Откройте пробирки , содержащие образцы, например, цветы, и разместить их на льду, либо путем непосредственного ввода их в лед таким образом , что они не могут упасть или с помощью соответствующего держателя. Вакуумный просочиться в течение 15 мин до высвобождения вакуума.
   1. Повторите вакуумной пропитки один раз в течение 15 мин.
4. Отпустите вакуума и хранить в течение ночи (~ 12 ч) на льду. Накройте ведро льда с фольгой крышкой или алюминиевой и хранить в ведро 4 ° C комнате или холодильник с тем чтобы предотвратить лед от таяния. Примечание: Продлите время фиксации не рекомендуется.

3. Ткань Вложение, Тонкий Секционирование и монтирование на слайдах для LAM

1. Тканевая вложение.
   1. Заменить закрепитель до 70% этанола, полученного с чистым этанолом и РНКазы водой. Оставьте образцы на льду до дальнейшей обработки. Начало embedding образцов в тот же день. В случае , если нет ткани машинной обработки отсутствует, переходите к ручной вложении , как описано в другом месте ^9,11 и перейдите к шагу 3.1.11.
   2. Аккуратно перенести образцы ткани на встраивание кассет с помощью пинцета. Плотно закройте кассеты. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Избегайте даже частичную сушку образца во время этого шага. Избегайте сдавливания образцов с помощью пинцета.
      Примечание: Для маркировки кассеты карандаш следует использовать, в идеале, написав на наклонной поверхности кассеты.
   3. Храните вложение загружена кассета с бутонами или цветами в 70% этанола, пока весь материал не передается на кассетах и ​​вложение машина может быть загружен. Для этой цели используют стекло окрашивающий корыто, заполненную 70% -ным этанолом.
   4. Извлеките корзины процессора ткани из реторты машины и передавать Вложение кассеты в корзину с наклонными поверхностями, обращенными верхнюю часть и в том же самом направлении. CRITical ШАГ: Выполняйте это быстро, чтобы предотвратить высыхание тканей. Если обработке большого количества встраивание кассет сразу, поместите корзину в соответствующую РНКазы емкость, наполненную 70% -ным этанолом до загрузки образцов.
   5. Положите крышку на корзину и поставил корзину обратно в реторты. Закройте реторты.
      Примечание: Процессор ткани автоматически обезвоживает образцы, изменения растворителя к ксилолы, и делает инфильтрацию с расплавленным парафином. Как правило, это делается в течение ночи.
   6. Запуск программы процессора ткани. Рекомендуемые стандартные настройки 1 час 70% этанола, в три раза 1 час 90% этанола, в три раза 1 час 100% этанола, два раза 1 час 100% ксилола, один раз 1 час 15 мин 100% ксилола при комнатной температуре, с последующей инфильтрацией парафином два раза в течение 1 часа и один раз в течение 3 часов при 56 ° C ^11.
      Примечание: Для того, чтобы гарантировать, что блокировка станция готова с воском топленого, включите машину за несколько часов до начала илииспользовать функцию таймера, чтобы выбрать приблизительный время начала.
      Примечание: В случае, если ткань не может быть обработан сразу же после этого, более длительное время инкубации в парафин при температуре 56 ° С, возможно, вместо 3 ч при 56 ° С. Обратитесь к руководству по эксплуатации прибора. Как правило, кассеты с тканями автоматически остаются в расплавленном воске, пока команда "пустой реторты" не утвержден. Если воск не плавится при запуске процессора ткани, реторта заполняется 70% -ным этанолом, и программа остается на удержании, пока готов к запуску.
   7. Очищать реторту и немедленно передать образцы в восковую ванну парафина при температуре 56 ° С в блокирующем станции. Удалите крышку из корзины и покрывают парафином ванну блокирующей станции с крышкой.
   8. Ворсовые, как много свежих балансирующие подносы на поверхности блокирующего станции нагревали до 56 ° С, поскольку есть кассеты в корзине.
      Примечание: этанол-устойчивый постоянный маркер можно использоватьd, чтобы обозначить нижнюю часть балансировочных лотков. Не рекомендуется использовать Ацетон устойчивые перманентные маркеры.
   9. Использование блокировки станции, заполняют предварительно подогретый свежий пластиковый поднос с балансирования растопленным парафином при 56 ° C. Поднимите крышку парафиновой ванны, поднимите одну кассету только в то время, и передавать образцы из кассет для жидкого парафина при температуре 56 ° С в балансирующего лотке с помощью пинцета.
      ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Избегайте затвердевания воска, окружающей образец при обращении с кассеты, работая быстро.
      1. Поместите все образцы в соответствии с потребностями с помощью иглы препарат до затвердевания воска. Как правило, несколько цветов расположены в балансировочном лоток индивидуально разнесенных примерно на 1 см в каждом направлении.
      2. Повторите шаг 3.1.9, пока все образцы не передаются.
   10. Поместите корзинку обратно в процессор ткани и очистки реторты с помощью соответствующей программы (обратитесь к руководству пользователя).
   11. Выключите процессор ткани и блокировки станции. Перейдите к шагу 3.1.13.
   12. В случае, если нет ткани инфильтрация машина и не вложение станции не имеется, использовать нагревательную печь для плавления парафина при температуре 56 ° С. На скамейке, заполнить расплавленный воск в пластиковые лотки балансировки, передавать образцы в воск, а также использовать иглы подготовки для размещения образцов.
   13. Дайте парафин затвердевать при комнатной температуре в течение ~ 1 - 3 ч перед хранением образцов при температуре 4 ° С. Образцы могут быть впоследствии обработаны свеже или храниться в течение нескольких месяцев.
2. Получение тонких срезов и горками для LAM.
   1. На светостоле осветительного блока воска снизу, удалить парафин с образцами из окружающих пластиковых лотках. Рассеките из квадратную воска блок , содержащий ткань, например., Бутон или цветок, используя РНКазы лезвие бритвы. Для этой цели всегда ориентировать образцы в направлении верхней части блока воска (также см Рисунок 1).
      1. Готовят восковые блоки всех образцов, которые должны использоваться для LAM в то время.
   2. Установите блоки для обработки встраивания кассеты, заполненные затвердевшего парафина: растопить небольшой кусочек или капли парафина на кончик соответствующего шпателя с использованием Этанол лампу и использовать горячий воск, чтобы зафиксировать блок на опоре (со встроенными тканей наверху).
      1. Дайте воску затвердеть в течение по меньшей мере 20 мин при температуре 4 ° С.
   3. Удалите излишки воска, охватывающую образец с лезвием бритвы на световом столе. Убедитесь в том , чтобы держать квадратную поверхность с параллельными краями (см рисунок 1).
   4. Установите нагревательную пластину на 42 ° C.
   5. Безопасное крепление образцов к микротома и подготовить 6 - 10 мкм толщиной секций. Обратитесь к инструкциям производителя для использования микротома. Примечание: В то время как более тонкие участки часто дают лучшее структурное разрешение, большее количество РНК ВЫСОКачество R может быть получен с более толстыми секциями. Для клетки Boechera зрелых гаметофиты мы используем 7 мкм в качестве значения по умолчанию. Перемещение довольно медленно с образцами над микротома нож часто приводит к улучшению гистологии.
   6. Всегда передавать парафиновой ленты на длине приблизительно 10 - 15 см в пластиковой коробке с черного картона в нижней части перед установкой их в LAM слайдами.
   7. Если это возможно, предварительно выбрать части парафиновых полосок , содержащих сотовом или ткани типа , представляющие интерес, например, яйцеклеток, под рассекает-рамки и отбросить все остальное.
3. Подготовка слайдов для LAM.
   1. Поместите необходимое количество металлических каркасах слайдов (как правило, 5 - 10) с плоской поверхностью сверху на нагревательной пластине.
   2. Внесите ~ 1 - 2 мл РНКазы свободной воды на пластиковой части слайда. С помощью лезвия бритвы, вырезать парафиновые ленты в короткие отрезки около 4 - 5 см достаточно долго, чтобы охватить пластиковые окна. Uсе пинцета и иглы подготовки к идеально поместить парафиновые полоски параллельно друг другу на пластиковых окнах слайдов. Осторожно поднимите слайд на одном конце, чтобы удалить воду и поместите слайды обратно.
      1. В качестве альтернативы, поместите нагревательную пластину под химическим капотом. Нанесите небольшой объем метанола, в пластмассовой части ползуна только достаточного для смачивания поверхности (это может привести к небольшому гофрированностью слайдов). Поместите парафиновые полоски на слайдах.
         Примечание: Из соображений токсичности, избегать использования метанола, если это возможно. Тем не менее, использование метанола на этом этапе действительно улучшает качество РНК в случае качество достигается за счет установки на воде недостаточно. Стоит тестирования этих альтернатив на старте нового проекта, поскольку качество РНК достигается изменяется в зависимости от типа клеток и вида исследуемого.
   3. Высушить слайды на ночь на нагревательной пластине при 42 ° С в течение ~ 12 ч. Закройте нагревательный элемент спластиковая крышка, которая не соприкасается с горками. Убедитесь, что пластиковая крышка не препятствует обмену воздуха. С этой целью крышку можно поместить на пипетку коробки или аналогичные быть сняты.
      1. В качестве альтернативы, сократить время сушки до минимума двух часов или пока ткань появляется абсолютно сухой. Сокращение времени нарезка в коллекции может улучшить качество РНК.
   4. Под капотом химической, де-воск слайды 2 раза в течение 10 мин в ксилоле с использованием соответствующих держателей слайдов. Убедитесь, чтобы полностью погрузить пластмассовую часть каждого слайда только, но, чтобы позволить удаление слайда, прикоснувшись к более широкому концу металлической рамы, которая хранится сухой.
   5. Разрешить слайды высохнуть в течение ~ 10 мин под капотом химической предварительной до LAM.
      Примечание: Слайды не сразу обработанные может быть помещен обратно на нагревательной пластине при 42 ° С ткань лицевой стороной вверх до нескольких часов. Это предотвратит любую влажность от не ставя под угрозу качество РНК до дальнейшей обработки.

4. помощью лазера микродиссекция (LAM)

Примечание: Процедура LAM будет меняться в зависимости от используемого инструмента. Некоторые детали этого протокола адаптированы к конкретному инструменту и технологии сбора образцов на использовании Колпачок решений электростатических сил. Кроме того, детали могут различаться даже между разными версиями программного обеспечения. Пожалуйста, обратитесь к инструкциям производителя и руководств пользователя для подробного описания и инструкции по инструменту и программному обеспечению.

1. Включите устройства для LAM (компьютер, микроскоп, блок управления лазера).
2. Запустите программу рулевого микроскопа и лазера.
3. Включите лазер, нажав на соответствующую кнопку на панели управления.
4. Поместите колпачок (0,5 мл, без рассеивателя) в держатель колпачка и поместите его в приборе.
5. Поддержка LAM слайд с стекло для микроскопии. Убедитесь в том, что плоская поверхность с горкойТкань крепится обращена к предметное стекло.
6. Поместите слайд в приборе с предметное стекло под ним.
7. Выберите Цель 4X. В программе, выберите, чтобы переместить крышку в положение "вверх" и продолжить, чтобы сделать сканирование слайдов.
8. Провести поиск слайда и определить структуры, представляющие интерес. Точечные и сохранить свои позиции на слайде, чтобы иметь возможность вернуться к точному положению на стадии резки.
9. Выберите подходящую цель (например , 40X или 60X).
10. При необходимости регулировать скорость работы лазера, фокус и мощность лазера, а также откалибровать сценическое движение, обращаясь к руководству пользователя прибора. После того, как настройки учетной записи для конкретной интересующей ткани, параметры могут быть использованы повторно.
11. Проверьте положение лазера с помощью одного выстрела, нажав на кнопку "лазерный выстрел" программы, в идеале в части мембраны без ткани.
    1. При необходимости калибровки лазера позиции, следуя йИнструкция е изготовителя для инструмента.
12. Проверьте калибровку объектива, сдвинув очевидную структуру для всех четырех углов окна программного обеспечения на мониторе, удерживая правую кнопку мыши нажатой. Убедитесь, что положение руки относительно очевидной структуры одинакова во всех четырех углах. В противном случае калибровки цели следующие инструкции программного обеспечения.
13. С крышкой в "вниз" положение, используйте инструмент "рука пера" , чтобы обозначить границы типа клеток или ткани , представляющей интерес, например, яйцеклетки. Рассеките клеток, представляющих интерес с лазером, нажав 'вырезать'. Примечание: Часто, секционирования необходимо повторить, если граница вокруг ячейки не была полностью расчленены сразу. В этом случае рекомендуется, чтобы установить программное обеспечение автоматически делать два повторы секции в качестве стандарта.
14. Поднимите крышку и перейти к следующей сохраненной позиции со структурой, представляющей интерес. Повторите шаг 4.13процедуры рассекать в следующих разделах клеток, пока все клетки интерес от одного слайда не собираются. Убедитесь, что крышка расположена таким образом, что новая секция прилипает к пустой позиции на крышке.
    Примечание: Рекомендуется изолировать больших кусков ткани (например, участки целых цветков или его частей) от каждого слайда после выделения участков одиночных клеток на свежей крышкой. Они могут быть использованы для контроля качества РНК.
15. Удалить слайд и перейдите к следующему слайду, повторяя шаги 4.4 - 4.9 и 4.13 до 4,14.
16. Повторите шаг 4,15 и связанные с ними действия, пока типы клеток интерес со стороны всех слайдах были изолированы. Примечание: Не рекомендуется собрать дольше, чем ~ 4 - 5 часов на той же крышкой.
17. Осмотрите поверхность крышки после того, как LAM, чтобы исключить неспецифические загрязнения образца. В то время как не-рассеченные ткани защищены фольгой, пыль может прилипать к поверхности за счет электростатического сцепления.
    1. TO визуально осмотреть крышку, выньте слайд из прибора. Поместите держатель крышки в положении "вниз" и осмотрите поверхность с целью 4X.
    2. В случае небольшие кусочки пыли видны, удалите их с небольшим (2 мкл) пипетки. В качестве альтернативы, установите затвор назад на инструменте, установите крышку на свободной части слайда (без ткани), и полностью уничтожить загрязнения с помощью лазера.
18. Закрыть колпачки и заморозить сухие участки при температуре -80 ° С до дальнейшего использования. При необходимости образцы могут храниться в течение нескольких недель. Тем не менее, быстро идет на этом этапе рекомендуется.

5. Выделение РНК и контроль качества

Примечание: РНК может быть выделена с помощью любого способа, подходящего для небольших количеств РНК. В данном протоколе, использование набора для выделения РНК, указанного для небольших количеств РНК описывается. Следуйте инструкциям производителя.

1. С помощью пробирки с образцом, прикрепленной кколпачок либо непосредственно, либо после удаления от -80 & deg; С.
   1. Открыть пробирки и тщательно пипеткой 11 мкл буфера для экстракции к стенке каждой трубки с помощью подсказок фильтра. Изменение советы между образцами.
   2. Закройте крышку и встряхнуть буфера для экстракции вниз к крышке трубки.
   3. Место труб с цоколем вниз в нагревательную печь, предварительно нагретую до 42 ° C. Выдержите в течение 30 мин, следуя инструкциям изготовителя.
2. Следуйте инструкциям производителя для подготовки колонки и сбора экстракта в нижней части труб.
   1. Если материал, из более чем одного колпачка должна быть объединены в одну выборку, выполните шаги 5.1.1 - 5.1.2 индивидуально для каждой трубки / колпачка.
   2. Затем, бассейн выдержки для одного образца в одной пробирке и измеряют количество объединенном экстракта с помощью пипетки перед добавлением эквивалентного количества этанола (см инструкции изготовителя).
   3. Убедитесь, что количество EtОН добавлены перед загрузкой колонку равно объему объединенном экстракта.
   4. После осаждения РНК с этанолом, быстро перейти к загрузке колонн следующих инструкций изготовителя. Продолжить протокол с стадии центрифугирования 100 XG.
   5. После того, как содержимое каждой коллекторной трубы были пропускают через колонку, выполнить шаг центрифугирования 16 000 мкг в течение 30 секунд, чтобы удалить инструкции проточный следующего производителя.
   6. Продолжить с экстракции РНК и очистки, следуя инструкциям изготовителя.
   7. После загрузки буфера для элюции в колонке позволяет колонке инкубировать в течение 1 мин. Продолжайте загружать пробирки в центрифугу, следуя инструкциям в инструкции изготовителя. Примечание: дополнительный шаг центрифугирования в течение 1 мин при 100 мкг до элюирования, как указано в протоколе может повысить эффективность элюции.
3. Извлечение РНК из продРОЛС (большие срезах ткани) для контроля качества РНК следующие шаги 5.1 до 5.2.7 настоящего протокола.
4. Для РНК нагрузки контроля качества 1 мкл неразбавленной суммарную РНК каждого контрольного образца на Bioanalyzer с использованием РНК-Pico Chip в соответствии с инструкциями изготовителя.
   Примечание: Извлеченный РНК можно использовать для линейного усиления и анализа транскриптом с использованием микрочипов или РНК-Seq ^7,11,13,14. В идеале контроль качества следует указать РНК Целостность Число (RIN) , по меньшей мере , 7. Ряд поставщиков обеспечивают подходящие наборы для амплификации, подходящие примеры приведены в ^9.

Результаты

Подготовка проб и LAM сделаны в последовательных шагов

Ряд последовательных шагов , которые необходимы для подготовки РНК для транскрипции анализа из выбранных типов клеток по LAM (рисунок 1). Это начинается с урожаем ц?...

Обсуждение

Протокол подходит для различных мобильных и типов тканей

LAM в сочетании с транскриптом анализа с помощью микрочипов или РНК-Seq является ценным инструментом , чтобы получить представление о специфических форм активности генов , регулирующих развитие организма ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol	VWR	1,009,861,000	absolute EMPROVE Ph Eur,BP,USP
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
2100 Bioanalyzer	Agilent	G2939AA
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Ambion Nuclease free water	life technologies	AM9932
ASP200 S	Leica	14048043624	tissue processor
black cardboard			can be purchased in special paper shops
DNA- and RNAse-free Frame Slides	Micro Dissect GmbH		1, 4 µm PET-membrane; can also be purchased from Leica
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
ethanol lamp
exsiccator	Sigma-Aldrich	Z354074-1EA	Nalgene Vaccuum Dessicator or similar equipment
filter tips 10 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 1,000 µl	Axon Lab AG	AL60010	can be replaced by similar tips
filter tips 20 µl	Axon Lab AG	AL60020	can be replaced by similar tips
filter tips 200 µl	Axon Lab AG	AL60200	can be replaced by similar tips
forceps precision	VWE	232-1221
glass slide holder	Huber & Co.AG	10.0540.01	Färbekästen nach Hellendahl
glass staining trough	Huber & Co.AG	10.0570.01	Färbekasten
Heated Paraffin Embedding Module Leica	Leica	Leica EG 1150 H	blocking station, similar devises are suitable
Heating and Drying Table	Medax	15501	other models and/or suppliers are suitable
ice bucket	VWR ice bucket with lid	10146-184	similar buckets equally suitable
light table	UVP An Analytical Jena Company	TW-26	white light transluminator
microscope slide	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
microtome blade	Thermo Scientific	FEAHS35	S35 microtome blade disposable
MMI Cell Cut Plus Instrument	MMI (Molecular Machines and Industries)
Non-stick, RNAse free Microfuge tubes, 2 ml	life technologies	AM12475
Paraplast X-TRA	Roth	X882.2	for histology
PicoPure RNA Isolation Kit	life technologies	KIT0204	Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit
plastic balancing trays	Semadeni AG	2513
plastic box	Semadeni AG	2971	Plastikdose PS
plastic lid for heating plate			homemade
preparation needle	VWR	631-7159
RNA 6000 Pico Kit	Agilent	5067-1513
RNAse free microfuge tubes	life technologies	AM12400
RNAse ZAP Decontamination Solution	life technologies	AM9780
Semi-automated Rotary Microtome	Leica	RM2245	similar devices are equally suitable
Tissue Loc Histo Screen Cassettes	Thermo Scientific	C-1000_AQ	similar cassettes of other suppliers are suitable
Tubes with adhesive lid, without diffusor 500 µl	MMI (Molecular Machines and Industries)	50204
Xylol (Isomere) ROTIPURAN	VWR	4436.2	min. 99%, p.a., ACS, ISO SP
process embedding cassettes	Leica	14039440000	Leica Jet Cassette I without lid
Universal Oven	Memmert	UF55	other models and/or suppliers are suitable