JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает основные процедурные шаги для выполнения целой клетки записи патч-зажим. Эта методика позволяет исследовать электрического поведения нейронов, и когда выполняется в срезах мозга, позволяет оценить различные нейронные функции от нейронов, которые до сих пор интегрированы в относительно хорошо сохранившихся контуров мозга.

Аннотация

Цельноклеточная записи патч-зажим является электрофизиологические метод, который позволяет исследовать электрические свойства существенной части нейрона. В этой конфигурации микропипетки находится в плотном контакте с клеточной мембраной, которая предотвращает утечку тока и тем самым обеспечивает более точные измерения ионного тока, чем ранее использовавшейся внутриклеточного острого способа записи электрода. Классически, запись поклеточного может быть выполнена на нейронах в различных типах препаратов, в том числе моделей клеточных культур, диссоциированных нейронов, нейронов в срезах мозга, и в интактных анестезированных или бодрствующих животных. Таким образом, эта методика очень способствовало пониманию пассивных и активных биофизических свойств возбудимых клеток. Главным преимуществом этого метода является то, что она предоставляет информацию о том , как конкретные манипуляции (например, фармакологические, экспериментатор-индуцированные пластичностью) могут изменять специфические нейронные функции или Сhannels в режиме реального времени. Кроме того, значительное открытие плазматической мембраны позволяет внутреннее решение пипеткой свободно диффундировать в цитоплазме, обеспечивая средство для введения лекарственных средств, например, агонисты или антагонисты специфических внутриклеточных белков, и манипулировании этих целей , не изменяя их функции в соседних сотах. В данной статье основное внимание будет уделено записи целых клеток проводили на нейроны в срезах мозга, препарат , который имеет преимущество записи нейронов в относительно хорошо сохранившихся контуров мозга, т.е. в физиологически соответствующем контексте. В частности, когда в сочетании с соответствующим фармакологию, этот метод является мощным инструментом, позволяющим идентифицировать конкретных neuroadaptations, которые имели место после любого типа опыта, таких как обучение, воздействие наркотиков злоупотребления и стресса. Таким образом, цельноклеточная патч-зажим записи в срезах мозга обеспечивают средства для измерения в бывших естественных условиях подготовки длительных измененийв нейрональных функций, которые развивались в неповрежденных бодрствующих животных.

Введение

Метод патч-зажим, электрофизиологическое технология , которая была разработана в конце 1970 - х 1,2, является основным инструментом для изучения одного или нескольких функций ионных каналов в живой ткани. Среди различных конфигураций накладными, которые могут быть достигнуты, поклеточного патч-зажим записи позволяют исследование электрического поведения значительной части нейроне. Классически, эта техника выполняется в пробирке или на срезах мозга, свеже диссоциированных нейронов, или на моделях клеточных культур 3. При использовании на нейроны в срезах мозга, эта методика представляет несколько преимуществ. В частности: (I) нейроны записываются в относительно сохраненными участки мозга , которые в некоторой степени, и по сравнению с препаратами для культивирования клеток, обеспечивают среду , которая является физиологически отношение 3. Это позволяет захватывать рано, или даже мониторинг в режиме реального времени, клеточные и молекулярные события, которые вызываются любым типом острого pharmacologческие манипуляции - временное разрешение , которое не может быть достигнуто с помощью классического в условиях естественных условиях; (б) возможность визуально определить области мозга в срезах мозга обеспечивает высокую региональную специфику 3 как для региона мозга изучены и для конкретных нейронов , когда они выражают флуоресцентные маркеры; ( в ) получать доступ к внутриклеточное пространство клетки, открывая значительную часть плазматической мембраны (в отличие от прокалывания мембраны с резким микропипетки для внутриклеточных записей) 4. В свою очередь, это позволяет содержание или концентрацию определенных ионов, образующих внутреннее решение, чтобы быть модифицирован таким образом молекулярные мишени или клеточные механизмы могут быть изучены при различных условиях. Например, при создании конфигурации целой клетки, любой специфический фармакологический агент (например, антагонисты) , которые можно добавить к микропипетки записи (патч пипетки) решение будет непосредственно диффундируют в цитоплазму и действовать на его putatив внутриклеточные мишени без изменения целевой функции в соседних ячейках. Кроме того, по сравнению с резким записи микропипетки, большое отверстие в кончике электрода зажим заплата обеспечивает более низкое сопротивление, менее конкурирующими шум, и , таким образом , лучший электрический доступ к внутренней части клетки 4. Тем не менее, отметим , что большое отверстие в наконечнике пипетки может привести к клеточной диализе, и , таким образом , потеря внутриклеточного молекулярного механизма , который может иметь решающее значение для выражения биологических явлений , которые находятся в стадии изучения 5,6. В этом случае, острые записи электрода может быть более подходящим. Этот тип записи требует микропипетки с поры, что значительно меньше, чем те, которые используются для записи целых клеток, предотвращая тем самым большую часть ионного обмена между внутриклеточным пространством и внутренним раствором пипеткой.

Любые формы опыта (острый или хронический), в том числе обучение 7-10, воздействие наркотиков злоупотребления 11,12, напряжение 13,14 и т.д., могут изменять различные аспекты функции нейронов в определенных областях мозга. Поскольку эти изменения часто требуют времени для разработки (часов до нескольких дней), записи целых клеток в срезах мозга от животных, которые претерпели определенный опыт позволяют исследователям идентифицировать эти изменения. В принципе, многие (если не все) компонентов , которые участвуют в нейрональных функций (например, лиганд-активированных ионных каналов, напряжения закрытого ионных каналов, нейромедиаторных транспортерные), и , таким образом , цепь активности мозга и поведение, могут быть изменены с помощью опыта (зависящий от опыта пластичность) 10,15-17. На нейронном уровне, схема активность мозга возникает из постоянных взаимодействий между Synaptic (например, передачи глутамат) и внутренних факторов , клеточная возбудимость (например, axosomato-дендритных ионных каналов: натрий, Na +, калия, K +, а также кальция, Ca 2+ ). При определенных условиях с использованием WholE-Cell патч-зажим электрофизиологические методы, сигнальные изменения, происходящие в частности, от изменений в синаптической против собственного возбудимости может быть выделен.

В большинстве случаев синаптическую возбудимость оценивается с использованием цельноклеточной метода фиксации. Этот режим записи позволяет измерять ионные токи [например, опосредованных рецепторами α-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазолпропионовой кислоты ( АМРА-рецепторов) и рецепторов N-метил-D-аспарагиновой кислоты (NMDA-рецепторы)] через нейронную мембрану плазмы, удерживая мембранный потенциал на установленном напряжении. Здесь, экспериментаторы используют внутренние решения микропипетка , которые содержат цезий (Cs +), широкий блокатор K + каналов (ключевые внутренние факторы возбудимость). При создании конфигурации целых клеток, диффузия Cs + в межклеточном пространстве будет блокировать K + каналы, и тем самым позволит как относительно эффективное пространство-зажим и предварительноотдушина влияние внутренних факторов на возбудимость других измерений. Вопросы Пространственно-зажим, то есть трудность напряжения-зажим вся клетка, возникают при записи неправильной формы клетки (например, нейроны) и особенно нейроны с обширной и сложной дендритов 18,19. Поскольку соматический зажим напряжение плохо контролирует напряжение в дереве дендритов нейронов, различные аспекты дендритных электрических сигналов исследуемых искажаются в дендритной расстояния-зависимым образом. В сочетании с фармакологическими средствами , такими как пикротоксином (гамма-аминомасляная кислота, ГАМК антагонист рецепторов) или кинуреновой кислоты (широкий блокатора рецепторов глутамата) , растворенного во внеклеточном растворе (искусственный спинномозговой жидкости, ACSF), эта методика позволяет измерять глутамата ГАМК и рецептором A R-опосредованной токи , соответственно.

В противоположность этому, внутренняя возбудимости обычно оценивается в режиме записи ток-зажим.В отличие от записи напряжения зажимом, этот режим записи позволяет измерять вариации мембранных потенциалов, вызванных ионных токов, протекающих через нейронную мембрану плазмы. Как правило, изменение в собственном возбудимости оценивается через изменения в способности для нейронов генерировать потенциалы действия, которые необходимы как Na + и K + каналы. Таким образом, при выполнении текущего хомута записи, микропипетки заполнены внутренним раствором , который содержит K + вместо Cs +. В сочетании с фармакологическими препаратами , которые блокируют глутамата и ГАМК токи рецептор-опосредованной , растворенные в ACSF, этот экспериментальный дизайн позволяет измерять вклад внутренних факторов (например, K + каналов) к нейрональной обжиге без загрязнена потенциальных изменений в синаптической возбудимости факторы.

В этой статье будут описаны основные необходимые процедурные шаги то (я) подготовить здоровые срезах мозга; (II) достижения конфигурации целой клетки, и (III) осуществляет мониторинг основных параметров для оценки синаптических и внутреннюю возбудимость.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Institutional уходу и использованию животных комитета Техасском путем, и были выбраны таким образом, чтобы свести к минимуму стресс, дискомфорт и боли, испытываемой экспериментальных животных.

1. Решения

Примечание: Подготовить микропипетки внутренние решения заранее. Для большинства основных экспериментальных целей, два вида решений должно быть достаточно: Cs + и K основанное + -На решений.

  1. -На Решения используют Cs + (например, Cs + раствор глюконата см Материалы) для напряжения прижимных экспериментов. Готовят при комнатной температуре.
    1. Приготовьте 117 мМ раствор Cs-глюконат путем смешивания 4,62 г D-глюконовой кислоты (~ 3.696 мл) с 3,54 г CsOH (~ 2,01 мл).
    2. Добавить DDH 2 O до 90 мл и дайте ему уравновешиваться в течение 30 мин.
    3. Добавьте твердые ингредиенты (20 мМ Hepes = 0,476 г; 0,4 мМ EGTA = 15,2 мг, 2,8 мМ NaCl, = 16,4 мг; 5 мМ тетраэтиламмония (ТЭА) Хлорид = 83 мг).
    4. Добавить DDH 2 O до ~ 97 мл.
    5. Доводят рН раствора с помощью 50% CsOH до 7,2 - 7,3.
    6. Проверьте осмолярность и правильно , если это необходимо с DDH 2 O.
      Примечание: Хороший диапазон составляет ~ 280 - 285 мОсм. Оптимальная осмолярность должна быть 15 - 20 мОсм ниже осмолярности стандартного ACSF (обычно 300 - 310 мОсм, 300 мОсм в нашей лаборатории). Осмолярность может варьироваться в зависимости от решений конкретных композиций.
    7. Аликвоты до 1000 мкл и хранить при температуре не выше -20 ° С.
    8. Приготовьте, аликвоты, замораживание, и добавить ATP / GTP для внутреннего решения в день записи.
      1. Добавить 64,63 мг АТФ до 10 мг ГТФ и растворяют в 637.11 мкл DDH 2 O.
      2. Готовят 10 мкл аликвоты и хранят при температуре или ниже -20 ° C. Смешайте каждый 100x аликвоты с 1000 мкл внутреннего раствора на день эксперимента. После того, как АТФ / ГТФ добавляется к внутреннему решению, поддерживать его на лед, чтобы предотвратить АТФ / GTP degradatiна.
  2. -На Решения Используйте K + (например, K-глюконат раствор, см Материалы) для обоих current- и напряжения зажим экспериментов , где K + кондактансы остаются функциональными , так что нейронная стрельбы может быть оценена. Готовят при комнатной температуре.
    1. Взвесить все материалы, в зависимости от желаемого конечного объема. Для приготовления 90 мл раствора, 120 мМ K-глюконат = 2,81 г; 20 мМ KCl = 0,149 г; 10 мМ HEPES = 0,238 г; 0,2 мМ EGTA = 0,008 г; 2 мМ MgCl 2 = 0,021 г.
    2. Используйте достаточно DDH 2 O , чтобы достигнуть 90% от конечного объема раствора. Это должно гарантировать, что достаточно места остается для рН и осмолярности регулировки.
    3. После добавления и смешивания всех ингредиентов, убедитесь, что раствор прозрачен перед измерением рН.
    4. Постоянно перемешивая раствор, доведения рН до 7,2 - 7,3 с использованием гидроксида K + (КОН).
    5. После доведения рН, используйте осмометр и объявлениепросто осмолярности до 280 - 285 мОсм.
      Примечание: Оптимальная осмолярность должна быть 15 - 20 мОсм ниже осмолярности стандартного ACSF (обычно 300 - 310 мОсм, 300 мОсм в нашей лаборатории). Осмолярность может варьироваться в зависимости от решений конкретных композиций.
    6. Аликвоты до 1000 мкл и хранить при температуре не выше -20 ° С.
    7. Приготовьте, аликвоты, замерзнет, ​​и добавьте ATP / GTP к внутреннему раствору в день записи (см шаг 1.1.8).
  3. Готовят 1 л стандартного ACSF (см Материалы).
    Примечание: Мы используем этот рецепт в нашей лаборатории при записи медиальных шиповатых нейронов (MSNs) в срезах мозга, однако, рецепты могут различаться в разных лабораториях, и, следовательно, мы рекомендуем экспериментатору использовать рецепт, который обычно используется при записи область мозга интереса ,
  4. Подготовьте рассечение ACSF (нарезки раствор, ~ 125 мл. Примечание: Точный объем будет зависеть от размера нарезания камеры, как она должна полностью погрузить мозг) для использования вшаги 2.2 - 2.8.
    1. Приготовьте 5 мМ кинуреновой кислоты (блокировать глутамат рецептор-индуцированных экзайтотоксическим процессов) в стандартном ACSF в достаточном объеме, чтобы погрузить мозг во время нарезки. Используйте для обработки ультразвуком, чтобы помочь растворить кинуреновой кислоту.
      Примечание: Длина ультразвуковой обработки может изменяться в зависимости от объема и количества твердых веществ в растворе. Растворы должны быть ясно, к концу процесса (около 1 - 2 мин в наших условиях).
    2. Охладить при продувании с 95% O 2, 5% газообразного СО 2 в ведро со льдом , пока температура не достигнет 0 - 2 ° C.
  5. Подготовка ACSF для записи.
    1. Взять 1 л стандартного ACSF (или любой другой влево из раствора, полученного на стадии 1.3), к которым соответствующие фармакологические агенты могут быть добавлены в зависимости от планируемых экспериментов.
      1. Например, добавьте 100 мкМ пикротоксином при записи возбуждающие постсинаптические токи или потенциалы (EPSCs или EPSPS), антагонисты рецепторов глутамата (kynureНИК кислота, 2 мМ; или сочетание D-APV 50 мкМ с CNQX 10 мкМ) при записи ингибирующие постсинаптические токи или потенциалы (ИПСК или IPSPs), и оба антагонисты рецептора пикротоксином и глутамата при оценке нейронную обжиг при отсутствии какого-либо влияния синаптических событий.

2. Кусочек Подготовка

  1. Построить или получить камеру регенерации срез.
    Примечание: Принцип для восстановления камеры проста и может быть сделано в лаборатории (рисунок 1). Вкратце, камера представляет собой сосуд, в котором корзина вставляется держать ломтики мозга на уровне, который ниже, чем на поверхности ACSF. Различные научные компании продают камеры восстановления срез.
    1. В качестве примера, получаем четыре кольца (4 - 6 мм высотой) (Фигура 1А, вид сбоку, б, вид сверху) путем разрезания 30 куб.см шприца. Затем клей растянуты сети (например, вырезанные из нейлона шлюшкид) на одной стороне кольца , чтобы удерживать срезы головного мозга (рис 1б) и склеивают кольца вместе.
      Примечание: клей пистолет может быть использован.
    2. После того, как все четыре кольца приклеены, клей изогнутую равнобедренной трапеции-образной пластиковой стенки до двух колец (рис 1А и В) , чтобы отвлечь пузырьков кислорода от выздоравливающих срезах мозга (рис 1C и D). Как показано на рисунке 1D, вставить кислорода диффундирующих систему ( в данном случае , газораспределительную трубку) на той же стороне, что и пластиковые стенки.
  2. До нарезка, кислородсодержащих соединений (95% O 2/5% CO 2) и охлаждения раствора для нарезки (см шаг 1.4) к 0 - 2 ° C.
  3. Заполните пользовательскую камеру регенерации со стандартным ACSF при комнатной температуре. Убедитесь, что ACSF хорошо насыщенной кислородом (20 - 30 мин, время может меняться в зависимости от объема камеры) до размещения ломтики в камере регенерации. Убедитесь в том, что пузырьки газа не вступают в прямой контактичность ломтиками или нарушать их.
  4. Линия vibratome льда лоток со льдом и залить холодной водой так, чтобы одна треть к половине нарезания камеры погружен в воду. Осторожно установите систему доставки кислорода (например, диффузию газа камень) и датчик температуры в камере нарезания так что ни деталь препятствует движению лезвия или манипуляции среза.
  5. Подготовьте область рассечение и инструменты, необходимые для извлечения мозга и рассечение нужную область мозга.
    Примечание: Точная рассечение выполняется будет зависеть от конкретного региона мозга изучали , как различные мозговые структуры потребует нарезка в разных плоскостях (например, корональные, сагиттальной или горизонтальных слоев.).
    1. Поместите следующие инструменты на лежащей снизу: головы мечом ножницы, скальпель, небольшие прямые острый кончик ножницы, катетеризация сосуда щипцы (или любого хирургического инструмента с широким наконечником, такие как кусачек, который больше подходит для черепов крыс), изогнутые кровоостанавливающие пинцеты, ТВтeezers, шпатель, черпая шпатель, фильтровальная бумага, чашки Петри, единственное лезвие края, и цианакрилатный клей.
  6. Когда температура достигает 0 - 2 ° C, перенесите нарезки решение нарезка камеры (буферный лоток).
  7. Обезболить мышь в высыханию камере с использованием изофлуран. Точное количество может изменяться в зависимости от размера камеры, используемой, но для небольшой обувной коробки клетки используют несколько капель (~ 3 - 4). Оставьте мышь в клетке, пока иммобилизовали (не отвечая на тактильные раздражители, около 15 сек для условий, описанных здесь). Выполните хвост и ноги прижимные испытания для того чтобы обеспечить животное глубоко под наркозом, то обезглавить перед тем сердце перестает биться (повышает жизнеспособность клеток).
    Примечание: При наличии соответствующего обоснования, некоторые лаборатории получить разрешение на выполнение живого обезглавливание, чтобы минимизировать как можно больше экзайтотоксическим процессов и повышения жизнеспособности клеток.
  8. Выполните рассечение.
    Примечание: мозг должен бытьбыстро экстрагируют (<45 сек).
    1. Используя скальпель отрезать поверхностную кожу на верхней части черепа от ростральной до хвостового.
    2. Очистите кожу головы на каждой стороне головы.
    3. Используя небольшие прямые острый кончик ножницы, разрезать interparietal пластину вдоль ламбдовидного швом, чтобы удалить мозжечок. Удалить затылочной кости.
    4. Используя те же ножницы, разрезать стреловидного шва.
    5. Двигайте канюляция судно щипцов (или кусачек, если поломка крыса череп) под каждым теменных костей и тянуть подвергать мозг.
    6. Использование изогнутых гемостаза щипцами, щепотка лобные кости, чтобы разорвать их, а затем использовать пинцет или катетеризация сосуда щипцов для удаления сломанных костей. Вырезать и удалить твердую мозговую оболочку как можно более осторожно, как это может помешать рассечение.
    7. Вставьте лопаточку ниже мозга и осторожно потяните мозг из черепа, чтобы поместить его в камеру нарезки (буфер лоток), предварительно заполненной ледяным ACSF. Пусть мозгостыть в течение 1 - 2 мин.
    8. Подготовьте рассечение платформу, заполняя чашку Петри со льдом и немного воды со льдом, чтобы позволить большую поверхность контакта, накройте ее крышкой и поместить фильтровальную бумагу на вершине. Смочить фильтровальную бумагу с холодным ACSF.
    9. После того, как мозг охлаждается, поместите мозг на льду заполненные чашки Петри, и быстро выполнить соответствующую рассечение для получения желаемой плоскости нарезания.
    10. Для получения сагиттальных, содержащих прилежащем ядре (NAC), использование одного края лезвия бритвы вырезать и удалить обонятельные бугорки и мозжечок, если они все еще присутствуют. Затем выполните сагиттальный разрез 2 - 3 мм от боковой границы правого полушария, чтобы получить плоскую поверхность, которая будет приклеена на образце крепежной пластиной (см шаг 2.8.11).
      Примечание: Режущий только 2 - 3 мм от боковой границы полушария позволит обеспечить сбор срезов, содержащих NAC из обоих полушарий. Соответствующая рассечение будет зависетьна области мозга, которая исследуется. Здесь, рассечение выполняется так NAC нейроны могут быть записаны в сагиттальных срезах мозга.
    11. Быстро клей (клей с помощью цианакрилатного прикладывается к образцу удерживающей пластине) плоской поверхности среза головного мозга на пластину в соответствии с желаемой плоскости нарезку. Для получения сагиттальных срезах мозга смотри стадию 2.8.10.
    12. Сразу же место и закрепить образец, удерживающие пластины в камере нарезания поэтому мозг разрезается ростро-каудально (для безопасности, установить держатель лезвия только тогда, когда образец пластина прикреплена).
    13. Установите vibratome с соответствующими параметрами нарезке (параметры , используемые в лаборатории для vibratome упомянутых в материалах: скорость 3 - 4, вибрации 9-10, и ломтик толщиной 250 мкм).
    14. После нарезки, используйте пластиковые урезанные пипетки передачи для передачи срезах мозга в камере регенерации (при комнатной температуре) (см шаг 2.3). Время восстановления может изменяться в зависимости от нейрональной типа, который при изучении(Как правило, 30 - 90 мин).

3. Запись Дозаторы и установка Подготовка

  1. Обратитесь к конкретным руководящим принципам руководства пользователя Съемник для получения требуемых свойств микропипетка.
    Примечание: Для получения множественных абонентских номеров, мы используем диапазон сопротивления пипетку 3.2-4.0 МОм.
  2. Оксигенировать ACSF и регулировать поток до 2 мл / мин. Вакуумный ACSF с помощью перистальтического насоса или вакуумных линий, установленных на объекте.
  3. Включите контроллер нагревателя перфузионного и регулировать настройки температуры для получения желаемой температуры (например, 31,8 - 32,2 ° C).
    Примечание: Температурная стабильность зависит от наличия как постоянный уровень ACSF и скорость постоянного потока в камере. Так как несколько биофизических свойств нейронов (например, входное сопротивление, R я, также называется сопротивление мембраны, R м) являются чувствительным к температуре, поддержание стабильной температуры имеет важное значение.
  4. Включите COMPUтер управляемый усилитель, камера, микроманипулятор и микроскоп фоновый свет. При выполнении эксперимента, который требует электрической стимуляции ткани, включите контроллер стимула и блока изоляции.
    Примечание: Некоторые усилители от других производителей рекомендуют "разминка" перед использованием, поэтому рекомендуется обратиться к руководству для точной операционной процедуры.
  5. Запустить захват камеры, обнаружение сигнала и программного обеспечения усилителя.
  6. Кусочек Размещение и визуализация:
    1. С помощью пипетки передачи пластиковые отделан кончиком, аккуратно потянуть в один срез мозга из камеры восстановления.
    2. Поместите передачи пипетки в записи камеры и слегка сжать кусочек из пипетки на покровное выстилающей дно камеры.
      Примечание: Пока нет переполнения не происходит, она безвредна иметь некоторую ACSF из камеры восстановления разливая в ванну.
    3. Используйте пинцет, чтобы изменить положение НарезкаO желаемая область будет помещена точно в центре камеры записи. С помощью микроскопа малой мощности (4X) объектив и окуляр для помощи в позиционировании.
    4. После того, как желаемое положение достигнуто, зафиксировать положение среза мозга с ломтиком прижимом (также известный как "арфа") в камере.
    5. Переключиться на высокой мощности (40х) объектива и аккуратно опустите его до контакта образуется с ACSF в камере.
    6. С помощью точной регулировки колеса, чтобы принести ткани в фокусе. В то время как в контакте с ACSF, не используйте грубой настройки колеса на микроскоп как снижение объектива чрезмерно может раздавить срез или даже сломать крышку релайнинг в нижней части камеры, что может привести к ACSF проливать на конденсаторе и повредить его.
    7. Когда фокус находится на уровне тканей, наблюдать клетки в целевой области для формы. Мертвые клетки легко идентифицировать по их опухшей плазматической мембраны и ядра (<сильный> Рисунок 1E). Здоровые клетки должны появиться как круглые, яйцевидные или эллиптические однородных структур (рис 1E).
    8. Посмотрите на клетку-мишень. Отметьте его на экране компьютера для того, чтобы помочь микропипетки записи. При использовании программного обеспечения, таких как QCapture, нарисуйте квадрат вокруг клетки-мишени, удерживая левую кнопку мыши.
    9. Поднимите линзу объектива, так что будет достаточно свободного пространства в конус, образованный линзой объектива, находящейся в контакте с ACSF размещать и перемещать микропипетки записи.
  7. Микропипетки Размещение и позиционирование
    1. С помощью 1 мл шприц, неметаллический микрошприцом иглу и специальный фильтр, заполнить микропипетки с внутренним раствором , приготовленным заранее в соответствии с запланированным экспериментом (K + или Cs основанное + -На внутреннее решение, см шаги 1.1., 1.2 и материалы для композиции). Используйте достаточное количество раствора таким образом, внутреннийРешение вступает в контакт с хлоридом покрытием серебряной проволоки электрода в держателе микропипетки.
      Примечание: серебряный электрод провод может быть хлорируют, погрузив его в бытовой отбеливатель. Нуклеозидтрифосфатов (АТФ и ГТФ) могут быть добавлены к внутренним раствором непосредственно перед использованием. Держите шприц, содержащий раствор на льду для предотвращения деградации АТФ / ГТФ.
    2. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков в микропипетки, поскольку они могут выйти в то время как микропипетка находится в ткани и затенить срез.
    3. Поместите микропипетки в держатель электрода, так что раствор вступает в контакт с хлоридом покрытием из серебра электродной проволоки.
    4. Затянуть пипеток колпачок таким образом, чтобы конус шайба образует уплотнение вокруг микропипетки.
    5. Нанести положительное давление перед погружением микропипетки в ACSF, чтобы предотвратить попадание посторонних частиц пипетку.
    6. Поместите headstage в запертом положении (обращенной к камере), и с помощью микроманипулятора, гТ О Р А его вниз по направлению к камере, так что примерно под центром погруженной цели.
    7. При перемещении микропипетки с микроманипулятора (устанавливается на средней и высокой скорости), использовать экран компьютера, чтобы определить местонахождение микропипетки и направлять его в сторону расположения ячейки на оси XY.
    8. Измерьте сопротивление микропипетки путем применения шагового напряжения (например, 4 мВ в течение 100 мс), что может быть осуществлено вручную или автоматически с помощью специального программного обеспечения , такие , как режим "ванна" при использовании "пленочного Test" в программном обеспечении Clampex (см также этап 4) , Для того , чтобы убедиться , что нет воздушных пузырьков или любые другие посторонние предметы не блокируют микропипетки, применять положительное давление с помощью заполненных воздухом шприц (например, 30 мл шприц) , соединенный с держателем микропипетки с полиэтиленовой трубкой.
    9. После очистки микропипетки, выполнить напряжение смещения, чтобы уменьшить пипеток тока до нуля, что можно осуществить вручную или с помощью специального программного обеспечения, такие как & #39; пипетку смещение 'на командира усилителя с компьютерным управлением.
      Примечание: Эта функция будет компенсировать любое напряжение , вызванное концентрацией различий между ванной и микропипетки решений (то есть, потенциал перехода жидкости 20).

4. Тест Мембрана

Примечание: Этот шаг относится к усилителю упоминаемых в материалах.

  1. При использовании командира усилителя с компьютерным управлением, всегда устанавливайте его на режиме напряжения зажим для проведения испытания мембраны.
    Примечание: Если тест мембрана находится в режиме "Баня", тест мембрана позволяет измерять сопротивление микропипетки и сопротивление уплотнения, когда образуется уплотнение.
  2. После того , как мембрана разрушается (см шаг 5.8), переключить тест мембраны в режим "Cell" , так что последовательное сопротивление (R S) (также называемое сопротивлением доступа, R а), R I и мембранные емкости (С р)быть получены.

5. Окончательный подход, печать Формирование и получение конфигурации цельноклеточная

  1. Использование тонкой фокусировки колесо, начать фокусировку вниз при одновременном снижении микропипетки постепенно. Всегда фокусируйтесь вниз, а затем опустить микропипетки вниз к плоскости фокуса. Это гарантирует, что кончик микропипетки не будет внезапно проникать в срезе.
  2. Когда микропипетка приходит в контакт с поверхностью среза, замедлить скорость Микроманипулятор в режиме средней низкой.
  3. Осторожно применять легкое положительное давление со шприца заполненного воздухом, соединенным с держателем пипеткой, чтобы очистить любой мусор с траектории захода на посадку.
  4. Подход клетки либо чередованием с помощью ручек управления XYZ, или путем обращения к диагонали (если модель микроманипулятор позволяет), когда обе оси XZ ​​изменяются с вращением ручки оси Z. Последний метод предотвращает вертикальное сжатие ткани.
    Примечание: В данном случае цель состоит в томприближаться к клетке, нанеся минимальный ущерб среза. Когда микропипетки находится достаточно близко к камере появляется ямка (круглой обесцвечиванию поверхности клетки , вызванного положительным давлением , приложенным через кончик микропипетки) (рисунок 2).
  5. При появлении ямка (Рисунок 2-1), нанесите его слабое и кратко отсоса через трубку, которая соединена с всасывающей трубкой держатель пипетки, чтобы создать уплотнение (Рисунок 2-2). Продолжайте мониторинг тест мембраны.
    Примечание: Если частичное уплотнение образуется (<1 ГОм), инъекционные отрицательные токи за счет снижения удерживающий потенциал (на командира усилителя с компьютерным управлением) может способствовать формированию уплотнения и достичь gigaohms сопротивления ( "gigaohm печать" или "gigaseal"> 1 - 5 ГОм). Высокое сопротивление уплотнения (> 1 ГОм) оба загрязнения ограничения шума записанного сигнала и внести свой вклад в механическую устойчивостьпатч.
  6. В то время как gigaseal формируется, с помощью управляемого компьютером командира усилителя , чтобы довести удерживающую потенциал ячейки как можно ближе к физиологическому потенциал покоя (V покоя), чтобы предотвратить внезапные изменения , как только мембрана разрушается. Например, MSNs, как правило , напряжения зажимается при -70 или -80 мВ (физиологический V покоя: от -70 до -90 мВ).
  7. После того, как gigaseal сформировал, компенсировать быстрой и медленной емкости вручную или автоматически. При использовании командира усилителя с компьютерным управлением, такие как командующий Multiclamp, нажмите кнопку 'Auto' для 'Cp Fast' и 'Cp Slow ".
  8. Если уплотнение остается стабильной и выше 1 ГОм (или инъекций менее 10 - 20 мкА , чтобы держать клетку на желаемом мембранного потенциала), применяют краткое и сильное всасывание через такой же трубы , как в 5.5 , чтобы привести к разрыву плазматической мембраны (рисунок 2 -3).
    Примечание: Это может занять несколько судебных процессов. Хороший разрыв мембраны достигается шКурица всасывания выполняется достаточно сильно , так что разорванная мембрана не закупоривает микропипетки (что может привести к увеличению R s во время записи), но достаточно слабо для того , чтобы не втягивать значительной части мембраны или клетки.
  9. После достижения успешной конфигурации целой клетки, регулярно контролировать местоположение микропипетки для оценки и коррекции существенного дрейфа, поскольку это может привести к потере патча. Амплитуда Дрейф может варьироваться в зависимости от нескольких факторов, например, качество монтажа буровой установки и тянущие усилия на headstage. В идеале, дрейф должен быть почти не существует.
  10. При переключении в режим "Cell" в тесте мембраны, просматривать различные параметры ячейки , такие как R I, R s и C р. Мониторинг этих параметров во время записи.
    Примечание: Все эти параметры могут помочь оценить начальное состояние здоровья клеток и типов клеток (см "тест мембрана" раздел, шаг 4).
  11. После того, как гое выше шаги будут завершены, остаются в режиме напряжения зажим для измерения токов (например, EPSCs, ИПСК), или перейти в режим текущего зажима , если планирование для измерения изменений мембранного напряжения (например, потенциал действия стрельбы). Что касается последнего, придать положительный или отрицательный ток, чтобы держать ячейку в требуемое напряжение мембраны (чтобы выполнить этот шаг, обратитесь к усилителю руководство).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Температура, фактор , который легко управляется экспериментатором, влияет на биофизические свойства ионных каналов и рецепторов, и , таким образом , форма волны постсинаптических токов (ЧОК) (EPSC и иПСК) и способности нейронов , чтобы вызвать спайки. Рисунок 3 и н...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает основные процедуры для выполнения целого клеточных экспериментов патч-зажим на нейроны в срезах мозга. Однако сложность, потенциал и чувствительность данного метода не может быть полностью описана в этой статье. Здесь мы попытались обрисовать самые основные ш...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Ни один из авторов не имеют конкурирующие интересы или противоречащие друг другу интересы.

Благодарности

Это исследование было поддержано за счет средств запуска UT Юго-Западного (SK).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Isolated pulse stimulus generatorA.M.P.IMaster-8
Isolation unit (ISO-Flex)A.M.P.IISO-Flex
Computer controlled Amplifier Molecular DevicesMulticlamp 700B
Digital Acquisition systemMolecular DevicesDigidata 1500
MicroscopeOlympusBX-51
MicromanipulatorSutter InstrumentsMPC-200
Chamber and in-line HeaterWarner InstrumentsTC-344B
Vibratome SlicerLeica VT1000 S
Micropipette PullerNarishigePC-10
Imaging CameraQ ImagingQIClick-F-M-12
Narishige pipette puller PC-10NarishigePC-10
Glass capillariesWPITW150F-3
Slice hold-down (harp)Warner Instruments64-0255
Slice ChamberWarner InstrumentsRC-26
Nonmetallic syringe needleWorld Precision InstrumentsMF28G67-5
Syringe filtersNalgene176-0045
Glue GunHome Depotvarious
Gas dispersion tubeAce Glass Inc.various
Decapitation scissorsHome Depot100649198
Scalpel Handle #3World Precision Instruments500236
Small straight sharp tips scissorsWorld Precision Instruments14218
Vessel canulation forceps World Precision Instruments500453
Curved hemostatic forcepsWorld Precision Instruments501288
Economy Tweezers #3World Precision Instruments501976-6
SpatulaFisher Scientific14357Q
Scooping spatulaFisher Scientific14-357Q
Petri dishFisher Scientific08-747B
Filter paperLab DepotCFP1-110
Solutions
Cs-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
D-gluconic acid 50% Sigma Aldrich/variousG1951
Cesium-OH (CsOH) 50% Sigma Aldrich/various232041
NaCl, 2.8 mMSigma Aldrich/variousS7653
HEPES, 20 mMSigma Aldrich/variousH3375
EGTA, 0.4 mMSigma Aldrich/variousE4378
tetraethylammonium-Cl, 5 mMSigma Aldrich/variousT2265
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/variousG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/variousA9187
K-Gluconate internal solution (pH 7.2–7.3, 280–290 mOsm)
K D-gluconate, 120 mMSigma Aldrich/variousG4500
KCl, 20 mMSigma Aldrich/variousP3911
HEPES, 10 mMSigma Aldrich/variousH3375
EGTA, 0.2 mMSigma Aldrich/variousE4378
MgCl2Sigma Aldrich/variousM8266
Na2GTP, 0.3 mMSigma Aldrich/variousG8877
MgATP, 2 mMSigma Aldrich/variousA9187
Standard artificial cerebrospinal fluid (ACSF, osmolarity ≈ 300-310 mOsm)
KCl, 2.5 mMSigma Aldrich/variousP3911
NaCl, 119 mMSigma Aldrich/variousS7653
NaH2PO4•H2O, 1 mMSigma Aldrich/variousS9638
NaHCO3, 26.2 mMSigma Aldrich/variousS8875
Glucose, 11 mMSigma Aldrich/variousG8270
MgSO4-7H2O, 1.3 mMSigma Aldrich/various230391
CaCl2-2H2O, 2.5 mMSigma Aldrich/variousC3881
Additional compounds used for solutions preparation
KOHvarious
Kynurenic acidSigma Aldrich/variousK3375

Ссылки

  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).
  3. Cahalan, M., Neher, E. Patch clamp techniques: an overview. Methods Enzymol. 207, 3-14 (1992).
  4. Staley, K. J., Otis, T. S., Mody, I. Membrane properties of dentate gyrus granule cells: comparison of sharp microelectrode and whole-cell recordings. J Neurophysiol. 67 (5), 1346-1358 (1992).
  5. Horn, R., Marty, A. Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method. J Gen Physiol. 92 (2), 145-159 (1988).
  6. Pusch, M., Neher, E. Rates of diffusional exchange between small cells and a measuring patch pipette. Pflugers Arch. 411 (2), 204-211 (1988).
  7. Kandel, E. R., Dudai, Y., Mayford, M. R. The molecular and systems biology of memory. Cell. 157 (1), 163-186 (2014).
  8. Kourrich, S., Bonci, A. Chapter 5: Synaptic and Neural plasticity. Neurobiology of Mental Illness. 4th edn. , Oxford University Press. (2013).
  9. Mozzachiodi, R., Byrne, J. H. More than synaptic plasticity: role of nonsynaptic plasticity in learning and memory. Trends Neurosci. 33 (1), 17-26 (2010).
  10. Zhang, W., Linden, D. J. The other side of the engram: experience-driven changes in neuronal intrinsic excitability. Nat Rev Neurosci. 4 (11), 885-900 (2003).
  11. Kourrich, S., Calu, D. J., Bonci, A. Intrinsic plasticity: an emerging player in addiction. Nat Rev Neurosci. 16 (3), 173-184 (2015).
  12. Luscher, C., Malenka, R. C. Drug-evoked synaptic plasticity in addiction: from molecular changes to circuit remodeling. Neuron. 69 (4), 650-663 (2011).
  13. McEwen, B. S., Morrison, J. H. The brain on stress: vulnerability and plasticity of the prefrontal cortex over the life course. Neuron. 79 (1), 16-29 (2013).
  14. Sandi, C., Haller, J. Stress and the social brain: behavioural effects and neurobiological mechanisms. Nat Rev Neurosci. 16 (5), 290-304 (2015).
  15. Kim, S. J., Linden, D. J. Ubiquitous plasticity and memory storage. Neuron. 56 (4), 582-592 (2007).
  16. Ganguly, K., Poo, M. M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  17. Kullmann, D. M., Moreau, A. W., Bakiri, Y., Nicholson, E. Plasticity of inhibition. Neuron. 75 (6), 951-962 (2012).
  18. Bar-Yehuda, D., Korngreen, A. Space-clamp problems when voltage clamping neurons expressing voltage-gated conductances. J Neurophysiol. 99 (3), 1127-1136 (2008).
  19. Williams, S. R., Mitchell, S. J. Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons. Nat Neurosci. 11 (7), 790-798 (2008).
  20. Neher, E. Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments. Methods Enzymol. 207, 123-131 (1992).
  21. Defelice, L. J. Electrical Properties of Cells-Patch Clamp for Biologists. , Plenum Press. (1997).
  22. Kornreich, B. G. The patch clamp technique: principles and technical considerations. J Vet Cardiol. 9 (1), 25-37 (2007).
  23. Molleman, A. Patch Clamping: An Introductory Guide To Patch Clamp Electrophysiology. , John Wiley & Sons, Ltd. (2003).
  24. Neher, E., Sakmann, B. The patch clamp technique. Sci Am. 266 (3), 44-51 (1992).
  25. Richerson, G. B., Messer, C. Effect of composition of experimental solutions on neuronal survival during rat brain slicing. Exp Neurol. 131 (1), 133-143 (1995).
  26. Tanaka, Y., Tanaka, Y., Furuta, T., Yanagawa, Y., Kaneko, T. The effects of cutting solutions on the viability of GABAergic interneurons in cerebral cortical slices of adult mice. J Neurosci Methods. 171 (1), 118-125 (2008).
  27. Ye, J. H., Zhang, J., Xiao, C., Kong, J. Q. Patch-clamp studies in the CNS illustrate a simple new method for obtaining viable neurons in rat brain slices: glycerol replacement of NaCl protects CNS neurons. J Neurosci Methods. 158 (2), 251-259 (2006).
  28. Kourrich, S., et al. Dynamic interaction between sigma-1 receptor and Kv1.2 shapes neuronal and behavioral responses to cocaine. Cell. 152 (1-2), 236-247 (2013).
  29. Kourrich, S., Klug, J. R., Mayford, M., Thomas, M. J. AMPAR-Independent Effect of Striatal aCaMKII Promotes the Sensitization of Cocaine Reward. J Neurosci. , (2012).
  30. Kourrich, S., Rothwell, P. E., Klug, J. R., Thomas, M. J. Cocaine experience controls bidirectional synaptic plasticity in the nucleus accumbens. J Neurosci. 27 (30), 7921-7928 (2007).
  31. Kourrich, S., Thomas, M. J. Similar neurons, opposite adaptations: psychostimulant experience differentially alters firing properties in accumbens core versus shell. J Neurosci. 29 (39), 12275-12283 (2009).
  32. Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Environmental novelty causes stress-like adaptations at nucleus accumbens synapses: implications for studying addiction-related plasticity. Neuropharmacology. 61 (7), 1152-1159 (2011).
  33. Rothwell, P. E., Kourrich, S., Thomas, M. J. Synaptic adaptations in the nucleus accumbens caused by experiences linked to relapse. Biol Psychiatry. 69 (11), 1124-1126 (2011).
  34. Koya, E., et al. Silent synapses in selectively activated nucleus accumbens neurons following cocaine sensitization. Nat Neurosci. 15 (11), 1556-1562 (2012).
  35. Conrad, K. L., et al. Formation of accumbens GluR2-lacking AMPA receptors mediates incubation of cocaine craving. Nature. 454 (7200), 118-121 (2008).
  36. Kruskal, P. B., Jiang, Z., Gao, T., Lieber, C. M. Beyond the patch clamp: nanotechnologies for intracellular recording. Neuron. 86 (1), 21-24 (2015).
  37. Novak, P., et al. Nanoscale-targeted patch-clamp recordings of functional presynaptic ion channels. Neuron. 79 (6), 1067-1077 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Neuroscience112

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены