Формирование гигантского размера Polymersomes гель-регидратация при содействии

Резюме

We present a protocol to rapidly form giant polymer vesicles (pGVs). Briefly, polymer solutions are dehydrated on dried agarose films adhered to coverslips. Rehydration of the polymer films results in rapid formation of pGVs. This method greatly advances the preparation of synthetic giant vesicles for direct applications in biomimetic studies.

Аннотация

Polymer vesicles, or polymersomes, are being widely explored as synthetic analogs of lipid vesicles based on their stability, robustness, barrier properties, chemical versatility and tunable physical characteristics. Typical methods used to prepare giant-sized (> 4 µm) vesicles, however, are both time and labor intensive, yielding low numbers of intact polymersomes. Here, we present for the first time the use of gel-assisted rehydration for the rapid and high-yielding formation of giant (>4 µm) polymer vesicles (polymersomes). Using this method, polymersomes can be formed from a wide array of rehydration solutions including several different physiologically-compatible buffers and full cell culture media, making them readily useful for biomimicry studies. This technique is also capable of reliably producing polymersomes from different polymer compositions with far better yields and much less difficulty than traditional methods. Polymersome size is readily tunable by altering temperature during rehydration or adding membrane fluidizers to the polymer membrane, generating giant-sized polymersomes (>100 µm).

Введение

Создание синтетических клеток размера, гигантских однослойных везикул (GUVs) представляет все больший интерес в восстановлении в пробирке различных клеточных процессов для создания основы для генерации клеточного типа ^1,2 искусственной системы. В то время как GUVs, состоящие из липидных мембран являются отличными подражает природных, биологических мембран, они неустойчивы против экологических колебаний и имеют достаточно короткий срок годности. Из-за этих ограничений, амфифильные блок-сополимеры, которые были использованы в качестве липидного мимике с образованием полимерных везикул, или polymersomes. В этом контексте polymersomes имеют преимущество в развитии биомиметические клеточных систем , из - за их повышенной стабильности ^3, химической универсальностью ^4,5 и модифицируемые физические черты ^{6 - 8.}

Современные методы для формирования гигантских размеров polymersomes включают electroformation ⁹ и шаблонного регидратант ^10, оба из шHICH отнимают много времени, трудоемкими, требуют специализированного оборудования и производить низкие урожаи нетронутых гигантских polymersomes. Простой гель-полуавтоматическим методом регидратации недавно был разработан для производства липидных GUVs ^11. Здесь мы описываем адаптацию геля при содействии метода регидратации для создания гигантских polymersomes с различными полимерных композиций, регулируемый размер, а также в различных буферных композиций.

Вкратце, 1% вес / объем стандартной гель-электрофореза в агарозном ДНК пленок обезвоживают на покровным стеклом. Полимерные растворы, полученные в хлороформе, затем распространяются по всей обезвоженной агарозном пленки и дают испариться. После полного удаления растворителя, полимерные пленки регидратации в буфере выбора при умеренном нагревании (40-70 ° C) и гигантских (> 4 мкм) образуются размером polymersomes в течение 30 мин. Этот метод быстро производит сотни полностью неповрежденных, хорошо образованных polymersomes с использованием стандартного лабораторного оборудования и ReageNTS при минимальных затратах.

Рисунок 1. Схема изображающая гелю полуавтоматическим методом регидратации. Гигантские polymersomes , состоящие из диблоксополимером образуются после ~ 30 мин регидратации. Гидрофильный блок обозначается пурпурным цветом и гидрофобный блок обозначается зеленым цветом. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

протокол

1. Полимер и Агарозном Приготовление

Примечание: перчатки и лабораторный халат следует носить в любое время на протяжении всего этого протокола. Защитные очки аналогичным образом требуются при работе с любым органическим растворителем или любой стадии с возможным разбрызгивание.

1. Приготовьте 5 мг / мл раствора полимера в хлороформе. Добавить 1 мл хлороформа до 5 мг твердого поли (этиленоксида) - b- поли (бутадиен) (ПЭО-PBD, EO ₂₂ -BD ₃₇₎ диблок - сополимера , в стеклянной пробирке и водоворот , чтобы полностью раствориться. Выполните все шаги с использованием хлороформа в химическом вытяжном шкафу.
2. Смешайте в флуоресцентно-меченного липида (купленного уже растворили в хлороформе) при 0,5 моль конечной концентрации в 99,5% мол немеченого полимера%.
   1. Например, пипетка ~ 12 мкл 1 мг / мл флуоресцентно - меченного липида в хлороформе А в 997.58 мкл ПЭО-PBD, EO ₂₂ -BD ₃₇ полимера в хлороформе (с молекулярной массой 2950 дальтон) при конечной концентрации 0.5% мол меченый липид смешивают и 99,5% мол полимера.
   2. Решение Хранить в герметичном флаконе с хлороформом устойчивостью крышкой при -20 ° C. Оберните сантехников ленту на флаконе края, где винты крышки на флаконе и закрепить крышку на флаконе. Обертка еще один кусок монтажников ленты на внешней стороне крышки, и, наконец, обернуть парафином на внешней стороне ленты, чтобы обеспечить минимальное испарение.
3. Сделать 1% вес / объем раствора агарозы путем смешивания 0,5 мг стандартного агарозы в 50 мл воды (или 50 мл 100 мМ сахарозы) в колбе Эрленмейера объемом 250 мл. Кипение агарозы решение в стандартной микроволновой печи в течение ~ 1 мин (или до полного растворения, как отмечено корчеванием раствора).
   Примечание: раствор агарозы можно использовать после того, как несколько минут охлаждения или дают затвердеть, хранить и повторно плавят с использованием той же процедуры.

2. Фильм Подготовка Агарозном

1. Отрежьте конец офф 1000 мкл кончика пипетки, чтобы предотвратить засорение. Используя кончик вырезать, пипетка 300 мкл талой раствора агарозы на квадрат покровного стекла 25 мм непосредственно от производителя.
2. Разрешить агарозы, чтобы остыть до ~ 65-75 ° С до осаждения. Если агарозном слишком холодно, она начнет группироваться на поверхности в процессе распространения. И наоборот, если в агарозном слишком жарко, она потребует более раскидистой придерживаться агарозы на поверхности.
3. Держите только край покровного стекла с пальцами в перчатках и использовать длинный край еще 1000 мкл кончика пипетки, чтобы распространить агарозы равномерно по всей поверхности покровного стекла. Перемещение кончика пипетки назад и вперед через покровное пока агароза полностью не придерживается и охватывает покровное.
4. Поместите агарозный покрытием покровное на кусок Parafilm с агарозном лицевой стороной вверх. После того, как желаемое количество покровные с покрытием, поместите парафином с покровные в инкубаторе C 37 ° к обезвоживанию агарозы на поверхность, по крайней мере 1 часа.
   Примечание: Обезвоживаниеопределяется исчезновением видимого слоя агарозы; покровное должен выглядеть плоским и ясно. После того, как пленки полностью обезвожен, магазин с покровные поверхность агарозы лицевой стороной вверх в одноразовой пластиковой чашке Петри.

3. Полимерная Образование пленки

1. Пипеток 30 мкл готовили раствор полимера на агарозном пленку.
2. Держите только край покровного стекла с пальцами в перчатках и использовать длинную кромку 18 G иглы, чтобы распространить решение по агарозных пленок с использованием кругового движения расширения спектра. Продолжить распространение до тех пор, пока раствор не испаряется.
   Примечание: Будьте осторожны с острым концом иглы.
3. Поместите полимерные пленки в пластиковой чашки Петри стороне полимерной лицевой стороной вверх и поставить чашку Петри в стандартный дом вакуум-эксикаторе, покрытой алюминиевой фольгой (чтобы предотвратить фотообесцвечивание меченых липидов) в течение по крайней мере 1 часа, чтобы полностью удалить остатки растворителя.

4. Формирование Polymersomes

1. Привяжите coverwell, либо самодельный полидиметилсилоксана (PDMS) хорошо (ап ~ 0,5 см толщиной блок излеченных PDMS с диаметром ~ 1 см от середины штампуют) или коммерчески доступным хорошо покровного покрытой полимерной пленкой. Нажмите coverwell мягко на покровное с полимерным покрытием с полимером, обращенной вверх, пока герметичное уплотнение не образуется между coverwell и покровное. Будьте осторожны, чтобы не нажимать слишком сильно и сломать покровное.
2. Добавить 200-500 мкл раствора для регидратации (вода хорошо, но массив буферов или медиа также работает) в камеру (объем регидратации зависит от размера coverwell приклеен).
3. Создание камере влажности, чтобы уменьшить испарение раствора регидратации. Поместите свернутый, мокрый Kimwipe по краям стеклянной чашке Петри. Поместите полимерную пленку с прилипшей coverwell в камеру влажности и накрыть крышкой. Накройте чашку Петри с алюминиевой фольгой, чтобы минимизировать фотообесцвечивания. Месточашку Петри на горячей плите устанавливается до 40 ° С в течение по меньшей мере 30 мин.
4. Отрегулируйте температуру горячей пластины во время регидратации от 24-70 ° C , чтобы настроить размер пузырьков , образованных (рисунок 5). 70 ° C находится вблизи Т _м агарозы так осторожность следует использовать , когда идет за пределы этой температуры.

5. Характеристика Polymersomes с помощью флуоресцентной восстановления после фотообесцвечивания (FRAP)

1. Перемещение покровное с приклеенный coverwell непосредственно к инвертированный микроскоп для работы с изображениями.
2. Выберите соответствующий набор фильтров, основанный на флуоресцентном липида, включенного в раствор полимера. Для родамина меченных липидов, легированного в растворах полимеров, использовать 560/25 нм фильтра возбуждения и фильтр 607/36 нм излучения, или сопоставимые наборы фильтров.
3. Используйте объектив 100X масла, чтобы сосредоточиться на верхней поверхности покровного стекла, где будет приклеена на polymersomes. Если polymersomes особеннобольшой (> 20 мкм) или , если полимерная пленка является слишком толстой, более низкая цель мощности (например, 40X) следует использовать , чтобы лучше визуализировать polymersomes.
4. Определение polymersomes с помощью флуоресцентной микроскопии. Определение polymersomes характерным полые сферические везикулы с диаметром> 5 мкм.
5. Охарактеризовать текучесть мембран с использованием флуоресценции восстановления после фотообесцвечивания (FRAP) на флуоресцентный микроскоп, содержащий регулируемый конденсатор. Из-за клейкого характера и плотной упаковки polymersomes на подложках, естественное движение polymersomes ограничивается, повышение качества изображения FRAP.
   1. Фокус микроскопа на polymersome интереса. Закройте конденсатор малой области и обеспечить, чтобы край polymersome находится в пределах области формирования изображения, представляющей интерес.
   2. Увеличение экспозиции камеры и убедитесь, что все фильтры нейтральной плотности, удаляются эффективно photobleach область интереса. Разрешить мембранный фл uorescence интенсивности к photobleach в течение 30-60 сек, или пока интенсивность флуоресценции значительно уменьшается.
   3. Выключите лампу и полностью открыть конденсатор. Уменьшение экспозиции в исходное настройки и начать сразу же захвата изображений каждые 30 секунд в течение 3 мин.
   4. Расчет коэффициентов диффузии мембран , используя стандартные методы ^12. Если беленой область вновь обретает интенсивности флуоресценции в течение 3-5 мин, это указывает на то, что мембрана является жидкость.

6. Характеристика Polymersome Размер

Рисунок 6. Процесс для анализа размеров polymersomes с использованием программного обеспечения обработки изображений. Шаг за шагом инструкции о том , как измерить диаметр пузырьков , образованных. Пользователь должен знать калибровки единицы в пикселях / мкм микроскопа, используемого.ove.com/files/ftp_upload/54051/54051fig6large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Открыть полученные изображения polymersomes в программное обеспечение для анализа изображений ^13.
2. Установите масштаб для изображения, нажав на поле анализировать выпадающего и нажав кнопку "заданного масштаба".
   1. Откалибровать шкалу для микроскопа с использованием стандартных методов (т.е. микрометра).
   2. Заполните калибровки единиц и нажмите кнопку "ОК".
3. Нажмите на панели инструментов линии и нарисуйте линию, охватывающую диаметр везикулы.
4. Собирают измерения длины, нажав на поле анализировать выпадающего и нажав кнопку "измерить".
5. Продолжить измерения индивидуальных везикулы, следуя описанной выше процедуре и каждого нового будет добавлено к окну измерений данных измерений.
6. Нажмите "Ctrl + D" после нанесения каждой линии и измерения длины впечатывать линию, проведенную наИзображение что делает его легче отслеживать, какие везикулы были проанализированы.

Результаты

Polymersomes были сформированы с использованием процедуры , описанной выше (рисунок 1) и общего лабораторного оборудования , показанного на рисунке 2. Polymersomes были регидрировали деионизированной водой (рисунок 3) и изображается на инвертированный микроскоп в эпифлуоресцентной с использованием объектива 100X масла. Обратите внимание, что если polymersomes не видно, что они могли образоваться в размерах слишком велики, чтобы захватить с целью 100X нефти; нижняя цель питания может потребоваться использовать вместо этого. Одним из преимуществ использования геля при содействии регидратации является универсальность формирования polymersomes в различных растворах регидратации. Polymersomes были успешно сформированы в деионизированной воде, полной среде для культивирования клеток млекопитающих, растворов сахарозы и двух физиологически соответствующих буферных растворов (фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) , или трис-буферном солевом растворе (TBS)), как показано на рисунке 4. В стандартных условиях (регидратациис водой при 40 ° С в течение 1 ч), более чем ~ 70 polymersomes обычно находятся на 40 х 40 мкм ² поля зрения. В то время как производство поверхность polymersomes не однородна, существуют десятки полей зрения с этим представительным выходом. Кроме того, polymersomes были стабильны в растворе в течение по крайней мере 24 часов.

размер Polymersomes легко настраивается с помощью станавливающим полимерных пленок при различных температурах. Polymersomes образовавшиеся в деионизированной воде при комнатной температуре, имели средний диаметр 2,9 ± 0,7 мкм. По мере повышения температуры во время повторной гидратации, средний размер polymersomes также увеличивается (таблица 1). При высоких температурах (> 60 ° C), polymersomes , образованные с размерами даже больше , чем 100 мкм (рисунок 5).

Вся обработка изображения была завершена с использованием программного обеспечения обработки изображений с открытым исходным кодом (рисунок 6).Изображения, собранные были открыты в программе. Калиброванный размер пикселя был введен в установленной шкалы поле. С помощью инструмента линии, линии были нарисованы по диаметрам. После того, как каждая отдельная линия была разработана, калиброванный длина была измерена и добавлена ​​в поле результатов. Данные затем могут быть нанесены на программно - математического обеспечения выбора (например, Excel, Prism, происхождения и т.д.)

. Рисунок 2. Рисунок из общих и недорогих лабораторных материалов , необходимых для формирования polymersomes элементов , необходимых являются: парафильмом, 18,5 G игла, полимер в хлороформе или другом соответствующем растворителе, в 1000 мкл пипетки, коническую колбу, пинцет, агарозы, 25 мм квадратных покровные, PDMS скважины формирования изображений и стекла чашку Петри. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобыпросмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3. Фотографии гель-полуавтоматическим методом регидратации. Растворенный агарозном распространяется на 25 мм квадратный покровное , пока ровным слоем покрывает весь покровное. Покровные затем помещают в 37 ° С инкубатор и пленка обезвоживается. Полимерный раствор осаждают на обезвоженном агарозном пленку и распространение с помощью иглы в круговом движении. Покровное затем поместить в эксикатор O / N, чтобы полностью испарить любой растворитель, остатки. И, наконец, и камера изображения приклеивают к подложке и полимеры регидратации с раствором выбора и помещают в чашку Петри при 40 ° С в течение не менее 25 мин , чтобы обеспечить формирование polymersomes. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этого цифра. >

Рисунок 4. Polymersomes могут образовывать в различных различных буферах. ПЭО-PBD полимерные пленки регидратации с указанным буфером при 40 ° С в течение 1 часа. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Повышение температуры во время повторной гидратации увеличивает размер polymersomes. Представительные эпифлуоресцентной образы polymersomes , образующихся в воде при указанных температурах регидратации. Повышение температуры приводит к более крупных polymersomes. Шкала бар = 10 мкм._blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Температура (° C)	Средний размер (мкм)
24	2,93 ± 0,7
40	5,76 ± 2,5
50	6,65 ± 2,4
60	11,46 ± 5,8
70	14,04 ± 7,0

Таблица 1. Повышение температуры во время регидратации приводит к увеличению размера polymersome. Средние диаметры для более чем 100 polymersomes в воде в различных условиях температуры были вычислены и изображены здесь. Ошибка стандартное отклонение.

Обсуждение

Polymersomes становятся широко изучены в качестве биологических мембран мимике. Надежные и универсальные свойства полимеров делают их широко привлекательными для исследований, требующих мембранного функционализации, долговечность и настроенную реагирования. Традиционные методы формирования гигантских размеров polymersomes ^9,10 (> 4 мкм) являются трудоемкими и требуют дорогостоящего и специализированного оборудования. Здесь мы представляем впервые, быстрый, универсальный и надежный метод для формирования polymersomes гигантских размеров, используя стандартные недорогие лабораторные реагенты и оборудование.

С помощью гель-помощь регидратации, однослойные polymersomes может быть сформирован быстро (<30 мин), в различных регидратации растворов (в том числе среды для культивирования клеток) и с множеством различных полимеров (данные не показаны). Формирование мультиламеллярными или асимметричных везикулы не наблюдалось с помощью этой методики. На протяжении всей этой работы, мы использовали поли (окиси этилена) - поли (b-бутадиена) (ПЭО-PBD, EO ₂₂ -BD ₃₇₎ нейтральный диблок - сополимер. Много различных полимерных композиций (в том числе заряженных диблоксополимеров) работают хорошо с помощью этого метода (не показан). Тем не менее, некоторые коммерчески доступные триблок-сополимеры и высшие сополимеры молекулярной массой диблок (~> 5000 дальтонов) не образуют отдельных polymersomes. Для всех экспериментов в этой рукописи, низкая концентрация меченых липидов легировался в растворах полимеров только в целях визуализации. Также могут быть использованы и другие методы визуализации, в том числе полимеры, непосредственно функционализованных флуоресцентным красителем. Polymersomes может быть также визуализируют с помощью яркой микроскопии, хотя флуоресцентной микроскопии обеспечивает более высокое разрешение.

Большинство незначительных модификаций протокола, как правило, не изменяют результаты. Например, небольшие различия в концентрации раствора полимера, высевали на покровные не изменяют образование полимера FILM формируется. В то время как полный диапазон концентраций , не была определена, образование polymersome будет успешно происходить с большим диапазоном концентраций пленки полимера (например, 1-10 мг / мл). Тем не менее, есть некоторые изменения протокола, которые негативно повлиять на формирование polymersome. Наиболее примечательным является то, что круглые покровные стекла (вместо квадрата) в результате очень низкого образования polymersomes. Мы объясняем это чрезвычайно даже пальто агарозы на стекле, который фактически препятствует образованию polymersomes.

Одним из наиболее заметных проблем этого метода является возможность восстановить polymersomes с поверхности с высоким выходом. Есть определенные случаи, в которых удаление polymersomes от исходной поверхности, может быть выгодным. Из-за высокой фоновой флуоресценции из обезвоженной полимерной пленки, удаление отдельных polymersomes и приклеивание их очистки покровные увеличит качество изображений и характеристика (Партикулярно во время анализа FRAP). Чтобы сделать это, осторожно пипеткой с наконечником пипетки, в котором конец был отрезан десорбируется с polymersomes от поверхности (хотя количество везикул извлекаемых значительно ниже, чем те, что изначально сформирован). Polymersomes затем могут быть размещены на модифицированных поверхностях покровное, позволяя polymersome взаимодействовать с новым покровным. Как правило, для нейтральных polymersomes ПЭО-PBD, покровные обрабатывают озоном в течение 15 мин позволяют polymersomes упасть на поверхность для работы с изображениями. Различные модификации поверхности требуется для различных polymersome композиций (например, отрицательно или положительно заряженные полимеры).

Большинство материалов, используемых в данном протоколе успешно хранятся и используются в течение нескольких дней до нескольких недель. Застывший агарозы может быть повторное испарение и повторно использовать до тех пор, пока агарозном начинает иметь агрегатов даже после кипячения, или затвердевший агарозы начинает сохнуть. Покровные с высушенными агарозных пленок можно хранить и использоватьd на неопределенный срок (например, месяцы). Полимер растворили в хлороформе можно хранить при -20 ° С в течение нескольких месяцев. После того, как полимерная пленка высушивается на агарозном пленках, однако, пленки необходимо хранить под вакуумом и использовать в течение двух недель (более длительный срок хранения не был непосредственно определен, но существуют заметные различия в polymersomes, образованные из полимерных пленок старше двух недель).

Использование геля при содействии протокола регидратации, представленный здесь, сотни равномерно-образных polymersomes образуются быстро с помощью всего лишь нескольких часов труда с использованием стандартного оборудования и недорогих лабораторных реагентов. Кроме того, polymersomes могут быть сформированы в различных физиологических буферных растворов и из различных полимерных композиций (не показаны). Незначительные изменения в метод не оказывали негативного изменяют образование polymersomes, оказание гелевого помощь Регидратационные универсальный и доступный метод для ученых с той или иной технической еxpertise.

Возможность легко создавать гигантские polymersomes на шкале размеров ячеек имеет важное значение для создания искусственных клеточных подобных систем. Простота использования и универсальность гелеобразной помощь регидратации, чтобы сделать эти polymersomes предлагает огромный прогресс в области биомиметического для создания надежной клеточной мембраны, мимике. Например, с помощью этой методики, стратегии для инкапсуляции различных внутриклеточных компонентов, функционализации полимера с клеточной мембраной белков и включения мембранных транспортных белков, просто назвать несколько, может быть предназначена для построения polymersome на основе искусственных клеток.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
125 ml Erlenmeyer flask	VWR	89000-360
18 guage needle	VWR	BD-305196
25 mm square coverslips	VWR	48366-089
Agarose	Sigma	A9539	A standard agarose for DNA gel electrophoresis
Chloroform	Sigma	288306-2L
Commerical coverwell	Electron Microscopy Sciences	70336	Press-to-Seal Silicone Isolators
Fiji Image Analysis Software	ImageJ		Free Download: http://fiji.sc/Fiji
Glass vial with Teflon Lid	VWR	66009-556	1.9 ml capacity, case of 144
Liss-rhodamine B PE Lipid	Avanti Polar Lipids	810150C	1 mg of lipid at 1 mg/ml concentration in chloroform
Parafilm	VWR	52858-000	10.2 cm x 38.1 m
poly(ethylene oxide)-b-poly(butadiene) or PEO-PBD (with a molecular weight of 2,940)	Polymer Source	P2904-BdEO	http://polymersource.com/dataSheet/P2904-BdEO.pdf
Pastic Petri Dish	VWR	25384-092
Teflon tape	VWR	300001-057	1/2" width