JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This video demonstrates a protocol to enrich thymic epithelial cells (TECs) with density gradient for FACS isolation. It also shows the use of EAK16-II/EAKIIH6 peptides to promote the TEC aggregate formation. The microenvironments of EAK16-II/EAKIIH6 hydrogel provide the 3-D configuration necessary to maintain the survival and function of the TECs.

Аннотация

Thymus involution, associated with aging or pathological insults, results in diminished output of mature T-cells. Restoring the function of a failing thymus is crucial to maintain effective T cell-mediated acquired immune response against invading pathogens. However, thymus regeneration and revitalization proved to be challenging, largely due to the difficulties of reproducing the unique 3D microenvironment of the thymic stroma that is critical for the survival and function of thymic epithelial cells (TECs). We developed a novel hydrogel system to promote the formation of TEC aggregates, based on the self-assembling property of the amphiphilic EAK16-II oligopeptides and its histidinylated analogue EAKIIH6. TECs were enriched from isolated thymic cells with density-gradient, sorted with fluorescence-activated cell sorting (FACS), and labeled with anti-epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) antibodies that were anchored, together with anti-His IgGs, on the protein A/G adaptor complexes. Formation of cell aggregates was promoted by incubating TECs with EAKIIH6 and EAK16-II oligopeptides, and then by increasing the ionic concentration of the medium to initiate gelation. TEC aggregates embedded in EAK hydrogel can effectively promote the development of functional T cells in vivo when transplanted into the athymic nude mice.

Введение

Тимус является первичным лимфоидной органом, ответственным за генерацию различных слоев населения патоген-реактивная, уверенных терпимы Т-клеток, имеет важное значение для функции приобретенной иммунной системы. Это динамичный орган, в котором развивающиеся тимоциты, иммигрировал из костного мозга в качестве клеток-лимфоцитов-предшественников, мигрируют через губчатую трехмерные (3-D) матрицы тимуса стромы, подвергаются LINEAGE-спецификации и дифференциации, и в конечном счете эмигрировать в зрелых Т-клеток. Успех этого хорошо запрограммированный процесс во многом зависит от перекрестных помех между мигрирующими тимоцитов и жилых тимуса эпителиальных клеток (ТИК), преобладающей популяции вилочковой стромы, которые имеют важное значение для установления и поддержания целостности вилочковой микросреды.

На основе их анатомического расположения и уникальной функции, ТЭМ можно разделить на два подмножества: ТИКи в коре (cTECs), которые являются responность за выбор собственного MHC (главный комплекс гистосовместимости) ограничено Т-клетки (положительный выбор), а ТИК в мозговом веществе (mTECs), которые необходимы для устранения аутореактивных Т-клеток (негативный отбор) 1,2. Многие факторы (например, старение, инфекции, облучение, лекарственное лечение) может вызвать необратимые повреждения тимуса эпителия, что приводит к скомпрометированных адаптивного иммунитета. Несмотря на многочисленные попытки, восстановление функции тимуса была сложной задачей из-за трудностей, чтобы воспроизвести тимуса микросреду. Следует отметить, что вилочковой трехмерные (3-D) , конфигурация имеет решающее значение для выживания и функции ТЭМ, тогда как ТЭМ культивируют в среде 2-D быстро уменьшают экспрессию генов , критических для тимопоэз 3,4.

EAK16-II (AEAEKAKAEAEAKAK) и С-концевой histidinylated аналог EAKIIH6 (AEAEKAKAEAEAKAKHHHHHH) имеют низкий молекулярный вес, амфифильные олигопептиды, которые растворяются в деионизованной водоснаг, но подвергаются гелеобразование с образованием бета-фибриллы при воздействии ионной силы выше, чем 20 мМ NaCl (нормальной концентрации соли в жидкости тела человека составляет 154 мм). Это свойство отзывчивым окружающей среды делает их универсальными строительными блоками для формирования 3D-структур. His-метки на EAKII-H6 обеспечивает стыковочный механизм, с помощью которого противопехотные Его IgGs / Fc-связывающий рекомбинантный белок A / G (αH6: пА / G) комплексы могут служить в качестве адаптера для закрепления белковых лекарственных средств и других биомолекул ( например, антитела) на гидрогеля композита 5-8.

Ранее мы показали , что флуоресцентные меченных молекул IgG , базирующуюся на гидрогеля может удерживаться в месте инъекции в течение до 13 дней 9. Кроме того, когда αH6: пА / G адаптеры с прикрепленные анти-CD4 IgG , были добавлены к EAK16 II / EAKIIH6 (ЕАК) гидрогеля, CD4 + Т - клетки были специально захваченный 10. Используя подобную технику, мы недавно показали, что 3-D агрегация TECS Cульд быть повышен в ЕАК гидрогеля с адаптером комплексов, несущих ПЭС-специфических анти-EpCAM антител (αH6: Pa / G: αEpCAM). Когда пересаживают под почки капсулы голых мышей, КТР кластеры , встроенные в ЕАК гидрогеля может эффективно поддерживать развитие функциональных Т - клеток в естественных условиях 11,12.

Здесь мы проиллюстрируем наш метод, чтобы быстро и эффективно очищают ТИК с сортировкой флуоресцентно активированных клеток (FACS) и генерировать 3-D TEC агрегаты с системой EAK гидрогеля.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все животные, используемые в экспериментах, были размещены в виварии в научно-исследовательском институте Allegheny-Зингера в соответствии с протоколом были рассмотрены и одобрены Institutional животных по уходу и использованию комитета / Allegheny научно-исследовательского института Allegheny Network Health певцу.

1. Переваривание тимусе коллагеназой

  1. Урожай вилочковой железы.
    1. Эвтаназии 3-5-недельных мышей C57BL6 / J в двуокиси углерода (СО 2) камеры для сбора вилочковой железы. Более подробно, поместить мышей в камере под СО 2 индукции в течение 3-5 мин и подтвердить смерть путем проверки сердца или дыхания.
    2. Положите тушу на спине и намочить тело с 70% -ным этанолом. Сделайте небольшой горизонтальный разрез с острыми, прямыми Препарационные ножницами на его животе через кожу. Потяните кожу на обоих концах (головы и ног), так что она вывернута наизнанку.
    3. Сделайте горизонтальный разрез с рассекает ножницами только подсамое низкое ребро и разрезают через диафрагму в сторону. Держа мечевидного отростка с пинцетом и вырезать середину ребер, идущих с обеих сторон. Подтяните ребра / грудину так, что тимус четко виден.
      Примечание: Тимус расположен непосредственно на вершине сердца, состоит из 2-х лепестков и белого полупрозрачного цвета.
    4. С помощью изогнутых щипцов, осторожно выкопать и вытащить тимуса лепестка от соединительной ткани и передачи в моющем растворе (см перечень материалов).
  2. Готовят пищеварение раствора путем смешивания 9 мл среды RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute среднего 1640), 0,025 мг / мл очищенного коллагеназа, 10 мМ HEPES [4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота], и 0,2 мг / мл ДНКазы I в центрифужную пробирку на 50 мл. Хранить раствор Пищеварение в 37 ° С на водяной бане до использования.
    Примечание: Количество варочным раствором, приготовленным достаточно для пяти взрослых thymi мыши, который можно инкубировать в одном 5 мл полистирола круглодоннуюнижняя труба.
  3. Передача тимус до 60 мм ткани блюдо культуры, содержащей 5-6 мл RPMI-1640.
  4. Рассеките тимус с 28 G иглой шприца инсулина на мелкие кусочки (около 1 мм 3 кв) , чтобы позволить лимфоциты вытечь.
  5. Промыть вилочковой части с RPMI-1640, который находится в чашке Петри со стеклянной пипетки Пастера. Наклоните блюдо и пусть тимуса фрагменты оседают на дно. Медленно аспирация и отбросить RPMI-1640 супернатанта с помощью стеклянной пипетки. Повторите этот шаг, промывая 5-6 мл среды RPMI-1640, в 4-5 раз со стеклянной пипеткой до тех пор, пока раствор не станет менее прозрачным.
    Примечание: Стеклянные пипетки рекомендуется на этом этапе, так как фрагменты тимуса имеют тенденцию придерживаться пластика, что приводит к чрезмерной потере тканей тимуса. Для остальной части процедуры, использование пластиковых пипеток.
  6. После окончательной промывки, отбросить супернатант, как описано на стадии 1.5. Добавить раствор 3 мл переваривания и переносят кусочки тимуса и раствора в 5 мл с круглым дном рolystyrene трубки.
  7. Поместите пробирку на ротатор трубки и инкубировать при 37 ° С в течение 6 мин при скорости вращения 12 оборотов в минуту.
  8. После инкубации, пусть вилочковой фрагменты оседают на дно трубки под действием силы тяжести. Собирают супернатант с пипеткой Пастера и переносят в 50 мл центрифужную пробирку с 10 мл промывочного раствора. Центрифуга при 300 мкг в течение 5 мин, отбросить супернатант и клетки вновь суспендируют в растворе 10 мл промывки. Держите на льду.
  9. Повторите шаги 1.6-1.8 дважды на тимуса фрагментов в 5 мл с круглым дном полистирола трубки. Бассейн супернатант в том же 50 мл трубки.
    Примечание: Центрифугирование не является необходимым для второй и третьей промывки.
  10. После окончательного переваривания, пипеткой вверх и вниз с 2 мл пластиковой серологической пипетки, чтобы сломать оставшиеся фрагменты в трубке и передачи в центрифужную пробирку на 50 мл.
  11. Центрифуга 50 мл трубки при 300 мкг в течение 5 мин, аспирата супернатант, ресуспендируют в 10 мл промывочного Buffeг и фильтр через мкм клеточный фильтр 100. Держите на льду.

2. Обогащение ТЭМ с разрывным градиентом плотности

  1. Готовят 21% раствор градиента плотности путем смешивания 2,4 мл в градиенте плотности среды (60% вес / об иодиксанола в воде) и 9,6 мл промывочного раствора.
  2. Центрифуга диссоциированных клеток тимуса в трубке 50 мл сбора с шагом 1.11 при 300 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в 2,5 мл буфера для промывки.
  3. Добавьте 20 мл среды RPMI-1640 к клеточной суспензии.
  4. Заполните 12 мл 21% -ного раствора градиента плотности в 10 мл серологической пипеткой с электронным дозаторов. Поместите кончик серологической пипеткой в ​​нижней части 50-мл центрифужные пробирки, содержащие клетки, и чтобы раствор градиента плотности стечь на дно трубки под действием силы тяжести.
    1. Аккуратно выталкивать раствор градиента плотности с пипеткой, чтобы закончить генерации двух слоев различной плотности.
  5. Центрифуга при 600 мкг Foг 20 мин при комнатной температуре в качающийся-роторе. Установите скорость торможения на уровне самого медленного.
  6. Перенести верхний слой и интерфейс к новой 50 мл пробирку.
    Примечание: Большинство ТЭМ сохраняются в интерфейсе. Лимфоциты будет выпадать в осадок на дно пробирки после центрифугирования. Если эти клетки должны быть использованы для других целей, промыть осадок с помощью 20 мл промывочного раствора в течение трех раз. Ресуспендируют клеток в 10 мл буфера для промывки.
  7. Добавьте промывочный раствор до 40 мл в пробирку на шаге 2.6 и центрифуге при 400 мкг в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Для того, чтобы удалить супернатант, аспирация с пипеткой.
  8. Повторите промывание и аспирация еще 2 раза, как описано в шаге 2.7.
  9. Ресуспендируют в 2 мл промывочного раствора и подсчета клеток с помощью гемоцитометра.

3. Разделительные ТЭМ с FACS

  1. Отрегулировать клетки от шага 2,9 при концентрации 1х10 6 клеток / 100 мкл промывочного раствора и передачиклетки в 5 мл с круглым дном трубы (полипропилен или полистирол, в соответствии с рекомендациями инструкции сортировщика потока).
  2. Добавьте 2 мкл анти-Fc IgG рецептора на 1х10 6 клеток и инкубируют при 4 ° С в течение 10 мин.
  3. Добавить анти-CD45 (1: 150 разбавление, 10 мкл на образце) и анти-EpCAM (разведение 1: 100, 10 мкл на образце) антител и инкубируют при 4 ° С в течение более 20 мин.
  4. Промывают клетки с промывочного раствора 2 мл и центрифугируют при 400 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Аспирируйте супернатант с пипеткой.
  5. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
  6. Фильтруют через сито 100 мкм.
  7. Применение клеток в сортировочный инструмента. Выберите лимфоцит и TEC население за исключением самых маленьких клеток на стороне рассеянного света (SSC) / вперед рассеянного света (FSC) панели (мертвые клетки), а затем ворота на выбранной популяции для CD45- EpCAM + для сортировки 13.

4. Generation ТЭМ / EAK Совокупностей

Примечание: Выполните приготовления реагентов и действия, связанные с смесительной камере под ламинарным укрытием.

  1. Готовят пА / G адаптер комплексов путем смешивания 4 мкл анти-His-меткой IgG, 8 мкл анти-EpCAM IgG и 2,6 мкл пА / G в стерильном 1,5 мл микроцентрифужных трубки, и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин.
  2. Отрегулировать отсортированные ТИК с шага 3,7 до 5x10 4 клеток / мл с промывочным раствором, и пипетку 100 мкл в одну лунку низкой испарительной 96-луночного круглым дном планшета для культуры ткани. Добавить 14,6 мкл адаптера комплексов пА / G к клеткам. Поместите пластину на качающейся платформе в течение 20 мин при температуре 4 ° С.
  3. Промывают один раз 200 мкл промывочного раствора. Центрифуга пластины при 400 х г в течение 6 мин. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
  4. Промывают один раз 200 мкл 10% раствора сахарозы. Центрифуга при 400 мкг в течение 6 мин. Удалите супернатант с помощью микропипетки.
  5. Ресуспендируют клеток в 30 мкл 10% сterile раствор сахарозы на лунку.
  6. Добавьте 10 мкл EAKIIH6 (7,5 мг / мл) и инкубируют в течение 5 мин при комнатной температуре.
  7. Добавьте 20 мкл EAK16-II (10 мг / мл) к смеси TEC.
  8. Добавьте 100 мкл полной среды в системе, чтобы инициировать гелеобразование. Поместите пластину на платформе шейкере в течение 15-20 мин при комнатной температуре.
  9. Поместите пластину в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Через 2-4 часа, добавить еще 100 мкл полной среды.
  10. Измените среда каждый день до использования.
    1. Отберите 100 мкл среды с поверхности без нарушения гель с использованием микропипетки и осторожно добавляют 100 мкл подогретого среды, помещая кончик пипетки к стенке скважины.

5. Характеристика ТИК / EAK Совокупностей

  1. Чтобы проверить функцию TEC / EAK агрегатов в естественных условиях, собрать TEC / EAK гидрогель после O / N культуры и пересадки под почечную капсулу бестимусных обнаженноймыши, используя ранее описанную процедуру 11,14.
  2. Контроль за развитие Т-клеток на периферии путем сбора 50-100 мкл пробы крови в ЭДТА-содержащие пробирки для сбора крови из голых мышей через 4-6 недель после трансплантации и пятна с коктейлем анти-CD4, -CD8, -CD45 и -CD3 антитела 12.
  3. Проанализировать процент Т-лимфоцитов в периферической крови лейкоцитов с проточной цитометрии (FCM), с помощью программного обеспечения для анализа одноклеточ- 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Для изучения эффективности использования протокола градиента плотности разделения для обогащения стромальных клеток CD45-, клетки, полученные как из интерфейса и осажденных лимфоцитах гранул окрашивали анти-CD45 и анти-EpCAM антител. Оба анти-Улекс Europaeus Agglutinin 1 (UEA1) и антит...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В то время как ТЭМ являются преобладающими популяция вилочковой стромы и играют существенную роль для структуры и функции тимуса желез, они составляют лишь около 0,1-0,5% от общего тимуса клеточности. Они также являются хрупкими клетки , как высокий процент гибели клеток изредка наблюдаю?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Authors declare no conflict of interest.

Благодарности

Эта работа была частично поддержана Национальным институтом здравоохранения грантов R21 AI113000 (WSM) и R01 AI123392 (YF).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
TEC Isolation
70% EthanolDecon Laboratories2701(1 Gallon)Ethanol 200 Proof, deionized water
Dissecting scissors, straightFine Science Tools, Inc.91460-11
Graefe forceps, straightFine Science Tools, Inc.11053-10
Graefe forceps, curvedFine Science Tools, Inc.11052-10
Washing solution1x PBS, 0.1% BSA, 2 mM EDTA
1x PBS (Phosphate buffered saline)Gibco10010-023
BSA (Bovine serum albumin)SigmaA1470-100G
EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Invitrogen15575-038
Digestion solution9 ml RPMI-1640, 0.025 mg/ml Liberase TM Research grade, 10 mM HEPES, 0.2 mg/ml DNaseI
RPMI-1640Gibco11879-020
Liberase TM Research GradeRoche05 401 127 001referred as "purified collagenase"
1 M HEPESLonza17-737E
Dnase IRoche10 104 159 001
50 ml Centrifuge tubeCorning430290
60 mm tissue culture dishFalcon353002
1/2 cc U-100 Insulin syringe 28 1/2 GBecton Dickinson329461
5 ml Polystyrene round-bottom tubeFalcon352058
5 ml glass pipetFisher Healthcare13-678-27EUse for rinsing the thymic fragments. Thymic fragments tend to stick to the wall with plastic pipets.
MACSmix tube rotatorMiltenyi130-090-753
100 µm Cell strainerFalcon352360
Density gradient medium: OptiPrepAxis-Shield
Cell Sorting
5 ml Polypropylene round-bottom tubeFalcon352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)BD Biosciences553142Use as undiluted, 2 µl per sample
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5eBioscience45-0451-80Use at 1:150, 10 µl per sample
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PEeBioscience12-5791-82Use at 1:100, 10 µl per sample
BD InfluxBD Biosciences
Single cell analysis softwareFlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-TagAnaSpec29673"anti-His-Tag IgG"
Purified anti-mouse CD326 (EpCAM)BioLegend118202"anti-EpCAM IgG"
Recombinant protein A/GPierce Biotechnology
1.5 ml Safe-Lock Tubes, Biopur, SterileFisher Healthcare05-402-24Breferred as "1.5 ml microcentrifuge tube"
96-well, Tissue culture plate, Round-bottom with low evaporation lidBD Falcon353917
Rocking platform: Nutator Mixer no.1105BD Clay Adams
10% sucroseSigmaS0389Prepare with sterile distilled water
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)American Peptide Company custom synthesized, 10 mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)American Peptide Company custom synthesized, 7.5 mg/ml
Complete mediumRPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamine, 1% NEAA, 5 mM HEPES, 50 µM 2-Mercaptoethanol
RPMI-1640Gibco11879-020
FBS (Fetal Bovine Serum)Atlanta BiologicalsS11150Heat inactivated before use
Pen/StrepGibco15140-122
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081
NEAA (non-essential amino acid) 100xGibco11140-050
1 M HEPESBioWhittaker17-737E
2-Mercaptoethanol (100x)MilliporeES-007-E
Platform shaker: The Belly DancerStovall Life Sciences Inc.model: USBDbo

Ссылки

  1. Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. Nature. 362, 70-73 (1993).
  2. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  3. Mohtashami, M., Zuniga-Pflucker, J. C. Three-dimensional architecture of the thymus is required to maintain delta-like expression necessary for inducing T cell development. J Immunol. 176, 730-734 (2006).
  4. Pinto, S., et al. An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression. J Immunol. 190, 1085-1093 (2013).
  5. Fung, S. Y., Yang, H., Chen, P. Formation of colloidal suspension of hydrophobic compounds with an amphiphilic self-assembling peptide. Colloids Surf B Biointerfaces. 55, 200-211 (2007).
  6. Jun, S., et al. Self-assembly of the ionic peptide EAK16: the effect of charge distributions on self-assembly. Biophys J. 87, 1249-1259 (2004).
  7. Saunders, M. J., et al. Engineering fluorogen activating proteins into self-assembling materials. Bioconjug Chem. 24, 803-810 (2013).
  8. Zhang, S., Holmes, T., Lockshin, C., Rich, A. Spontaneous assembly of a self-complementary oligopeptide to form a stable macroscopic membrane. Proc of the Natl Acad Sci U S A. 90, 3334-3338 (1993).
  9. Wen, Y., et al. Coassembly of amphiphilic peptide EAK16-II with histidinylated analogues and implications for functionalization of beta-sheet fibrils in vivo. Biomaterials. 35, 5196-5205 (2014).
  10. Zheng, Y., et al. A peptide-based material platform for displaying antibodies to engage T cells. Biomaterials. 32, 249-257 (2011).
  11. Tajima, A., et al. Bioengineering mini functional thymic units with EAK16-II/EAKIIH6 self-assembling hydrogel. Clin Immunol. 160, 82-89 (2015).
  12. Fan, Y., et al. Bioengineering Thymus Organoids to Restore Thymic Function and Induce Donor-Specific Immune Tolerance to Allografts. Mol Ther. 23, 1262-1277 (2015).
  13. Fan, Y., et al. Thymus-specific deletion of insulin induces autoimmune diabetes. The EMBO J. 28, 2812-2824 (2009).
  14. Fan, Y., et al. Compromised central tolerance of ICA69 induces multiple organ autoimmunity. J Autoimmun. 53, 10-25 (2014).
  15. Palumbo, M. O., Levi, D., Chentoufi, A. A., Polychronakos, C. Isolation and characterization of proinsulin-producing medullary thymic epithelial cell clones. Diabetes. 55, 2595-2601 (2006).
  16. Williams, K. M., et al. Single cell analysis of complex thymus stromal cell populations: rapid thymic epithelia preparation characterizes radiation injury. Clin Transl Sci. 2, 279-285 (2009).
  17. McLelland, B. T., Gravano, D., Castillo, J., Montoy, S., Manilay, J. O. Enhanced isolation of adult thymic epithelial cell subsets for multiparameter flow cytometry and gene expression analysis. J Immunol Methods. 367, 85-94 (2011).
  18. Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium. J Immunol methods. 385, 23-34 (2012).
  19. Xing, Y., Hogquist, K. A. Isolation, identification, and purification of murine thymic epithelial cells. J Vis Exp. , e51780(2014).
  20. Graham, J. M. Separation of monocytes from whole human blood. ScientificWorldJournal. 2, 1540-1543 (2002).
  21. Li, X., Donowitz, M. Fractionation of subcellular membrane vesicles of epithelial and nonepithelial cells by OptiPrep density gradient ultracentrifugation. Methods Mol Biol. 440, 97-110 (2008).
  22. Mita, A., et al. Purification method using iodixanol (OptiPrep)-based density gradient significantly reduces cytokine chemokine production from human islet preparations, leading to prolonged beta-cell survival during pretransplantation culture. Transplant Proc. 41, 314-315 (2009).
  23. Anderson, G., Takahama, Y. Thymic epithelial cells: working class heroes for T cell development and repertoire selection. Trends Immunol. 33, 256-263 (2012).
  24. Kyewski, B., Klein, L. A central role for central tolerance. Annu Rev Immunol. 24, 571-606 (2006).
  25. St-Pierre, C., et al. Transcriptome sequencing of neonatal thymic epithelial cells. Sci Rep. 3, 1860(2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Immunology112EAK16

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены