JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

Аннотация

Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоциты в обращении крови человека и быстро завербован в местах воспаления. Грунтовка является важным событием, которое усиливает фагоцитарную функциональность нейтрофилов. Несмотря на обширные исследования обнародовали существование и важность нейтрофильного затравки во время инфекции и травмы, средства визуализации этого процесса в естественных условиях были недоступны. Протокол при условии , позволяет осуществлять мониторинг динамического процесса нейтрофильных грунтовкой в живых животных путем объединения трех методик: 1) DsRed репортер сигнал - используется в качестве меры затравочных 2) в естественных условиях маркировки нейтрофильной - достигается путем введения флуоресцентной конъюгированных с анти-лимфоцитарный антиген 6G (Ly6G) моноклональное антитело (МАБ) и 3) прижизненной конфокальной микроскопии. Несколько важных шагов участвуют в этом протоколе: оксазолона-индуцированное воспаление уха мыши кожи, соответствующий седации животных, повторные инъекции анти-Ly6G биосфера, и предention фокуса дрейфа во время съемки. Хотя некоторые ограничения наблюдались, такие как предел непрерывного времени изображений (~ 8 часов) в одной мыши и утечки флуоресцеина изотиоцианат-декстрана из кровеносных сосудов в воспалительный состоянии, этот протокол обеспечивает фундаментальную основу для прижизненной визуализации загрунтованную поведение нейтрофилами и функция, которая может быть легко расширена для изучения других иммунных клеток в моделях воспаления мыши.

Введение

Нейтрофилы являются наиболее распространенными и короткоживущие лейкоциты в обращении. Они быстро набраны к местам инфекции или травмы, где они служат профессиональные фагоциты через высвобождением активного кислорода и азота промежуточных продуктов наряду с гранулами , содержащими антимикробные пептиды и протеазы 1. Во время их набора, нейтрофилы "грунтовкой" различными агентами , включая микробные продукты, хемоаттрактанты и воспалительных цитокинов, в результате чего заметно расширенные функциональные возможности фагоцитарного по прибытии в месте воспаления 2. Механизмы нейтрофильных затравки были широко изучены в пробирке 3,4; Тем не менее, динамический контроль процесса в естественных условиях не представлялось возможным на сегодняшний день.

В последнее время прижизненной визуализации стало важным методом для визуализации и количественной оценки клеточных динамики биологических процессов в живых организмах. Intraviвизуализация Таль может быть осуществлено с помощью обычного однофотонного микроскопии возбуждения (например, конфокальной) или многофотонной микроскопии приближается к 5. Со временем, значительные улучшения были достигнуты в этой технике позволяет увеличить разрешение изображения, улучшенную глубину изображения, снижение фотоповреждения ткани и повышенной стабилизации изображения 6,7. Учитывая свою уникальную возможность включения динамической визуализации клеточной миграции и взаимодействия с течением времени, прижизненной микроскопии широко применяется в различных областях исследования в области иммунологии 8. Прижизненные изображения позволяет иммунологи, чтобы лучше понять и контекстуализировать иммунные реакции на обоих клеточном и молекулярном уровне в живых животных моделей.

Последние достижения в области трансгенной, а также забивные репортер мышей предоставили полезные инструменты для мониторинга динамического поведения нейтрофилов у живых животных. Лизоцим M промотор-приводом усиленный зеленый флуоресцентный белок забивныеМыши были широко используются для характеристики моторики нейтрофилов, моноцитов и макрофагов во время различных воспалительных процессов , в том числе экстравазации, бактериальной инфекции, и стерильного воспаления 9-15. Кроме того, трансгенные мыши , экспрессирующие цитоплазматический флуоресцентного резонансного переноса энергии биосенсора были использованы при изучении деятельности нейтрофилов внеклеточной регулируемой киназы митоген и протеинкиназы А в воспаленном кишечнике 16. Мышиной модели с высокой степенью специфичности экспрессии флуоресценции в нейтрофилах является Catchup стук в мышь, которая производит Cre рекомбиназу, а также флуоресцентного белка tdTomato, который сам по себе связан с экспрессией лимфоцитарных антиген 6G (Ly6G) 17. Визуализация Ly6G-дефицитных нейтрофилов через эту модель показала , что эти клетки оказывают нормальные функциональные возможности в различных стерильных или инфекционных в естественных условиях воспалительных контекстах. Трансгенные мыши, экспрессирующие DsRed флуоресцентный рrotein ген под контролем мыши interleuikin-1 & beta; (ИЛ-1β) промотор (pIL1-DsRed) были использованы для визуализации подвижных поведения IL-1 & beta; продуцирующих клеток - как полагают, включают нейтрофилы, воспалительных моноциты и активированные макрофаги - возникающие в воспаленной кожи 18.

В естественных условиях маркировки может служить в качестве альтернативного подхода для отслеживания клеточных и молекулярных поведения нейтрофилов в воспаленных тканях. После внутривенного введения низких доз флуоресцентно меченных анти-Gr-1 моноклональное антитело (МАБ), набор каскад Gr-1 + нейтрофилов было визуализируется при поражении кожи мышей , зараженных золотистым стафилококком 19. В естественных условиях введение конъюгатов , содержащих стрептавидином конъюгированные 705 нм квантовые точки и биотинилированный анти-Ly6G монАТ специфически маркировать циркулирующие нейтрофилы 20. Кроме того, эндоцитоз таких конъюгатов в neutrophIL везикулы позволяет отслеживать высокоскоростного везикул транспорта в нейтрофилах мигрирующие в интерстиций. В естественных условиях маркировки с флуоресценцией , конъюгированных с антителами против Р-селектина гликопротеинов лиганд-1 (PSGL-1), L-селектина (CD62L), интегрин аш (CD11b ) и хемокина (СХС мотив) рецептора 2 (CXCR2) в ФНО-индуцированной воспалительной модель выяснен регуляторные механизмы при игре на ранних стадиях воспаления 21. Поляризованные нейтрофилы выступают PSGL-1, обогащенный Уроподы взаимодействовать с CD62L на активированных тромбоцитах, что приводит к перераспределению CD11b и CXCR2, рецепторы, которые управляют миграцию нейтрофилов и инициируют воспаление.

ИЛ-1β является одним из генов подписи , что повышается в загрунтованных нейтрофилы 22. У мышей репортер pIL1-DsRed, DsRed сигналы флуоресценции (то есть., Активация IL-1 промотор) положительно коррелирует с IL-1β экспрессию мРНК и IL-1β продуцирования белка. 18 Для того, чтобы следить за процессом нейтрофильной затравки, была разработана прижизненный метод микроскопии с участием индукции воспаления кожи с оксазолона (ОХ) в мышиной модели pIL1-DsRed следующую маркировку в естественных условиях нейтрофилов с флуоресцентно-конъюгированным анти-Ly6G мАт. С помощью этой модели, можно изучить поведение и функцию загрунтованных нейтрофилами в животных моделях различных заболеваний и расстройств.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных проводятся в соответствии с национальными институтами здоровья руководящих принципов и одобрен Institutional Animal Care и использование комитета Университета Толедо мимо.

1. Фенотипирование pIL1-DsRed мышей

Примечание: Потомство генерируются путем селекции гетерозиготных мышей pIL1-DsRed дикого типа мышей (WT) C57BL6. От трех до четырех недель старые щенки считаются готовы к фенотипирования. Подчелюстные кровотечения мышей следует установленным протоколом с незначительными изменениями 23.

  1. Выделение Лейкоциты из цельной крови мыши Pups
    1. Добавьте 20 мкл гепарина в каждую 1,5 мл микроцентрифужных трубки.
    2. Приобретите один щенок из клетки. Запишите идентификационный тег щенком. Не требуется, чтобы обезболить щенков до забора крови из подчелюстной вены.
    3. Держите щенка на шею шкирку и прокалывают подчелюстной вену йе щека сумка с помощью 5 мм ланцет. Применить адекватные силы, чтобы создать небольшой прокол, так что капли крови выделяют с точки проникновения. Используйте новую иглу для каждого щенка.
    4. Соберите 3 - 5 капель крови на детеныша в гепарин-содержащих микроцентрифужных трубки. Очистите место прокола и оказать давление, чтобы облегчить гемостаза.
    5. Поместите щенка в новой клетке и наблюдать в течение 30 минут, прежде чем вернуться в клетку к вивария.
    6. Сбор крови у взрослых мышей известного фенотипа, как положительных, так и отрицательных контролей.
    7. Добавить 500 мкл буфера для растворения красных клеток крови в каждую пробирку, вихревые трубки и инкубировать в течение 5 - 10 мин на льду.
    8. Медленно добавляют 400 - 500 мкл фетальной бычьей сыворотки (FBS) под Суспензии клеток в каждой пробирке. Четкий интерфейс можно наблюдать между суспензией клеток верхнего слоя и нижнего слоя FBS.
    9. Cap трубы и образцы центрифуге при 1500 × г в течение 5 мин.
    10. Повторите шаги 1.1.7 - 1.1.9 мехаTher удаление эффекта красных кровяных телец. Не повторяется, если лизис достаточно в первый раз. Осадок должен быть трудно различить после центрифугирования.
  2. Липополисахарида (LPS) Стимулирование и культура
    1. Ресуспендируют клеток в 200 мкл института Roswell Park полный Memorial (RPMI) 1640.
    2. Передачи клеточной суспензии в проточной цитометрии трубки.
    3. Сделать LPS рабочий раствор путем смешивания 10 мкл исходного раствора LPS (1 мг / мл) с 990 мкл полной среды RPMI 1640 среды.
    4. Добавьте 20 мкл 10 мкг LPS / мл рабочего раствора до 200 мкл клеточной суспензии.
    5. Cap трубы свободно и инкубировать образцов в течение 4 ч при температуре 37 ° С с 5% CO 2.
  3. Анализ проточной цитометрией
    1. Откройте программу сбора данных для проточной цитометрии. Настройка шаблона приобретения до начала выборки приобретения.
    2. Выберите инструмент Dot-земля в палитре инструментов. Нарисуйте FOrward разброс (FSC) против бокового рассеяния (SSC) сюжет. Установите параметры напряжения FSC и SSC в линейном масштабе.
    3. Выберите самые низкие пороги FSC и SSC разрешенные цитометра. Применить пороговые значения 200 и 50 для FSC и SSC, соответственно.
    4. В ФСБ против SSC участка, нарисуйте ворота G1, который включает в себя моноциты, гранулоциты и дендритные клетки, и не включает мусора, эритроциты и лимфоциты.
    5. Выберите инструмент Гистограмма в палитре инструментов. Нарисуйте FL2 (красная флуоресценция канал) гистограмма. Используйте отрицательный контрольный образец, чтобы установить базовую линию сигналов FL2 и положительный контрольный образец, чтобы сделать ворота, чтобы включить все Dsred позитивные события.
    6. На панели управления Флюидика из цитометра, установите режим жидкости в положение "RUN" и скорость потока "HI" (приблизительно 60 мкл / мин). Acquire 10000 событий для каждого образца.
    7. Определение фенотипа путем тюлененок измерением процента DsRed положительных клеток от G1 затвора.
2. Индукция Воспаление кожи в pIL1-DsRed мышей

  1. Обезболить мышь внутрибрюшинной (IP) инъекции анестезирующего коктейля, содержащего 100 мг / кг кетамина, 10 мг / кг ксилазина и 1 мг / кг Ацепромазин. Адекватно наркотизированных мышей не показывают заднюю лапу вывод до ног крайнем случае.
  2. Нанесите крем удаления волос на дорсальной поверхности обоих ушей мыши. Подождите 30 сек до 1 мин. Протрите поверхность уха с водой смачивают хлопка и позволяют высохнуть на воздухе.
  3. Измерьте толщину уха с помощью микрометра и заменить мышь в отдельной клетке. Наблюдайте до выхода из наркоза (~ 15 - 30 мин). Чтобы устранить воспаление кожи, вызванное продуктом удаления волос, позволяют мышь отдыхать в течение 3-х дней перед дальнейшей экспериментирования осуществляется.
  4. Готовят 1,25% (вес / об) OX растворением 16.7 мг ОХ в 1 мл ацетона и перемешивание 750 мкл раствора / ацетона ОХ 250 мкл оливкового масла. Приготовьте раствор транспортного средства путем смешивания 750 мкл ацетона с 250 &# 181; л оливкового масла.
  5. Re-обезболить мышь с помощью внутрибрюшинной инъекции анестетика коктейля (2.1). Измерьте толщину уха, как и раньше.
  6. Нанести 12,5 мкл 1,25% ОХ на каждую сторону правого уха. Нанести 12,5 мкл ацетона / оливкового масла раствор транспортного средства на каждую сторону левого уха.
  7. Держите мышь отдельно от клетки товарищей, пока полностью не выздоровел, чтобы предотвратить оскорбление его ушей другими мышей, а затем заменить мышь в своей первоначальной клетке и вернуться на жилище животных объекта.
    Примечание: Удаление волос может привести к незначительным воспалением кожи последующим изменением толщины уха. Это незначительное воспаление будет решена через 3 дня подтверждается нормальной толщины уха. После местного применения в течение 24 ч, OX обработанных ушей показывают значимое (р <0,01) набухания по сравнению раствора носителя в одиночку обработанных ушей.

3. Маркировку нейтрофилы в pIL1-DsRed мышей

Примечание: В естественных условиях маркировки нейтрофилов низкой дозы Fluorescence-конъюгирован нейтрофилы конкретных мАт следует недавно разработанного протокола 19. Ретро-орбитальные инъекции выполняются в соответствии с установленным протоколом с некоторыми изменениями 24.

  1. Подготовка анти-Ly6G рабочего раствора MAB разбавлением 10 мкл 0,5 мг / мл Alexa Fluor 647-конъюгированные анти-Ly6G мАт (клон 1A8) в 90 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Перенести 100 мкл рабочего раствора анти-Ly6G монАТ (50 мкг / мл) в инсулиновый шприц U-100 с 28 иглы калибра.
  3. Обезболить взрослого pIL1-DsRed мышь путем внутрибрюшинной инъекции ранее описанного анестезирующего коктейля (2.1). Поместите наркозом живот мыши вниз на чистую рабочую доску.
  4. Слегка понижательное давление на кожу спины и брюшного один глаз мыши, чтобы частично выступать глазного яблока из розетки.
  5. Аккуратно положите иглу, скос вниз, под углом примерно 30 ° в медиальной кантуса в ретро-орбитальноепазухи.
    Примечание: Оператор может чувствовать давление, проникновение и освобождаемый сопротивление только игла вставляет в пазухи.
  6. Медленно и плавно вводят 100 мкл анти-Ly6G мАт рабочего раствора (5 мкг мАт / мышь / инъекция) в мышь. Удалите иглу быстро. Небольшое количество кровотечения предполагает успешную инъекцию.
  7. Сразу применять 1,25% OX и решение транспортного средства на правую и левую уши мыши.
  8. Через 8 ч, введение 100 мкл свежеприготовленного анти-Ly6G рабочего раствора мАт (5 мкг мАт / мышь / инъекцию) через ретро-орбитальное инъекции в той же мыши.
  9. Чтобы визуализировать кровеносные сосуды, непосредственно перед визуализации, управлять 100 мкл 30 мг / мл флуоресцеинизотиоцианата (FITC) -conjugated декстрана (150 кДа) через ретро-орбитальное инъекции.

4. прижизненной визуализации Грунтовка в нейтрофилов PIL-1-DsRed мышей

  1. Обезболить мышь с внутрибрюшинной инъекции анестетика коктейля (2.1).0; Нанесите мазь ветеринарная глаза мыши, чтобы предотвратить сухость под наркозом для работы с изображениями.
    1. Готовят 1 мл половинной дозы анестетика коктейль, разбавляя 500 мкл первоначальной анестезирующего коктейля с равным объемом PBS.
    2. Перенести половину дозы анестетика коктейль 1 мл шприц с иглой бабочки 27.
    3. Вставьте иглу бабочки в животе мыши внутрибрюшинно и зафиксировать крыло бабочки в животе пластырем.
  2. Поместите покровное стекло в центре сцены визуализации. Лента края покровного стекла, чтобы удерживать его на месте.
  3. Поместите каплю PBS на вентральной поверхности уха мыши, а также на покровное.
  4. Позиция наркозом мышь с ухом над покровным. Установите кончик уха, спинной стороной вниз, на прослаивая ухо между покровное и предметное стекло, также удерживается на месте с помощью ленты.
  5. Включите мульти-лазерной флуоресценции конфокальной микроскопии и всех связанных с этим еquipment. Выключите комнате свет, чтобы свести к минимуму воздействие окружающего света.
  6. Открытое программное обеспечение захвата изображений. Выберите лазерные каналы для обнаружения люминесцентных красителей в меню Dye List.
  7. Отрегулируйте фокус на воспаленной кожи уха путем наблюдения зеленых сигналов от кровеносных сосудов и красные сигналы от DsRed + клеток через окуляр.
  8. Выполните быстрое сканирование со скоростью сканирования 2 мкс / пиксель и разрешением 512 × 512 пикселей. Выберите псевдоцвете для каждого канала в прямом меню View. Отрегулируйте ручку фокусировки, чтобы установить конец и начать расположение сканирования.
  9. Выполните медленные сканирования со скоростью сканирования 4 - 8 мкс / пиксель и разрешением 800 × 800 или 1024 × 1024 пикселей. Регулировка высокого напряжения, усиления и смещения на каждом отдельном канале, чтобы максимизировать интенсивность сигналов, избегая при этом насыщения (красные пиксели). Там должно быть только несколько красных пикселей в каждом канале.
  10. Создание трехмерных наборов изображений путем сканирования тысе кожи уха начинают поверхностно в роговом слое кожи и продвигается вниз с х, у, г объемах 317 мкм × мкм × 30 мкм (объектив 40Х) 317 мкм × 635 мкм × 30 мкм (объектив 20Х), или 1,270 мкм × 635 1270 мкм × 50 мкм (объектив 10X) на Z-шагом 2 мкм.
    Примечание: Роговой слой является внешний слой эпидермиса и может быть легко локализованным на основании его сильного сигнала автофлуоресцентной.
  11. В экспериментах покадровой обработки изображений, записывать трехмерные изображения каждые 2 или 4 мин до 8 ч.
  12. Intermittently, как мышь начинает восстанавливаться после анестезии, отметил на основе наблюдения за подергивание усов, администрировать 5 - 10 мкл половинной дозы анестезии коктейль через бабочка иглы.
    Примечание: Будьте осторожны дозы анестезии - передозировка может привести к смерти мыши. В качестве альтернативы, ингаляции обезболивание в банку может быть применена к мыши для кратковременного наркоза и аобтекатель может быть использован для длительной обработки изображений.
  13. Удалите наркозом мышь со сцены, когда визуализация завершена. Снять пленку и удалить бабочки иглу из живота мыши. Вернуть мышь в отдельную клетку в жилищном вивария.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для кратковременного томографии (<1 час), мышей полностью оправиться от наркоза быстро в 1 - 3 ч. Для длительной обработки изображений (~ 8 ч), мыши восстанавливаться медленно, с характерным периодом восстановления 12 - 16 ч. Таким образом, пероральное введение воды рекомендуется по крайней мере несколько раз в течение периода восстановления, чтобы предотвратить обезвоживание тяжелой.
  14. Наборы данных визуализации процесса, отслеживать отдельные клетки, генерировать миграционные пути, и рассчитать скорость и направленность миграции клеток с использованием программного обеспечения для анализа изображения 25.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Скрининг pIL1-DsRed мышей осуществляется на основании фенотипического флуоресцентного сигнала DsRed производимого их лейкоцитов периферической крови с помощью проточной цитометрии. LPS стимуляция как известно, индуцирует продукцию IL-1 & beta ; в миелоидных клетках , включая ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Целью данного исследования является разработка технологии для мониторинга процесса нейтрофильной затравки в живых животных, которые еще не были выполнены с помощью имеющихся в настоящее время методов. Для достижения этой цели, три установленные методики выполняются: 1) индукция восп?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have no financial conflicts of interest.

Благодарности

The authors have no acknowledgements.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Heparin sodiumAPP PharmaceuticalsNDC 63323-540-31
ACK lysing bufferLonza10-548E
Fetal bovine serumSigma-AldrichF0926
LipopolysaccharidesSigma-AldrichL4391
Ketamine hydrochlorideHospiraNDC 0409-2051-05
XylazineLLOYD LaboratoryNADA #139-236
AcepromazineBoehringer IngelheimANADA 200-361
Hair-removal creamChurch & Dwight
AcetoneFisher ScientificA16P4
OxazoloneSigma-AldrichE0753
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G antibodyBioLegend127610
U-100 insulin syringe with 28 G needleBD329461
FITC-CM-Dextran, 150 kDaSigma-Aldrich74817
Butterfly infusion set (27 G needle)BD387312
FACSCalibur cytometerBD
CellQuest Pro softwareBD
Confocal microscopeOlympusFV1000
Metamorph SoftwareUniversal Imaging

Ссылки

  1. Nauseef, W. M., Borregaard, N. Neutrophils at work. Nat. Immunol. 15 (7), 602-611 (2014).
  2. Kobayashi, S. D., Voyich, J. M., Burlak, C., DeLeo, F. R. Neutrophils in the innate immune response. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz). 53 (6), 505-517 (2005).
  3. Condliffe, A. M., Kitchen, E., Chilvers, E. R. Neutrophil priming: pathophysiological consequences and underlying mechanisms. Clin. Sci. (Lond). 94 (5), 461-471 (1998).
  4. El-Benna, J., Dang, P. M., Gougerot-Pocidalo, M. A. Priming of the neutrophil NADPH oxidase activation: role of p47phox phosphorylation and NOX2 mobilization to the plasma membrane. Semin. Immunopathol. 30 (3), 279-289 (2008).
  5. Benson, R. A., McInnes, I. B., Brewer, J. M., Garside, P. Cellular imaging in rheumatic diseases. Nat. Rev. Rheumatol. 11 (6), 357-367 (2015).
  6. Herz, J., Zinselmeyer, B. H., McGavern, D. B. Two-photon imaging of microbial immunity in living tissues. Microsc. Microanal. 18 (4), 730-741 (2012).
  7. Tang, J., van Panhuys, N., Kastenmuller, W., Germain, R. N. The future of immunoimaging--deeper, bigger, more precise, and definitively more colorful. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1407-1412 (2013).
  8. Weigert, R., Porat-Shliom, N., Amornphimoltham, P. Imaging cell biology in live animals: ready for prime time. J. Cell. Biol. 201 (7), 969-979 (2013).
  9. Ng, L. G., et al. Visualizing the neutrophil response to sterile tissue injury in mouse dermis reveals a three-phase cascade of events. J. Invest. Dermatol. 131 (10), 2058-2068 (2011).
  10. Kreisel, D., et al. In vivo two-photon imaging reveals monocyte-dependent neutrophil extravasation during pulmonary inflammation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107 (42), 18073-18078 (2010).
  11. Finsterbusch, M., Voisin, M. B., Beyrau, M., Williams, T. J., Nourshargh, S. Neutrophils recruited by chemoattractants in vivo induce microvascular plasma protein leakage through secretion of TNF. J. Exp. Med. 211 (7), 1307-1314 (2014).
  12. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S inhibits neutrophil recruitment during the early stages of Streptococcus pyogenes infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  13. Howe, C. L., Lafrance-Corey, R. G., Sundsbak, R. S., Lafrance, S. J. Inflammatory monocytes damage the hippocampus during acute picornavirus infection of the brain. J. Neuroinflammation. 9 (50), (2012).
  14. Chen, X., et al. In vivo multi-modal imaging of experimental autoimmune uveoretinitis in transgenic reporter mice reveals the dynamic nature of inflammatory changes during disease progression. J. Neuroinflammation. 12 (17), (2015).
  15. Slaba, I., et al. Imaging the Dynamic Platelet-Neutrophil Response in Sterile Liver Injury and Repair in Mice. Hepatology. , (2015).
  16. Mizuno, R., et al. In vivo imaging reveals PKA regulation of ERK activity during neutrophil recruitment to inflamed intestines. J. Exp. Med. 211 (6), 1123-1136 (2014).
  17. Hasenberg, A., et al. Catchup: a mouse model for imaging-based tracking and modulation of neutrophil granulocytes. Nat. Methods. 12 (5), 445-452 (2015).
  18. Matsushima, H., et al. Intravital imaging of IL-1beta production in skin. J. Invest. Dermatol. 130 (6), 1571-1580 (2010).
  19. Yipp, B. G., Kubes, P. Antibodies against neutrophil LY6G do not inhibit leukocyte recruitment in mice in vivo. Blood. 121 (1), 241-242 (2013).
  20. Kikushima, K., Kita, S., Higuchi, H. A non-invasive imaging for the in vivo tracking of high-speed vesicle transport in mouse neutrophils. Sci. Rep. 3, (1913).
  21. Sreeramkumar, V., et al. Neutrophils scan for activated platelets to initiate inflammation. Science. 346 (6214), 1234-1238 (2014).
  22. Yao, Y., et al. Neutrophil priming occurs in a sequential manner and can be visualized in living animals by monitoring IL-1beta promoter activation. J. Immunol. 194 (3), 1211-1224 (2015).
  23. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim. (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
  24. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice). Lab. Anim. (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  25. Fotos, J. S., et al. Automated time-lapse microscopy and high-resolution tracking of cell migration). Cytotechnology. 51 (1), 7-19 (2006).
  26. Mizumoto, N., et al. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening. Blood. 106 (9), 3082-3089 (2005).
  27. Cassatella, M. A. Neutrophil-derived proteins: selling cytokines by the pound. Adv. Immunol. 73, 369-509 (1999).
  28. Grahames, C. B., Michel, A. D., Chessell, I. P., Humphrey, P. P. Pharmacological characterization of ATP- and LPS-induced IL-1beta release in human monocytes. Br. J. Pharmacol. 127 (8), 1915-1921 (1999).
  29. Levin, M., Leibrecht, H., Ryan, J., Van Dolah, F., De Guise, S. Immunomodulatory effects of domoic acid differ between in vivo and in vitro exposure in mice. Mar. Drugs. 6 (4), 636-659 (2008).
  30. Basu, S., Hodgson, G., Katz, M., Dunn, A. R. Evaluation of role of G-CSF in the production, survival, and release of neutrophils from bone marrow into circulation. Blood. 100 (3), 854-861 (2002).
  31. Kreft, M., Stenovec, M., Zorec, R. Focus-drift correction in time-lapse confocal imaging. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1048, 321-330 (2005).
  32. Zucker, R. M. Quality assessment of confocal microscopy slide-based systems: instability. Cytometry A. 69 (7), 677-690 (2006).
  33. Hogan, H. Focusing on the experiment. Biophotonics. Int. 13, 48-51 (2006).
  34. Kabashima, K., Egawa, G. Intravital multiphoton imaging of cutaneous immune responses. J. Invest. Dermatol. 134 (11), 2680-2684 (2014).
  35. Egawa, G., Natsuaki, Y., Miyachi, Y., Kabashima, K. Three-dimensional imaging of epidermal keratinocytes and dermal vasculatures using two-photon microscopy. J. Dermatol. Sci. 70 (2), 143-145 (2013).
  36. Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat. Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
  37. Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A method for 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  38. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nat. Protoc. 8 (3), 583-594 (2013).
  39. Looney, M. R., et al. Stabilized imaging of immune surveillance in the mouse lung. Nat. Methods. 8 (1), 91-96 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Immunology112Immunology

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены