Генерация Индуцированные-плюрипотентных стволовых клеток с использованием фибробластоподобных синовиоциты Выделен из суставов больных ревматоидным артритом

Резюме

Здесь мы опишем протокол для генерации человека наведенного плюрипотентных стволовых клеток из пациента, полученных фибробластоподобных синовиоциты, с использованием лентивирусов системы без фидерных клеток.

Аннотация

Зрелые соматические клетки могут быть отменены в плюрипотентные стволовые клетки, как состояние, используя определенный набор факторов перепрограммирования. Многочисленные исследования породили наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из различных типов соматических клеток с помощью трансдукции четыре Яманака факторы транскрипции: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Myc. Изучение ИПСК остается на переднем крае биологической и клинических исследований. В частности, иПСК конкретного пациента могут быть использованы в качестве новаторского инструмента для изучения патобиологии заболевания, так как иПСК может быть вызван из ткани любого индивидуума. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим воспалительным заболеванием, классифицируемых разрушением хряща и структуры кости в суставе. Синовиальной гиперплазии является одной из основных причин, или симптомы, которые приводят к этим результатам в РА. Фибробластоподобных синовиоциты (ФЛС) являются основным компонентом клетки в гиперплазированном синовии. ФЛС в суставе беспредельно размножаться, в конечном счете, вторжение в соседний cartilвозраст и кости. В настоящее время гиперпластический синовиальной можно удалить только с помощью хирургической процедуры. Удаленный синовиальной используется для исследований RA в качестве материала, который отражает воспалительное состояние сустава. В качестве основного игрока в патогенезе ревматоидного артрита, ФЛС может быть использован в качестве материала для создания и исследовать ИПСК пациентов с РА. В данном исследовании мы использовали FLSS пациента RA для создания иПСК. Использование лентивирусов системы, мы обнаружили, что ФЛС может генерировать RA конкретного пациента IPSC. В иПСК, полученные от ФЛС можно дополнительно использовать в качестве инструмента для изучения патофизиологии РА в будущем.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки платформа следующего поколения в различных клинических и биологических полей. Они являются многообещающим инструментом, который может быть использован при моделировании заболеваний, скрининга лекарственных средств и регенеративной медицинской терапии. Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) в основном были использованы для изучения и понимания плюрипотентных клеток. Тем не менее, изолированных разрушением человеческой бластоцисты, ЭСК связаны с несколькими этическими проблемами. В 2007 году доктор Яманака и его команда вспять процесс программирования клеток и разработал стволовые клетки из человеческой взрослых соматических клеток ^1,2. Таким образом, в отличие от ЭСК, наведенного плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) могут быть получены из зрелых соматических клеток, избегая этических препятствий.

Как правило, иПСК генерируются поставку четырех экзогенных генов: Oct4, Sox2, Klf4 и с-Мус. Эти факторы Яманака первоначально доставлены с использованием лентивирусов и ретровирусных систем. Первые иПСК были получены из мышиного соматической Cгезов ^3. Впоследствии, методика была применена к фибробластах дермы человека ^1,2. Последующие исследования успешно создали иПСК из различных источников, таких как моча, кровь ^{4 5,6,} кератиноциты ^7, и несколько других типов клеток. Тем не менее, есть некоторые соматические клетки, которые не были использованы в перепрограммировании, а также скрининг возможностей перепрограммирования клеток разных типов от конкретных тканей в состоянии болезни, по-прежнему требуется.

Ревматоидный артрит (РА) является заболеванием, которое может поражать все суставы и привести к аутоиммунных состояний в других органах. РА поражает около 1% взрослых в развитых странах мира. Это довольно распространенное заболевание , и его частота возрастает с каждым годом ^8. Тем не менее, RA трудно определить на ранних стадиях и oncebone разрушения происходит не существует лечения, которое может восстановить ущерб. Кроме того, эффективность лекарственного средства отличается от пациента к пациенту, и трудно предсказать, медикине, что требуется. Таким образом, разработка метода скрининга наркотиков необходим, и необходим материал клеток, которые могут отражать условия РА.

Фибробластоподобных синовиоцитов (FLSS) являются активным участником клеточное в патогенезе ревматоидного артрита ^9,10. ФЛС существуют в синовиальной интимы прокладки между суставной капсулы и полости, которая также упоминается как синовии. Поддерживая совместную структуру и обеспечивая питательные вещества для окружающей хряща, ФЛС обычно играют решающую роль в совместной функции и техническом обслуживании. Тем не менее, ФЛС в РА имеют инвазивный фенотип. РА ФЛС есть рак , как фенотип, в конечном счете разрушает окружающую кость бесконечной пролиферации ^10. С помощью этой уникальной характеристикой, ФЛС может быть использован в качестве перспективного материала, который может отражать патобиологии RA. Тем не менее, эти клетки редко производятся, так и клеточные фенотипы изменяют , так как клетки проходят через несколько проходов в ин витро условия. Таким образом, она может быть сложной, чтобы использовать RA FLSS в качестве инструмента, который может представлять состояние пациента.

Теоретически, RA пациента, полученных иПСК (RA-иПСК) может стать идеальным инструментом для скрининга лекарственных средств и проведения дальнейших исследований. Сформированные иПСК обладают способностью самообновления и может быть сохранена и расширена в пробирке. С плюрипотентности, эти клетки могут быть дифференцированы в зрелые хондроцитов и остеоцитов родах, которые могут способствовать клеточного материала для конкретных исследований в РА и других заболеваний , связанных с костями ^11.

В данном исследовании мы покажем, как изолировать и расширить FLSS от удаленного хирургическим путем синовии, и как генерировать RA-ИПСК из ФЛС с использованием лентивирусов, содержащих Яманака факторы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Заявление по этике: Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC12TISI0861).

1. синовиоцитов Выделение и расширения

1. синовиоцитов Изоляция
   1. Стерилизация две пары хирургических ножниц и одну пару щипцов.
   2. Передача синовиальной ткани на 100 мм чашку и промывают 5 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS), содержащем 1% пенициллина / стрептомицина.
   3. Отрезанные желтоватые жировую ткань и кости остатки. Передача обрезанную ткани на лунку 6-луночного планшета и добавляют 5 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) с 20% фетальной телячьей сыворотки (FBS).
   4. Нарезать ткани с ножницами, пока кусочки не достаточно малы, чтобы проникать Пипеткой.
   5. Передача ткани, содержащей носитель в коническую пробирку на 50 мл. Урожай оставшийся материал путем добавления 5 мл DMEM с 20% FBS в 6-луночный планшет, а затем перенести в пробирку.
   6. Оттепель коллагеназы на льду. Добавить коллагеназы до конечной концентрации 0,01% и запечатать трубу с парафином. Инкубируют на водяной бане при 37 ° C при встряхивании в течение 4 часов.
   7. После инкубации, заполнить трубку с DMEM с 20% FBS, пока общий объем не 50 мл и центрифуге при 300 мкг, RT в течение 10 мин.
   8. Удалить супернатант, не нарушая гранул и добавляют 40 мл среды для ресуспендирования гранул.
   9. Повторите шаги 1.1.10-1.1.11.
   10. Ресуспендируют осадок в 25 мл DMEM с 20% FBS и ждать больших комков ткани опускаются на дно.
   11. Перенести супернатант в 100 мм чашку и инкубировать при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 14 дней.
2. Синовиоцитов обслуживание и расширение
   1. Выбросьте использованные носители из пластины и промыть клетки с 5 мл PBS.
   2. Добавить 1 мл ФБР / 1 мМ ЭДТА и инкубировать при 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 2 мин.
   3. Нажмите на блюдо мягко и transfeR клетки в коническую пробирку на 15 мл. Центрифуга клетки при 250 мкг, RT в течение 2 мин.
   4. Удалить супернатант, не нарушая гранул и ресуспендируют осадок в 30 мл DMEM с 20% FBS.
   5. Передача клетки до 3 х 100 мм чашках, не оставляя видимых остатки материала.
   6. Заменить носитель свежей средой каждые 3 d. Разделение клеток при 80% сплошности с использованием 1 мл ФБР / 1 мМ ЭДТА. Поддерживать до прохождения 3 перед использованием. Разделите каждое блюдо из клеток в 3-х блюд в каждом расколе.
      Примечание: После достижения прохода 3, клетки, которые не будут использоваться сразу же могут быть заморожены.

2. Перепрограммирование ФЛС Использование Лентивирусов-кодирующих факторы Яманака

1. Трансдукция (Д0)
   1. Семенной 3 × 10 ⁴ клеток на лунку 6-луночного планшета в ростовой среде (500 мл DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина / стрептомицина , дополненной). Инкубируйте клетки O / N при температуре 37 ° С в 5% CO2.
   2. На следующий день, удалите один флакон, содержащий 4 лентивирусов Яманака факторов: Oct4, Klf4, Sox2 и с-Мус из морозильной камеры и оттепель при 4 ° С. Примечание: Лентивирус был получен в соответствии с процедурой , описанной в предыдущем исследовании ^11.
   3. В то время как оттаивает вирус, изменения носителя питательной среды FLS (20% FBS плюс антибиотики в DMEM), содержащей 10 мкг / мл полибрен и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
   4. После смены носителя, добавляют 30 мкл лентивирусов к клеткам и аккуратно перемешать. Для улучшения инфекции, центрифугировать планшет при 680 х г, 35 ° С в течение 30 мин.
   5. После центрифугирования, инкубировать клетки при 37 ° С в 5% CO _2.
2. Техническое обслуживание До перепрограммирование Видимый
   1. В течение 3 суток, замените носитель ежедневно с FLS ростовой средой, содержащей 0,1 мМ бутират натрия и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
   2. На следующий день, замените носитель со смесью сред роста FLS иIpsc медиа (соотношение 1: 1), содержащего 0,1 мМ бутират натрия и 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты.
      Примечание: Компоненты СМИ иПСК приведен в списке материалов / оборудования.
3. Деление клеток для формирования колонии
   1. Приготовьте витронектиновый покрытием 6-луночный планшет.
      1. Добавить 60 мкл витронектина до 6 мл PBS без Са ²⁺ и Mg ^2+. Поместите 2 мл смеси в каждый лунки и инкубируют в КТ в течение по меньшей мере 1 ч. Примечание: Рабочая концентрация витронектина составляет 5 мкг / мл.
   2. На d5, мыть клетки с PBS.
   3. Добавить 1 мл PBS / 1 мМ ЭДТА , чтобы открепления клеток и инкубируют при 37 ° С в атмосфере 5% СО ₂ в течение 2 мин.
   4. Урожай клетки и центрифуги при 250 мкг, RT в течение 2 мин.
   5. Разделение клеток при 3-х различных соотношениях (1: 3, 1: 6 и 1: 9) для достижения различных confluencies. Добавьте 900 мкл среды к осадку клеток и ресуспендируют. Добавьте 300, 150, и 100 мкл клеточной смеси на лунку 6-луночный планшет для достижения соотношении 1: 3, 1: 6 и 1: 9, соответственно.
   6. Замените носитель ежедневно с IPSC СМИ, пока не появятся колонии. Колонии появится примерно через D18. Примечание: На данном этапе IPSC колонии сосуществовать с не-перепрограммировать ФЛС.
4. Сбор колонии
   1. Подготовка 48-луночный планшет с витронектином покрытием путем добавления 500 мкл витронектина в лунки, и инкубируют при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
   2. Поместите микроскоп на чистом столе, и снять 6-луночного планшета из инкубатора.
   3. Удалить решение витронектиновый из 48-луночного планшета и добавить 500 мкл среды IPSC, дополненной 10 мМ Rho-ассоциированной, суперспирализованный содержащий протеинкиназы (ROCK) ингибитор.
   4. Используя наконечник пипетки 10p, обвести колонии. Перенести принимаемое колонии в одну лунку 48-луночного планшета.
   5. После того, как собирание несколько колоний, инкубировать клетки при 37 ° С в атмосфере 5% СО _2.
   6. Поддерживать клетки до тех пор, пока колонии большие ENOтьфу для передачи. Примечание: Обычно мы пролили клетки, когда колония выходит из видимой области микроскопа, если смотреть на 100х.

3. Иммунофлуоресценции Окрашивание

1. Cell Подготовка
   1. Поместите стерильную 18 мм защитное стекло в 12-луночного планшета.
   2. Добавьте 1 мл PBS, чтобы охладить и полоскать покровного стекла.
   3. Заменить на 1 мл мл витронектина раствора 10 мкг /.
   4. Инкубируйте планшет при комнатной температуре в течение по меньшей мере 1 ч.
   5. Отменить решение витронектиновый и ИПСК пластины в витронектина покрытием пластины 12-луночного и культуры в течение 7 дней при температуре 37 ° С, 5% СО _2, изменение средств массовой информации ежедневно.
2. Cell Окрашивание
   1. Выбросьте культуральной среды и промыть клетки с PBS один раз.
   2. Зафиксировать клетки в 0,4% параформальдегида (PFA) в течение 30 мин при комнатной температуре.
   3. Клетки проницаемыми с 0,1% тритона Х-100 в течение 5 мин при комнатной температуре.
   4. Удалите пермеабилизациираствора и блок с ФБС, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в течение 30 мин при комнатной температуре.
   5. Развести антитела в PBS , содержащем 2% BSA в соответствии с таблицей 1. Инкубируйте клетки с первичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре.
   6. Добавить вторичные антитела (разбавленный 1: 200) и инкубировать клетки в течение 1 часа при комнатной температуре, избегая света.
   7. Treat клеток с 1 мкл / мл DAPI в течение 10 мин.
   8. Поместите покровное стекло поверх предметное стекло с реагентом antifade и инкубируют при комнатной температуре в течение 24 ч, избегая света.
   9. Проверьте выражение с помощью флуоресцентного микроскопа.

4. В режиме реального времени полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР)

1. Экстракт мРНК из клеточного осадка с помощью гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ методом экстракции ^11.
2. Amplify кДНК из 2 мкг тотальной мРНК с использованием обратной транскрипции ^11.
3. Смешайте компоненты, необходимые для проведения ПЦР с использованием 2 мкл кДНК ТЭМПластина ^11.
4. Выполните RT-PCR и проверить результаты помощью гель - электрофореза ^11.

5. щелочной фосфатазы (AP) Окрашивание

1. Культура иПСК в течение 5-7 дней при 37 ° С, 5% СО ₂ до окрашивания.
2. Аспирируйте средства массовой информации и зафиксировать клетки с 4% PFA в течение 1 мин.
3. Выбросьте закрепитель и промойте клетки с буфером для ополаскивания 1X.
4. Подготовка реагентов для окрашивания AP. Перемешайте реагенты в следующем соотношении: Fast Red Violet: нафтол AS-BI фосфатный раствор: вода = 2: 1: 1.
5. Инкубируйте клетки с красящим раствором при комнатной температуре в течение 15 мин, избегая света.
6. Выбросьте окрашивание раствора и промыть клетки с буфером для ополаскивания.
7. Накройте клетки с PBS, чтобы предотвратить высыхание и проверять выражение с использованием светлого поля микроскопа.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

В данном исследовании мы опишем протокол для генерации иПСК из ФЛС с использованием лентивирусов системы. На рисунке 1А показана простая схема протокола изоляции FLS. После хирургического удаления синовиальной оболочки, ткань разрезали на маленькие кусочки с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

До открытия ИПСК, ученые в основном использовали эмбриональные для изучения биологии стволовых клеток и других клеточных клонов путем дифференциации. Тем не менее, стволовые клетки происходят из внутренней массы бластоцисты, которая является ранней стадии эмбриона. Для выделения ЭСК...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 ml Cornical Tube	SPL	50050
15 mlL Cornical Tube	SPL	50015
10 ml Disposable Pipette	Falcon	7551
5 ml Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
FLS Isolation Materials
Surgical Scissors
Surgical Forcep
DPBS	Life Technologies	14190-144
DMEM	Life Technologies	11995-073
Penicilin Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
Collagenase	Sigma Aldrich	C6885-100MG
Parafilm	Sigma Aldrich	54956
PBS/1 mM EDTA	Life Technologies	12604-039
iPSC Generation Materials
DMEM	Life Technologies	11885
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Life Technologies	11140-050
β-Mercaptoethanol	Sigma Aldrich	M3148
Polybrene	Chemicon	TR-1003-G
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333
Fetal Bovine Serum (FBS)	Life Technologies	16000-044
DPBS	Life Technologies	14190-144
Lentivirus
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	iPSC media ingredient (500 ml)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	iPSC media ingredient (Conc.: 543 μg/ml)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	iPSC media ingredient  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	iPSC media ingredient (Conc.: 10.7 μg/ml)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	iPSC media ingredient  (Conc.: 100 ng/ml)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	iPSC media ingredient (Conc.: 20 μg/ml)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	iPSC media ingredient (Conc.: 2 ng/ml)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	iPSC media ingredient  (Conc.: 64 μg/ml)
Polybrene	Chemicon	TR-1003
Sodium Butyrate	Sigma Aldrich	B5887
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Guality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde (PFA)	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin (BSA)	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
i-Taq DNA Polymerase	iNtRON BIOTECH	25021
UltraPure 10x TBE Buffer	Life Technologies	15581-044
loading star	Dyne Bio	A750
Agarose	Sigma-Aldrich	9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder marker	Enzynomics	DM003
Alkaline Phosphatase	Millipore	SCR004