Эхокардиографические подходы и протоколы для Всеобъемлющего Фенотипическая характеристика клапанной болезни сердца у мышей

Резюме

This protocol provides a detailed description of the echocardiographic approach for comprehensive phenotyping of heart and heart valve function in mice.

Аннотация

The aim of this manuscript and accompanying video is to provide an overview of the methods and approaches used for imaging heart valve function in rodents, with detailed descriptions of the appropriate methods for anesthesia, the echocardiographic windows used, the imaging planes and probe orientations for image acquisition, the methods for data analysis, and the limitations of emerging technologies for the evaluation of cardiac and valvular function. Importantly, we also highlight several future areas of research in cardiac and heart valve imaging that may be leveraged to gain insights into the pathogenesis of valve disease in preclinical animal models. We propose that using a systematic approach to evaluating cardiac and heart valve function in mice can result in more robust and reproducible data, as well as facilitate the discovery of previously underappreciated phenotypes in genetically-altered and/or physiologically-stressed mice.

Введение

Старение связано с прогрессивное увеличение сердечно - сосудистой кальцификации ^1. Гемодинамически значимый стеноз аортального клапана влияет на 3% населения в возрасте старше 65 лет ^2, а у пациентов с умеренной даже аортальный стеноз клапана (пиковой скорости 3-4 м / с) имеют 5 - летнюю выживаемость менее 40% в бессобытийная ^3. В настоящее время не существует эффективных методов лечения , чтобы замедлить прогрессирование кальцификации клапана аорты, и хирургическая замена аортального клапана является единственным доступным средством для лечения стеноза аортального клапана расширенный ^4.

Исследования , направленные на получение более глубокое понимание механизмов , которые способствуют возникновению и прогрессированию кальцификации клапана аорты являются ключевым первым шагом на пути к фармакологическим и нехирургических методов для управления аортальный стеноз клапана ^{5, 6.} генетическийLY-измененные мыши , сыграли важную роль в развитии нашего понимания механизмов , которые способствуют различным заболеваниям , и в настоящее время выходят на передний план механистических исследований , направленных на понимание биологии аортального клапана стеноз ^{6, 7, 8.} В отличие от других сердечно - сосудистых заболеваний , таких как атеросклероз и сердечная недостаточность, где стандартные протоколы для оценки сосудистой и желудочковой функции являются по большей части хорошо налаженной-то особые проблемы , связанные с фенотипа в естественных условиях функции клапанов сердца у мышей. В то время как недавние обзоры обеспечили тщательные обсуждения относительно преимуществ и недостатков многочисленных изображений и инвазивных методов , используемых для оценки функции клапана у грызунов ^{9, 10, 11,} на сегодняшний день мы не знаем о публикации , которая обеспечивает Compreнюю, шаг за шагом протокол для функции фенотипирования клапанов сердца у мышей.

Цель этой рукописи, чтобы описать методы и протоколы для фенотип функции клапана сердца у мышей. Все методы и процедуры были утверждены Институциональный уходу и использованию животных комитета по Мейо. Основные компоненты этого протокола включают глубину анестезии, оценку функции сердца и оценку функции клапанов сердца. Мы надеемся, что этот отчет будет служить не только для руководства исследователей, заинтересованных в проведении исследований в области заболевания клапанов сердца, но и начать национального и международного диалога в области стандартизации протокола для обеспечения воспроизводимости данных и обоснованность в этой быстро развивающейся области. Важно отметить, что успешное визуализация с использованием ультразвуковых систем высокого разрешения требует практических знаний о принципах сонография (и терминологии, обычно используемых в сонография), понимание фундаментального Принципале сердечной физиологии, а также значительный опыт работы с сонография, чтобы обеспечить точную и эффективный по времени оценки сердечной функции у грызунов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка материалов и оборудования (таблица 1 и рисунок 1)

1. Включите ультразвуковой машины. Введите идентификатор животного, дату и время (для серийных экспериментов с изображениями) и другую соответствующую информацию.
2. С помощью ультразвукового преобразователя высокочастотный, 40 МГц для мышей изображений менее ~ 20 г или 30 МГц для мышей больше, чем ~ 20 г.
3. Подключить платформу для электрокардиограммы (ЭКГ) для мониторинга ЭКГ стробирования изображений для определенных условий.
   Примечание: Критически, это также дает возможность мгновенного расчета частоты сердечных сокращений (ЧСС), который может быть использован в качестве одного из нескольких индексов соответствующей глубины анестезии.
4. Предварительно нагреть платформу до 37 ° С.
   Примечание: Все коммерчески доступные ультразвуковые машины имеют панель управления, которая обеспечивает контроль получения изображений и контроля управления для исследования B-режим, M-режим, и ДЭХОКГ. Сердечный инструмент измерения встроен в машину для автоматического измеренияи вычисление общих эхокардиографических параметров сердца и клапанных функций.

2. Подготовьте мышь для работы с изображениями и вводного наркоза

1. Аккуратно поднимите мышь за хвост и крепко держать животное на затылке его шеи.
2. Руководство нос животного в носовой конус. Начинают поток анестезии 1% изофлуран. Убедитесь в том, что животное седации в течение 3-5 с после воздействия газа.
3. Быстро и точно наводится животное на платформе в положении лежа на спине, убедившись в том, что передние ноги и задние ноги лежат на датчики ЭКГ платформы.
4. Аккуратно закрепите животное с помощью клейкой ленты на всех четырех конечностях, слегка применить клейкую ленту, чтобы стабилизировать голову в устройстве носовой обтекатель, и применять клейкую ленту, чтобы стабилизировать хвост. Обе задние ноги и передние ноги должны лежать, чтобы обеспечить стабильное и четкое обнаружение сигнала ЭКГ по физиологической системы формирования изображения.
5. Проверьте HR. Сделайте это используя ИМАГинг платформа с возможностями ЭКГ или с внешними устройствами ЭКГ. Убедитесь в том, что базовый уровень HR составляет от 600 до 700 ударов в минуту. Убедитесь в том, что HR не опускается ниже 450 ударов в минуту при любых обстоятельствах.
   Примечание: Во время процедуры HR может немного ухудшиться из-за анестезии, но она должна быть выше 500 ударов в минуту в большинстве случаев.
6. Отрегулируйте поток наркозом небольшими порциями соответственно (~ с шагом 0,1% каждые 15 сек до стабильного состояния анестезии не достигнут).
   Примечание: Стабильное состояние анестезии является состояние, при котором сохраняются вышеуказанные параметры сердца (см шаг 2.5) и животное открыто не реагирует на стимулы от размещения зонда на различных окнах изображения. Важно то, что это не является хирургической плоскости анестезии, что приводит к заметному cardiodepression у мышей. Для длительных сеансов визуализации, рекомендуется применение ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость кожи.
7. Проверьте температуру тела с помощью ректального термометра. Держите температуру между 36,5 ° C и 38 ° C.
   Примечание: В соответствующим образом экологически контролируемой комнате и на подогретую платформу, температура тела (измеренная ректально) остается постоянным в течение всей процедуры, и, следовательно, не является Поразительным фактором, влияющим на сердечно-сосудистую гемодинамику в течение долгого времени.
8. Сбрить волосы от груди, используя электрический клипер, предназначенный для использования с тонкими волосами. Протирать грудь с влажным бумажным полотенцем. Животное готово для работы с изображениями.
   Примечание: В то время как химическое удаление волос также может быть выполнена, избегать использования таких соединений, так как они могут вызвать значительное раздражение кожи в течение долгого времени в длительных опытах. Кроме того, соответствующее применение и удаление таких продуктов удаления волос химически основе может продлить продолжительность воздействия анестезии на 2-3 мин (~ 10-20%). Общее время от индукции анестезии до завершения подготовки кожи должно занять менее 3 мин.

_title "> 3. Следуйте Основные принципы и руководящие в приобретении кардиологических ультразвуковых изображений

Примечание: Существуют три ультразвуковых методы, используемые в получении изображения: B-режим / 2-D, M-режиме и доплеровские (спектральная импульсно-доплеровские волны и формирования изображений доплеровский цвет потока). Есть два основных положения датчиков , используемых для получения изображений сердца и клапанов сердца: парастернальной и апикальной окна (рисунок 2).

1. Из каждого положения датчика, получить несколько томографических изображений сердца относительно его длинной и короткой осей вручную вращающихся и наклонных преобразователя.
   Примечание: Вращение относится к повороту или скручивание датчик от фиксированного положения на стенке грудной клетки, в то время как ангуляция относится к движению стороны в сторону датчика от неподвижной точки на стенке грудной клетки. Все ультразвуковые преобразователи имеют индекс изображения маркера в виде канавки (выемки), внешний оребрением или кнопку.
2. Убедитесь в том, что ультразвуковое исследование сигNAL перпендикулярна к структуре-мишени путем регулировки положения датчика, соответственно.
3. Оптимизация потока цвета и пиковые сигналы скорости, совместив передаваемого ультразвукового луча параллельно потоку. Угол между ультразвукового луча и потока должна быть не менее 60 °.
4. Оптимизация качества изображения с помощью элементов управления на панели управления. Только площадь допроса должен заполнить дисплей изображения.
   Примечание: Точная регулировка в преобразовательных и платформенных позиции почти всегда необходимо получить четкие изображения. Даже в оптимальных условиях, дыхательных движений, грудной стенки анатомии (например, небольшое расстояние между ребрами), и вариации внутренней анатомии (как присущие и болезни , вызванной) может ограничить акустического окна и сделать получение изображений очень сложной задачей.
5. При измерении размеров левого желудочка в М-режиме и 2-D / B-режиме, поместите суппорт измерения в наиболее непрерывной линии эхо.
6. Отрегулировать цветным Доплера сектораd объем образца в области допроса путем регулирования контроля сектора, который находится на панели.
   Примечание: Цвет-схема кодирования в исследованиях доплеровских указывает скорость и направленность кровотока. Доплеровские сигналы, которые указывают на красный ламинарный поток крови в направлении датчика. Доплеровские сигналы, которые указывают на синий ламинарный поток от преобразователя. А "мозаика" цветной рисунок показывает области турбулентного или не ламинарного потока крови (что обычно происходит в клапанной стеноза или клапанной регургитации).
7. Запишите как минимум два 5 с полосами (или 100 кадров) в режиме реального времени B-режиме / 2D эхо от каждого окна визуализации для автономного анализа.
   Примечание: Коммерчески доступные эхо-машины имеют параметры получения изображения, которые захватывают предустановленного количество кадров или размеров кинокамеры цикла. Параметры захвата изображений могут быть модифицированы таким образом, чтобы более длинные циклы кинокамеры могут быть приобретены. Приобретение высококачественных изображений требует большого опыта и экспериментов. Investigторы должны найти правильную комбинацию размещения датчика и угла наклона платформы для получения изображения от многих взглядов и акустических окон.

4. Оценка аортального клапана (AV) Функция

Примечание: Оценки аорты функции клапана включают качественную оценку клапана (например, воспринимались толщина острием, повышенную эхогенность за счет клапанной кальцификации, а также наличие или отсутствие регургитации струй с использованием цветного Доплера) и количественных показателей функции клапана (например, пик трансвальвулярный скорость и параболическими расстояние разделения).

1. Начинают изображения аортального клапана, выбрав B-режим захвата изображения.
2. С животным надежно крепится на платформе и головой, обращенной в сторону от следователя, наклонить стол 15-20 ° влево. Это принесет сердце вперед и влево, ближе к грудной стенке. Применяют щедрое количество ультразвукового геля на преобразователе или непосредственно на агрудь Нимал в.
3. Расположите датчик parasternally, около 90 ° перпендикулярно длинной оси сердца, с индексом изображения маркера датчика указывая кзади (рисунок 2). В то время как в 2D / B-режиме, сдвиньте цефально преобразователя, пока AV не попадает в поле зрения. Это "короткая ось" вид аортального клапана.
   Примечание: Нормальный аортальный клапан имеет три тонких бугры, которые открываются широко во время систолы и закрывают адекватно во время диастолы, так что нет регургитацию крови обратно в левый желудочек. Бугры очень тонкие, двигаться очень быстро, и часто может быть сложным для визуализации.
4. Поверните преобразователь по часовой стрелке до точки индекса изображения маркера каудально. Обратите внимание корня аорты, аортального клапана, левого желудочка тракт оттока, митральный клапан, левое предсердие и часть правого желудочка пути оттока на дисплее изображения.
   Примечание: Это "парастернальная длинная ось" вид AV. Должен УЗИудостовериться в том, что существует два аортальных створок клапана видимые на протяжении всего сердечного цикла в изображениях В-режиме, что позволит в дальнейшем М-режима визуализации и анализа (см ниже).
5. Оценка корня аорты в этой точке зрения. Тщательно смести назад и вперед, так что корень аорты изображения содержат наибольшие размеры корня аорты. Измеряют наибольший переднезадней измерение аорты с помощью электронного измерителя, связанный с инструментом измерения, встроенного в машину.
6. Найдите аортального клапана в длинной оси. Уменьшите ширину изображения таким образом, что только аортальный клапан находится на дисплее изображения путем регулировки кнопки ширина изображения в панели управления. Установите M-режим линию допроса, где она пересекает кончики аортального клапана, чтобы точно оценить аортальный клапан разделения гребешка.
7. На дисплее M-режиме аортального клапана, измерьте расстояние разделения створка (коробчатой ​​появление в систоле), используя электронный измеритель, связанный с измement инструмент встроен в машину.
   Примечание: Наибольшее преимущество визуализации М-режиме является очень высоким временным разрешением, что имеет важное значение для оценки аортального функции клапана. В то время как М-режим изображения АВ могут быть приобретены в обоих взглядов коротко- и длинномерной, парастернальной вид длинной оси, как правило, предпочтительнее, так как плоскость формирования изображения позволяет ультразвуковой эхографии легко идентифицировать ориентацию и расположение кончиков бугры во время систолы.
8. Хотя до сих пор в парастернальной зрения длинномерной аортального клапана, нажмите клавишу управления цветом Доплера в панели управления. Применить цвет Doppler в области аортального клапана.
   Примечание: Нормальный поток из левого желудочка через аортальный клапан во время систолы обращена к датчику и, таким образом кодируется красным цветом.
9. Документ о наличии или отсутствии аортального клапана.
   Примечание: аортального клапана является ненормальным поток, который происходит во время диастолы и направлен в сторону от transducэр; Таким образом, он кодируется синим.
10. Нажмите кнопку управления Доплера импульсно-волновой. Используя трекбол, расположенный на панели управления, установите объем образца импульсной волны в проксимальной восходящей аорты, чуть выше аортального клапана, убедившись в том, что угол между ультразвуковым лучом и кровотока составляет менее 60 °, отогнув платформа и / или преобразователь. Если это возможно, получить пиковую скорость через аортальный клапан из suprasternal окна надреза.
11. Измерьте пиковой скорости от спектрального дисплея с помощью электронных суппорты , связанных с инструментом измерения , встроенного в машину (рис 3C и 3F).
    Примечание: Мозаика цвет обозначает высокую скорость потока, которая может содержать структуры потока, не ламинарным.

5. Оценка митрального клапана (MV) Функция

Примечание: Оценка митрального клапана функции включает в себя качественную оценку клапана (например, ввоспринимаемых толщина параболическими, увеличилась эхогенность за счет клапанной кальцификации, наличие или отсутствие регургитации струй с использованием цветного Доплера) и количественных показателей работы клапана.

1. Поместите датчик в апикальном положении в B-режиме. Расположите датчик таким образом , что он расположен под углом по направлению к голове мыши (фиг.2с). Обратите внимание на правый желудочек (RV), левого желудочка (ЛЖ), правое предсердие (RA) и левого предсердия (LA) на дисплее изображения. Вручную наклона платформы слегка так, что животное находится в положении "голова вниз", чтобы визуализировать митральный клапан, как она открывается в ЛЖ.
   Примечание: апикальной 4-камера является оптимальным вид для изучения скорости кровотока через митральный и трикуспидального клапанов, а также от скорости ткани митрального кольца. Это также хороший вид для оценки движения и размера RV и межжелудочковой перегородки.
2. Из апикальной 4-камеры, принести митрального клапана в фокусе за счет уменьшения ширины изображения.Заметим, что митральный клапан листовки появляются как две тонкие, подвижные нити открытие и закрытие в течение каждого сердечного цикла.
   Примечание: митрального листовки "нормальной" мыши может быть трудно визуализировать , если изображения осуществляется при физиологической HR (т.е.> 450 ударов в минуту).
3. Поместите М-режим курсора по митрального клапана, чтобы оценить толщину створок.
   Примечание: Передняя листовка лучше всего представима в систолу , когда она перпендикулярна ультразвукового луча (рисунок 4).
4. Использование апикальная 4-камеры, применить цвет Doppler к изображению поток из левого предсердия через митральный клапан во время диастолы. Обратите внимание на митральной регургитации клапана.
   Примечание: поток направлен в сторону датчика и, следовательно, кодируется красным. Регургитационного поток будет закодирован синий и происходит во время систолы (рисунок 5).
5. Используя апикальная длинномерной, переключиться в режим импульсно-волновой. Перемещение объема Доплера образца к кончикаммитрального клапана листовку. Обратите внимание на два пика митрального притока спектрального дисплея. Если листовки не очень хорошо визуализируется, используйте цветной Doppler, чтобы идентифицировать области с яркими узорами красного или мозаики цвета и поместите объем образца в этой точке.
   Примечание: Спектральный дисплей потока митрального имеет два пика в медленном ч (<450 ударов в минуту). В нормальных ГКР (> 450 ударов в минуту), то ранне- (Е) и позднего наполнения (А) потоки слиты. Спектральный допплер отображение потока через митральный клапан используется при оценке диастолической функции ЛЖ (этап 7.5).

6. Оценка правосторонняя клапана сердца Функция

ПРИМЕЧАНИЕ: трехстворчатый и легочный клапаны содержат правостороннюю клапанов сердца. Трехстворчатый клапан может быть легко визуализированы в апикальной длинномерные, в то время как легочный клапан может быть визуализированы в представлениях как парастернальная долгосрочных и короткой оси.

1. Из апикальной длинной оси, наклон или точка кончика измерительный преобразователь Uпоют качательное движение таким образом, что правый желудочек находится в центре дисплея изображения. Уменьшите ширину изображения, так что только правый желудочек видна на дисплее изображения.
2. В той же плоскости изображения, визуализировать трикуспидального клапана листовки, которые появляются в виде тонких нитей, мобильные между правым предсердием и правым желудочком и которые открываются и закрываются в течение каждого сердечного цикла.
3. Применить цвет Doppler в области трикуспидального клапана. Примечание для трикуспидальной регургитации клапана.
   Примечание: Нормальный поток газа происходит во время диастолы, направляется к преобразователю, и, следовательно, кодируется красным. Ненормальный поток регургитации происходит во время систолы, направлена ​​в сторону от датчика, и, следовательно, кодируется синим. Пик скорость регургитации струи используется для оценки правого желудочка систолического давления.
4. Переместите датчик в парастернальной позиции короткой оси на уровне аортального клапана. Над аортального клапана являются outf правого желудочканизкого тракта, легочный клапан, проксимальные главной легочной артерии, а правая и левая легочные артерии (рисунок 6).
5. Поверните преобразователь по часовой стрелке к модифицированному парастернальной позиции длинной оси. Затем наклоните датчик немного вверх, чтобы получить вид короткой по оси легочного клапана.
6. С этой точки зрения, применять визуализацию M-режим для оценки расстояния разделения легочный створок клапана (рисунок 7).
7. Применить цвет Doppler в области легочного клапана для оценки для клапанной регургитации (мозаика с рисунком, высокой скорости струи во время диастолы) и стеноз (мозаика с рисунком, высокой скорости струи во время систолы).
8. Нажмите кнопку управления импульсно-волновую и поместите объем пробы сразу после легочного клапана.
   Примечание: Анализ спектрального допплеровского отображения потока используется для оценки давления в легочной артерии (рис 8).

7. Оценка функции сердца

Примечание: Оценка функции сердца включает в себя качественные оценки функции левого желудочка (например, визуальная оценка фракции выброса, региональной ненормальность движения стены, и воспринимаемой толщины стенок) и количественные показатели левого желудочка функция (например, фракция выброса левого желудочка масса левого желудочка диастолической функции, а также показатели миокарда производительности).

1. Получить вид короткой оси ЛЖ в 2D / B-режиме, с преобразователем в парастернальной позиции короткой оси на уровне папиллярных мышц. Перемещайте датчик вверх и вниз, чтобы сканировать LV от основания до вершины. Обратите внимание на отклонения движения стенки.
2. С точки зрения парастернальной короткой оси левого желудочка, нажмите кнопку M-режим, расположенный на панели управления. Использование трекбол, поместите М-режим курсора в центре полости левого желудочка на уровне папиллярных мышц и obtaiN M-режим изображения.
3. Измерьте размер левого желудочка полости в конце диастолы, где расстояние между передней стенкой и задней стенкой является самым большим, и в конец систолы, где внутреннее движение передней и задней стенок максимальна (рис 9).
4. Измерьте передней и задней толщины стенки в конце диастолы и конец систолы.
   Примечание: В то время как папиллярные мышцы являются важным ориентиром для обеспечения правильной плоскости формирования изображения, будьте осторожны, чтобы не включать их в любых измерениях.
5. Переместите датчик к вершинной окна. См шаг 5.1. Оценка левого желудочка диастолическое функции с использованием импульсно-волнового доплеровского кровотока через митральный клапан в апикальной длинной оси.
6. Поместите объем образца на кончиках митральных створок клапана. Измерьте пик митрального скорость притока из спектрального отображения импульсно-доплеровской скорости продольных волн через митральный клапан.
7. Поместите объем образца между ЛЖ Влиянвл и отток. Обратите внимание, митрального и аортального клапана закрытия и открытия сигналов. Измерьте изоволюмического время релаксации, изоволюмического сокращения времени и времени выброса левого желудочка (Рисунок 10).
8. Выполните тканевой допплерографии (TDI) в митрального кольца в апикальной длинной оси. Нажмите кнопку управления TDI и поместите объем образца в медиальной части митрального кольца. Убедитесь, что объем выборки не посягает на митрального листовок. Держите Доплера размер тома образца между 0,21 мм и 0,27 мм. Измерьте раннюю диастолическую скорость (Е ') от кольца митрального клапана (рисунок 11).

8. Заключительные шаги

1. Обзор полученных изображений. Выяснить, что все необходимые изображения были получены.
2. Удалите излишки ультразвука гель из грудной клетки мыши и осторожно удалите ленту, удерживающий животное на месте. Выключите анестезию.
3. Поместите животное на фильтровальную бумажное полотенце(Не постельные принадлежности, которые могут быть придыханием или может блокировать дыхательные пути во время восстановления). Обратите внимание на животное до грудины лежачее пока не будет достигнута. Если наркоз вводят надлежащим образом, восстановление должно происходить в пределах от 30 до 60 с.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Примеры изображений, которые обычно полученные из сердца ультразвуковых изображений животных включены в рукописи. Иллюстрация размещения датчика на груди животного предоставляется, чтобы дать читателю ясное понимание того, где расположен датчик для получения изоб?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Индукция анестезии

Правильная индукция и поддержание анестезии имеет решающее значение для точной оценки изменений сердечного клапана и функции сердца у мышей. Учитывая быстрое индукции анестезии, вызванное изофлуран и относительно длительного вымывания вре?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
High resolution ultrasound machine	VisualSonics, Fujifilm	Vevo 2100
Isoflurane diffuser (capable of delivering 1 % to 1.5 % isoflurane mixed with 1 L/min 100% O2	VisualSonics, Fujifilm	N/A
Transducers for small mice (550D) or larger mice (400)	MicroScan, VisualSonics, Fujifilm	MS 550D, MS 400
Animal platform	VisualSonics, Fujifilm	11503
Advanced physiological monitoring unit	VisualSonics, Fujifilm	N/A
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-019-10
Nose cone and tubing connected to isoflurane diffuser and 100% O2	Custom Engineered in-house	--
Hair razor	Andis Super AGR+ vet pack clipper	AD65340
Ultrasound gel	Parker Laboratories	REF 01-08
Electrode gel	Parker Laboratories	REF 15-25
Adhesive tapes	Fisher Laboratories	1590120B
Paper towels