JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол для функциональной оценки комплексных библиотек мутагенеза насыщения Одноузельная белков с использованием высокой пропускной последовательности. Важно отметить, что этот подход использует ортогональные пары праймеров мультиплекс библиотека строительства и последовательности. Представитель результаты с использованием TEM-1 бета-лактамазу, выбранный при клинически значимой дозы ампициллина предоставляются.

Аннотация

Site-directed mutagenesis has long been used as a method to interrogate protein structure, function and evolution. Recent advances in massively-parallel sequencing technology have opened up the possibility of assessing the functional or fitness effects of large numbers of mutations simultaneously. Here, we present a protocol for experimentally determining the effects of all possible single amino acid mutations in a protein of interest utilizing high-throughput sequencing technology, using the 263 amino acid antibiotic resistance enzyme TEM-1 β-lactamase as an example. In this approach, a whole-protein saturation mutagenesis library is constructed by site-directed mutagenic PCR, randomizing each position individually to all possible amino acids. The library is then transformed into bacteria, and selected for the ability to confer resistance to β-lactam antibiotics. The fitness effect of each mutation is then determined by deep sequencing of the library before and after selection. Importantly, this protocol introduces methods which maximize sequencing read depth and permit the simultaneous selection of the entire mutation library, by mixing adjacent positions into groups of length accommodated by high-throughput sequencing read length and utilizing orthogonal primers to barcode each group. Representative results using this protocol are provided by assessing the fitness effects of all single amino acid mutations in TEM-1 at a clinically relevant dosage of ampicillin. The method should be easily extendable to other proteins for which a high-throughput selection assay is in place.

Введение

Мутагенеза уже давно используется в лаборатории для изучения свойств биологических систем и их эволюции, а также для создания мутантных белков или организмов с улучшенными или новыми функциями. В то время как ранние подходы опирались на методы , которые производят случайные мутации в организмах, появление технологии рекомбинантных ДНК позволило исследователям ввести выберите изменения ДНК в сайт-специфической манере, то есть., Сайт-направленный мутагенез 1,2. С учетом современных методов, как правило , с использованием мутагенных олигонуклеотидов в полимеразной цепной реакции (ПЦР), он относительно легкий , чтобы создавать и оценивать небольшое число мутаций (например., Точечные мутации) в данном гене 3,4. Это гораздо сложнее, однако, когда цель подходы, например, создание и оценка всех возможных одноузельных (или более высокого порядка) мутации.

В то время как многое узнали из ранних исследований, пытающихся оценить большое количество мutations в генах, методы , используемые часто трудоемкий, например , требующей оценки каждой мутации независимо друг от друга с помощью нонсенс - супрессоры штаммы 5-7, или были ограничены в количественном способности из - за низкой глубины секвенирование Sanger секвенирования 8. Методы , используемые в этих исследованиях , были в значительной степени вытеснен методами с использованием высокой пропускной способностью технологии секвенирования 9-12. Эти концептуально простые подходы влекут за собой создание библиотеки , содержащей большое количество мутаций, подвергая библиотеку на экран или выбора для функции, а затем глубокого секвенирования (то есть., По порядку> 10 6 секвенирования читает) библиотека , полученные до и после выбора. Таким образом, фенотипические или фитнес эффекты большого количества мутаций, представлен как изменение частоты популяции каждого мутанта, можно оценивать одновременно и более количественно.

Ранее мы ввели Simp(т. е, цельного белка мутагенеза насыщения библиотек) ле подход к оценке библиотек всех возможных мутаций отдельных аминокислот в белках, применимый к генам с длиной более , чем последовательности чтения длину 11,13: Во- первых, каждая позиция аминокислота представляет собой рандомизированное сайт-направленного мутагенных PCR. В ходе этого процесса ген разделен на группы, состоящие из прилежащих позиций с общей длиной размещены путем секвенирования платформы. Мутагенные ПЦР-продукты для каждой группы затем объединяются, и каждая группа независимо друг от друга подвергают селекции и высокой пропускной последовательности. Поддерживая соответствие между расположением мутаций в последовательности и длины последовательности чтения, этот подход имеет преимущество максимизации глубины секвенирования: в то время как можно было бы просто последовательность таких библиотек в коротких окнах без разделения на группы (например, с помощью стандартного дробовика. секвенирование подход), наиболее чтения, полученные бы дикого типа и, следовательно, мajority секвенирования пропускной способности неиспользуемого (например, для целого белка мутагенеза насыщения библиотеки белка кислоты 500 аминокислоты секвенировали в 100 аминокислот (300 пар оснований ) окон, при минимальном 80% читает будет последовательность дикого типа).

Здесь протокол представлен , который использует высокую пропускную способность секвенирования для функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения, с использованием вышеуказанного подхода (описанной на рисунке 1). Важно отметить, что мы вводим использование ортогональных праймеров в библиотеке процесса клонирования для штрих-кода каждой группы последовательности, которая позволяет им быть мультиплексированы в одну библиотеку, подвергаясь одновременно скрининга или отбора, а затем демультиплексируется для глубокого секвенирования. Так как группы последовательности не подвергаются отбору независимо друг от друга, это снижает нагрузку и гарантирует, что каждая мутация испытывает тот же уровень отбора. ТЕМ-1 β-лактамазы, фермента, который придает устойчивость на высоком уровне дляβ-лактамные антибиотики (например, ампициллин.) в бактерии используют в качестве модельной системы 14-16. Протокол описан для оценки в целом белка насыщения мутагенеза библиотеки TEM-1 в Е. палочка при отборе на приближенном уровне сыворотки для клинической дозы ампициллин (50 мкг / мл) 17,18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: На рисунке 1 контур протокола. Несколько шагов и реагенты в протоколе требуют меры безопасности (помеченные "ОСТОРОЖНО"). Обратитесь к Паспорта безопасности перед использованием. Все шаги протокола выполняются при комнатной температуре, если не указано другое.

1. Подготовить медиакультуры и планшеты

  1. Подготовка и стерилизовать автоклавированием 1 л очищенной воды, 100 мл Супер Оптимальное Бульон (Соб; Таблица 1), 1 л Лурии-Бертани бульона (LB; Таблица 2) и 1 л LB-агар (таблица 3). Приготовьте отдельно и стерилизовать по три культуры колбах каждая из которых содержит 1 L LB.
    Примечание: В протокол "вода" относится к автоклава стерилизуют очищенной воды; SOB, LB и LB-агар относятся к автоклава стерилизуют растворами.
  2. Приготовьте 12 мг / мл маточного ТЕТ путем растворения 0,12 г тетрациклина гидрохлорида в 10 мл 70% -ного этанола. Стерилизовать через фильтр 0,2 мкм и магазинпри 4 ° С в защищенном от света месте.
  3. Прохладный LB-агар до 50 ° С, а затем добавляют 1 мл Tet складе (конечная концентрация 12 мкг / мл Tet). Разлить в чашки Петри и охлаждаться при комнатной температуре в защищенном от света месте. Хранить при температуре 4 ° С в защищенном от света месте.

2. Построение полного гена Насыщенность мутагенеза Library

Примечание: Грунтовки; законченные ДЗП, дайджесты ограничение и лигатуры; и очищенных ДНК-образцов можно хранить при -20 ° С.

  1. Проектирование мутагенеза праймеров
    1. Для mutagenize каждой позиции аминокислоты для всех возможных аминокислот, разработать пару комплементарных мутагенных праймеров (смысл / вперед и антисмысловой / назад) для каждой позиции аминокислоты со следующими принципами:
      1. Замены кодон, соответствующий аминокислоте быть мутагенезу путем NNS (где N представляет собой смесь всех четырех нуклеотидных оснований и S представляет собой смесь цитозина (С) и гуанин (G)), и центр в чопорнаяэр, по бокам приблизительно на 15 нуклеотидов с каждой стороны.
      2. Убедитесь , что 5 'и 3' концы заканчиваются в C или G , и что температура плавления (Тпл) составляет приблизительно 70 ° С 3. С помощью вычислительной NNS_PrimerDesign.m сценария (см Дополнительный файл кода) для разработки NNS мутагенеза праймеров в соответствии с этими рекомендациями.
    2. Заказать праймеры из коммерческого источника. Для удобства использования, которые их синтезируют в формате 96-луночного планшета и предварительно разведенные в воде до 50 мкм, с одним набором пластин, содержащих смысл мутагенеза праймеров и еще антисмысловой праймеры.
    3. Наполните пипетку резервуар с водой и использовать многоканальную пипетку для переноса 95 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах. Развести Праймеры в 20 раз до 2,5 мкм с помощью многоканальной пипетки для передачи по 5 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие смысловой мутагенеза праймеров к родственным лунки планшетов, содержащих воду.
    4. Повторениешаг протокола 2.1.3 для разбавления антисмысловой мутагенеза праймеров.
  2. Синтез НМВ подбиблиотек для каждой позиции аминокислотной последовательности с двухстадийной ПЦР сайт-направленного мутагенеза
    1. Выполните первом раунде мутагенные МКП. Для каждого праймера мутагенеза, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием pBR322_AvrII плазмиды в качестве матрицы и праймеров AatII_F или AvrII_R (смысловой мутагенеза праймеров в паре с праймером AvrII_R и антисмысловых праймеров мутагенеза спаренными с праймером AatII_F; в общей сложности 526 ДЗП). Таблицу материалов для AatII_F и AvrII_R последовательностей.
      1. Подготовка ПЦР "мастер - микс" путем добавления реагентов из таблицы 4 в конической трубе 15 мл. Переложить в пипетку бассейна. Используйте многоканальную пипетку для переноса 15 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных ПЦР планшет. С помощью многоканальной пипетки для передачи по 10 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие разбавленные смысл мутагенеза праймеров к родственным скважин Iп планшеты ПЦР.
      2. Накройте каждую пластину ПЦР с уплотнительной пластины 96-луночного. Центрифуга при 200 х г в течение 2 мин.
      3. Передача пластин ПЦР в амплификатор и запустить следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 20 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С.
      4. Повторите шаги протокола 2.2.1.1 - 2.2.1.3 для 96-луночные планшеты, содержащие разбавленные антисмысловых праймеров мутагенеза.
    2. Выполнение второго круга мутагенные МКП. Для каждой позиции аминокислоты, готовят 25 мкл ПЦР-реакции с использованием праймеров AatII_F и AvrII_R, а также смешанный и разводили в первом раунде мутагенных продуктов ПЦР в качестве матрицы (всего 263 ДЗП).
      1. Наполните пипетку резервуар с водой и использовать многоканальную пипетку для передачи 198 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах.
      2. Комбинирование и разбавить в 100 раз мутагенных PCR продукты для каждой позиции аминокислотной последовательности с использованием многоканальной пипеткиПервая передача 1 мкл из 96-луночных ПЦР-планшеты, содержащие ПЦР-продуктов в результате смысле мутагенеза праймеров к родственным лунки планшетов, содержащих воду. Затем повторите передачу для ПЦР-продуктов в результате антисмысловых праймеров мутагенеза.
      3. Подготовка ПЦР "мастер - микс" путем добавления реагентов из Таблицы 5 к конической трубе 15 мл. Переложить в пипетку бассейна. С помощью многоканальной пипетки для передачи 24 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных ПЦР планшет. С помощью многоканальной пипетки для передачи 1 мкл из 96-луночные планшеты, содержащие смешанный и разводили в первом раунде мутагенных продуктов ПЦР с родственными лунки в пластинах ПЦР.
      4. Накройте каждую пластину ПЦР с уплотнительной пластины 96-луночного. Центрифуга при приблизительно 200 мкг в течение 2 мин. Передача пластин Термоциклеры и запустить ту же программу, как на стадии протокола 2.2.1.3.
    3. Анализ результатов второго круга мутагенных ДЗП методом гель-электрофореза.Убедитесь в том, что все продукты нужного размера и отсутствия загрязняющих продуктов.
      1. Добавить 2 мл 2Х геля красителем в пипетку бассейна, а затем использовать многоканальную пипетку для переноса 6 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных планшетах. Используйте многоканальную пипетку для переноса 6 мкл из 96-луночные ПЦР планшеты, содержащие второго круга мутагенных продуктов ПЦР к родственными лунки 96-луночных планшетов, содержащих краситель.
      2. Готовят гель 1,5% агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
      3. Нагрузка ДНК лестница в первой и последней полос движения каждой строки. Затем с помощью многоканальной пипетки, чтобы загрузить 10 мкл образцов из стадии протокола 2.2.3.1.
      4. Запуск геля при 100 V в течение 40 мин и изображения на УФ-просвечивания.
      5. Повторите шаги протокола 2.2.3.2 - 2.2.3.4, пока не будут проанализированы все образцы.
    4. Точное измерение концентрации каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР с использованием реагента дц количественный.
      1. Переводприблизительно 15 мл буфера EB в пипетку бассейна. Используйте многоканальную пипетку для переноса 49 мкл до 263 скважин в течение трех 96-луночных плотными стенками, прозрачным дном планшеты для анализа.
      2. Используйте многоканальную пипетку для передачи по 1 мкл каждого второго этапа ПЦР-продукта (этап протокола 2.2.2) к родственным лунки планшеты для анализа 96-луночные.
      3. Приготовьте стандартную кривую концентрации ДНК путем разбавления ДНК фага лямбда до 2 нг / мкл в 300 мкл EB буфера, а затем сделать десять двукратных разведений (для общей сложности 11 концентраций). Передача 50 мкл в первых одиннадцати столбцах строки одного из анализа 96-луночные планшеты из предыдущего шага, который не содержит образца; к двенадцатой колонке добавить 50 мкл буфера EB (реагент пустой).
      4. Готовят реагент дц количественный путем добавления 75 мкл реагента (см Таблицу материалов) , 15 мл коническую пробирку, а затем добавляют 15 мл буфера EB. Взболтайте трубки, а затем передать в пипетку бассейна. Защита от света реагент,
      5. С помощью многоканальной пипетки для передачи 50 мкл приготовленного реагента дцДНК количественного в каждую лунку планшеты для анализа. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Инкубируйте пластин при комнатной температуре в течение 5 мин в защищенном от света.
      6. Измеряют флуоресценцию каждого образца с использованием микропланшет-ридера и стандартные флуоресцеина длины волн (возбуждение 485 нм, излучение 520 нм, 0,1 сек).
      7. Вычитание значения флуоресценции реагента бланка из всех образцов. Генерация стандартной кривой из измерений флуоресценции образцов фага лямбда. Вычислить концентрацию каждого образца с использованием их соответствующего измерения флуоресценции и стандартной кривой.
  3. Клонирование НМВ суб-библиотек в векторы выбора
    1. Смешайте 100 нг каждого NNS подбиблиотеки продукта ПЦР на пять НМВ подбиблиотека групп. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью ДСДНК Количественное реагента.
      Примечание: Каждая группа состоит примерно из 53 позиций смежных аминокислот, расположенных вдоль последовательности TEM-1 (НМВ подбиблиотека группы 1 - 5 состоят из позиций 26 - 78, 79 - 132, 133 - 183, 184 - 236, и 237 - 290, соответственно; нумерация в соответствии с Ambler и др 19)..
    2. Создание клонировании векторов для каждой NNS подбиблиотека группы.
      1. Подготовьте пять 100 мкл МКП в соответствии с таблицей 6, с использованием праймеров AvrII_F и AatII_OP1_R - AatII_OP5_R, и плазмидами pBR322_OP1-5 в качестве матрицы (AatII_OP1_R сопряженным с pBR322_OP1 и т.д.).
      2. Переезд в Термоциклеры и запустить следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 25 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 ° С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1,5 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С. См T в состоянии материалов для последовательностей AatII_R и AvrII_F.
      3. Готовят гель 1% -ном агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
      4. Добавьте 20 мкл 6х геля красителем для каждого образца ПЦР. Загрузите первую полосу геля с лестницы ДНК; загружать весь объем каждого образца, пропуская по меньшей мере, одной скважины между образцами.
      5. Выполнить гель при 100 В в течение 50 мин.
      6. Визуализируйте гель с помощью УФ-осветитель длинноволновое (Предупреждение). Акцизные срезы, содержащие продукт ПЦР при температуре ~ 3500 пар оснований; передавать отдельные микроцентрифуге трубки. Гелевые срезы, можно хранить при температуре -20 ° C.
      7. Следуя инструкциям производителя, очищают образцы с использованием набора для экстракции из геля и мера концентрации с использованием реагента дц количественный.
    3. Для обоих подбиблиотека групп НМВ (шаг протокол 2.3.1) и клонированию векторов (этап протокола 2.3.2), установленных ограничение дайджесты с AatII и AvrII ферментами в соответствии с Т умелым 7. Инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 часа. Следуя инструкциям производителя, очистка образцов с использованием набора для очистки ДНК, а затем измеряют концентрацию с помощью дц количественно онции реагента.
    4. Настройка реакции лигирования следующей таблице 8 для каждого ограничения переваренной NNS подбиблиотека группы с родственными рестрикции-перевариваются клонировании вектор (NNS подбиблиотека 1 -й группы с pBR322_OP1 и т.д.). Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа. Очистка реакции с использованием набора для очистки ДНК в соответствии с инструкциями изготовителя; элюции ДНК с 20 мкл воды.
    5. Transform полноту очищенных реакций лигирования в библиотеку эффективных Е. палочки клетки с помощью электропорации.
      1. Оттепель Электрокомпетентные Е. клетки палочки , а затем поместить клетки и очищают реакции лигирования на льду.
      2. Передача 10 мкл оттаивают клеток к каждой очищенной реакции лигирования, а затем передать в кювету для электропорации. Электропорации 1,8 кВ.
      3. Восстановление клеток путем ресуспендирования в 1 мл рыдать. Инкубировать в течение 1 часа при 37 ° С.
      4. Ресуспендируют 10 мкл каждой культуры восстановления в 990 мкл LB; распространить 100 мкл на LB-чашки с агаром Containing 12 мкг / мл Tet. Инкубируйте пластины O / N (~ 16 ч) при 37 ° С.
      5. Для каждой культуры восстановления, подготовить культуры колбу 250 мл с 50 мл LB и 50 мкл Tet запаса. Перенести в колбу оставшиеся ~ 1 мл восстановления культуры. Выдержите O / N (~ 16 ч) при температуре 37 ° С при интенсивном помешивании (~ 200 оборотов в минуту).
    6. Подсчитать количество колоний на каждой пластине. Подсчитать количество успешных трансформантов как figure-protocol-13385 , где figure-protocol-13460 это количество колоний, figure-protocol-13553 является объем восстановления культуры (1000 мкл) и figure-protocol-13674 является объем культуры высевают восстановления (1 мкл).
      Примечание: Для того, чтобы обеспечить полный охват всех мутаций, как правило число успешных трансформантов должно быть ≥100 раз по сравнению число ожидаемых мутаций. Каждый NNS подбиблиотека имеет 53 позиции ~, так что ожидаемое количество мутаций составляет 53 × 32 позиции кодона / позиция ≈ 1,7 × 10 3; чтобы дать библиотека размер ≥100 раз (≥1.7 × 10 5) должны быть ≥170 колоний на каждой пластине.
    7. В соответствии с инструкциями производителя, выделения плазмидной ДНК из культур с использованием набора для очистки плазмиды и затем измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный. Смешайте 100 нг каждой плазмиды. Это создает окончательный целого белка библиотеки мутагенеза насыщения.

3. Выбор TEM-1 цельного белка Насыщенность мутагенеза Библиотека для антибиотикорезистентности

  1. Подготовка культуры предварительного отбора.
    1. Развести плазмиды, полученной на стадии протокола 2.3.7 до 0,5 нг / мкл в воде и переносят 20 мкл в микроцентрифужных трубки. Выполните преобразование, повторнотерпимого отношения к просрочен-, металлизированный и O / N роста, как описано выше на стадии протокола 2.3.5, за исключением передачи по 1 мкл культуры восстановления SOB до 999 мкл LB.
    2. Подсчитайте количество колоний. Для того, чтобы обеспечить полный охват всех мутаций должен быть ≥100 колонии, указывающие на ≥10 6 успешных трансформантов (100 × 263 × 32 позиции кодонов / положение ≈ 10 6).
    3. Измерьте концентрацию 50 мл O / N культуры.
      1. Подготовьте заготовку LB путем добавления 1 мл LB в спектрофотометре кювете. Мера OD600 на спектрофотометре.
      2. Развести O / N культуры в 10 раз путем ресуспендирования 100 мкл в 900 мкл LB. Измерьте OD600. Вычтите чтение OD600 заготовки и умножить на 10, чтобы дать OD600 от O / N культуры.
    4. Предварительно нагреть три колбах с культурой с шага протокола 1.1 в течение ~ 30 мин при 37 ° С. Развести O / N культуру OD600 = 0,1 и добавляют 1 мл в одну колбу (конечная OD600 = 0,001). Tего есть "предварительный отбор культуры".
    5. Выдержите "культуру предварительного отбора" при 37 ° С при интенсивном встряхивании (200 оборотов в минуту). Периодически контролировать рост путем измерения OD600, как на стадии протокола 3.1.3 (нет необходимости, чтобы разбавить культуру в 10 раз) до OD600 = 0,1 (~ 2,5 ч).
    6. Перенести 100 мл культуры предварительного отбора к двум 50 мл конические пробирки. Центрифуга при 4000 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Удалить большую часть надосадочной жидкости и объединить в единый 15 коническую трубку. Повторите центрифугирования и удалить все супернатант. Хранить при -20 ° C.
  2. Селекцией на устойчивость к ампициллину.
    1. В то время как культура предварительного выбора инкубирования, готовят 50 мг / мл маточного АМФ в воде путем растворения 0,5 г ампициллина натриевую в 10 мл воды. Стерилизуют с использованием фильтра и хранят 0,2 мкм при 4 ° С.
    2. Для остальных двух колб, добавляют Tet до конечной концентрации 12 мкг / мл и объемом предварительного отбора культуры, таких тха т окончательный OD600 = 0,001. К одной колбе, добавляют 1 мл Amp для конечной концентрации 50 мкг / мл - это "выбор культуры".
    3. Инкубируйте культур при температуре 37 ° С при интенсивном помешивании (200 оборотов в минуту). Мониторинг роста культуры, для которых не ампициллин не добавляли в предыдущем шаге, пока OD600 = 0,1 (~ 2,5 ч). В это время, также измеряют OD600 культуры селекции.
    4. Разделить OD600 культуры селекции в 0,1 и умножить на 100 мл. Передача этого объема (~ 400 мл) до 50 мл конические пробирки и центрифугируют при 4000 х г в течение 6 мин при температуре 4 ° С. Удалить большую часть надосадочной жидкости и объединить в единый 15 коническую трубку. Повторите центрифугирования и удалить все супернатант.
    5. В соответствии с инструкциями производителя, выделения плазмидной ДНК из предварительного отбора (этап протокола 3.1.6) и выбора (этап протокола 3.2.4) культуры клеток гранул, а затем измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный.
TLE "> 4. Высокая пропускная способность секвенирования Определить Фитнес влияние мутаций

  1. Подготовка проб для высокой пропускной последовательности
    1. Готовят 25 мкл в МКП де-мультиплексирование NNS подбиблиотека группы с ортогональным праймеров
      1. Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9; передать 23 мкл десяти ПЦР пробирки.
      2. Добавляют 1 мкл 0,5 нг мкл очищенной ДНК плазмиды / из культуры предварительного отбора ПЦР пробирки 1 - 5 и от культуры выбора для труб 6 - 10.
      3. Смешайте 50 мкл 50 мкМ вперед ортогональных праймеров OP1_F - OP5_F с соответствующей обратной ортогональные праймеров OP1_R - OP5_R. В том же порядке, передача 1 мкл в ПЦР - пробирки 1 - 5 и 6 - 10. См Таблица материалов для последовательностей OP1_F - OP5_F и OP1_R - OP5_R.
      4. Передача ПЦР пробирки в амплификатор. Выполните следующую программу: 98 ° C в течение 30 секунд; 20 циклов: 98 ° C в течение 10 сек, 55 °С в течение 20 сек, 72 ° С в течение 1,5 мин; 72 ° С в течение 2 мин; держать при температуре 4 ° С.
    2. Подготовить 25 мкл МКП для выделения каждой из подбиблиотека групп НМВ
      1. Развести в 100 раз десять с шага МКП протокола 4.1.1.4 путем передачи по 1 мкл каждого ПЦР для разделения трубок и добавления 99 мкл воды. Mix, затем пипеткой из 99 мкл и выбросить.
      2. Смешайте 50 мкл 50 мкМ праймеры Group1_F - Group5_F с соответствующим обратным праймерами Group1_R - Group5_R. В том же порядке, передача 1 мкл ПЦР пробирки 1 - 5 и 6 - 10. См Таблица материалов для последовательностей Group1_F - Group5_F и Group1_R - Group5_R.
      3. Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9, передать 23 мкл в каждую пробирку PCR. Передача ПЦР пробирки в амплификатор; запустить ту же программу, что и в шаге протокола 2.2.1.3.
    3. Провести финальные 25 мкл, чтобы добавить МКП индексации последовательностей
      1. дилютня в 100 раз десять с шага МКП протокола 4.1.2.3 путем передачи по 1 мкл каждого ПЦР для разделения трубок и добавления 99 мкл воды. Mix, затем пипеткой из 99 мкл и выбросить.
      2. Подготовка мастер смеси ПЦР в соответствии с таблицей 9, передать 23 мкл в каждую пробирку PCR.
      3. Для труб с шаблоном, происходящих из НМВ подбиблиотека групп 1-5, передать 0,5 мкл на пробирку прямых праймеров 501_F - 505_F соответственно. Для труб с шаблоном в результате предварительного отбора и селекции культур, переноса 0,5 мкл на пробирку обратного праймеров 701_R и 702_R соответственно. Таблицу материалов для последовательностей 501_F - 505_F и 701_R и 702_R.
      4. Передача ПЦР пробирки в амплификатор и запустить программу с шага 2.2.1.3.
    4. Смешайте и очистить образцы
      1. Концентрации Измерение с использованием реагента согласно дц количественный с инструкциями производителя. Смешайте 100 нг каждого продукта Int PCRоа сингл микроцентрифужных трубки.
      2. Готовят гель 2% -ном агарозном с 0,2 мкг / мл этидий-бромида (ВНИМАНИЕ).
      3. Добавить 6х гель красителем смешанному продуктов ПЦР образца. Загрузите первую полосу геля с лестницы ДНК; загружать весь объем образца.
      4. Выполнить гель при 100 В в течение 50 мин. Визуализируйте гель с помощью УФ-осветитель длинноволновое (Предупреждение). Акцизный срез, содержащий продукт ПЦР при ~ 360 пар оснований; передать в пробирке. ломтик Гель можно хранить при -20 ° С.
      5. Следуя инструкциям производителей, очищают образец с использованием набора для экстракции из геля и измеряют концентрацию с использованием реагента дц количественный. Это последний образец для высокой пропускной последовательности.
    5. Последовательность на секвенирования платформы с высокой пропускной способностью (см таблицу материалов для платформы , используемых в данном протоколе).
      1. Вычислить концентрацию образца в нМ, как figure-protocol-22085, Где figure-protocol-22158 концентрация образца в нг / мкл и figure-protocol-22261 длина последовательности ДНК образца (~ 360 п.н.). Разбавьте образец до 4 нМ в буфере EB.
      2. Следуйте инструкциям производителя для денатурации образца и разбавить до 9 часов в буфере для гибридизации.
      3. Нагрузка 600 мкл образца в картридже реагента. Последовательность в соответствии с инструкциями изготовителя и подсказкам на экране.
  2. Анализ данных секвенирования
    1. Скачать Flash (быстрый длина настройка коротких прочтений) 20, поместить в папку вместе с fastq.gz файлов , полученных в результате секвенирования.
    2. Используйте вспышку, чтобы присоединиться к fastq.gz файлы, соответствующие парного считывает для каждой пары индексов (вперед и назад считывает для каждой NNS подбиблиотека группы для предварительного отбора и селекции культур).
    3. Откройте командную строку и перейдите в папку на шаге протокола 4.2.1. Присоединяйтесь к каждой паре чтений с помощью команды: вспышки , где mates1.fastq.gz и mates2.fastq.gz являются файлы, содержащие в прямом и обратном читает, соответственно.
  3. После присоединения к каждой паре читает, поместите выходной файл out.extendedFrags.fastq в отдельные папки для результатов предварительного отбора или отбора культур. Переименовать выходной файл out.extendedFrags.fastq в соответствии с подбиблиотека группы NNS, которому оно соответствует (то есть., 1.fastq, 2.fastq и т.д.).
  4. Запуск вычислений NNS_DataAnalyzer.m скрипт (см символы дополнительного файла) из каждой папки для вычисления отсчетов для каждой мутации одной аминокислоты, а отсчеты для дикого типа, для каждого NNS подбиблиотека группы.
  5. Вычислить фитнес-эффект figure-protocol-24080 каждой мутации figure-protocol-24164 на каждой позиции figure-protocol-24261 как десятичное логарифму отношения отсчетов, полученных в отборе ( figure-protocol-24399 ) По сравнению с предварительного отбора ( figure-protocol-24513 ) Состояние, по сравнению с дикого типа:
    figure-protocol-24631 ,

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Карта плазмиды для пяти модифицированных плазмид pBR322 , содержащих ортогональные заливке сайты (pBR322_OP1 - pBR322_OP5) показана на рисунке 2А. Для того, чтобы проверить, является ли ортогональные Праймеры специфичны, ПЦР проводили с использованием каждой пары ортогона...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь протокол описан для проведения функциональной оценки целого белка библиотек мутагенеза насыщения, используя высокую пропускную способность технологии секвенирования. Важным аспектом способа является использование ортогональных праймеров во время процесса клонирования. Есл?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare they have no competing financial interests

Благодарности

R.R. acknowledges support from the National Institutes of Health (RO1EY018720-05), the Robert A. Welch Foundation (I-1366), and the Green Center for Systems Biology.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
TyptoneResearch Products Intl. Corp.T60060-1000.0
Yeast extractResearch Products Intl. Corp.Y20020-500.0
Sodium chlorideFisher ScientificBP358-212
Potassium chlorideSigma-AldrichP9333-500G
Magnesium sulfateSigma-AldrichM7506-500G
AgarFisher ScientificBP1423-500
Tetracycline hydrochlorideSigma-AldrichT7660-5G
Petri platesCorning351029
MATLAB Mathworkshttp://www.mathworks.com/products/matlab/
Oligonucleotide primersIntegrated DNA Technologieshttps://www.idtdna.com/pages/products/dna-rna/custom-dna-oligos25 nmol scale, standard desalting
pBR322_AvrIIavailable upon requestpBR322 plasmid modified to contain AvrII restriction site downstream of the TEM-1 gene
pBR322_OP1 – pBR322_OP5available upon requestfive modified pBR322 plasmids each containing a pair of orthogonal priming sites
Q5 high-fidelity DNA polymeraseNew England BiolabsM0491Lincludes 5x PCR buffer and PCR additive (GC enhancer)
15 ml conical tubeCorning430025
Multichannel pipettes (Eppendorf ResearchPlus)Eppendorf
PCR plate, 96 wellFisher Scientific14230232
96 well plate sealExcel ScientificF-96-100
Veriti 96-well thermal cyclerApplied Biosystems4375786
6x gel loading dyeNew England BiolabsB7024S
AgaroseResearch Products Intl. Corp.20090-500.0
Ethidium bromideBio-Rad161-0433
UV transilluminator (FOTO/Analyst ImageTech)Fotodyne Inc.http://www.fotodyne.com/content/ImageTech_gel_documentation
EB bufferQiagen19086
96-well black-walled, clear bottom assay platesCorning3651
Lambda phage DNANew England BiolabsN3011S
PicoGreen dsDNA reagentInvitrogenP7581dsDNA quantitation reagent, used in protocol step 2.2.4
Victor 3 V microplate readerPerkinElmer
DNA purification kitZymo ResearchD4003
Microcentrifuge tubesCorning3621
Long-wavelength UV illuminatorFisher ScientificFBUVLS-80
Agarose gel DNA extraction bufferZymo ResearchD4001-1-100
AatIINew England BiolabsR0117S
AvrIINew England BiolabsR0174L
T4 DNA ligaseNew England BiolabsM0202S
EVB100 electrocompetent E. coliAvidityEVB100
Electroporator (E. coli Pulser)Bio-Rad1652102
Electroporation cuvettesBio-Rad165-2089
Spectrophotometer (Ultrospec 3100 pro)Amersham Biosciences80211237
50 ml conical tubesCorning430828
Plasmid purification kitMacherey-Nagel740588.25
8 well PCR strip tubesAxygen321-10-551
Qubit dsDNA HS assay kitInvitrogenQ32854dsDNA quantitation reagent
Qubit assay tubesInvitrogenQ32856
Qubit fluorometerInvitrogenQ32866
Ampicillin sodium saltAkron Biotechnology50824296
MiSeq reagent kit v2 (500 cycles)IlluminaMS-102-2003
MiSeq desktop sequencerIlluminahttp://www.illumina.com/systems/miseq.htmlalternatively, one could sequence on Illumina HiSeq platform
FLASh softwareJohn Hopkins University - open sourcehttp://ccb.jhu.edu/software/FLASH/software to merge paired-end reads from next-generation sequencing data
AatII_FGATAATAATGGTTTCTTAGACG
TCAGGTGGC
AvrII_RCTTCACCTAGGTCCTTTTAAAT
TAAAAATGAAG
AvrII_FCTTCATTTTTAATTTAAAAGGA
CCTAGGTGAAG
AatII_OP1_RACCTGACGTCCGTATTTCAAC
TGTCCGGTCTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP2_RACCTGACGTCCGCTCACGGA
GTGTACTAATTAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP3_RACCTGACGTCGTACGTCTGA
ACTTGGGACTTAAGAAACCA
TTATTATCATGACATTAAC
AatII_OP4_RACCTGACGTCCCGTTCTCGAT
ACCAAGTGATAAGAAACCATT
ATTATCATGACATTAAC
AatII_OP5_RACCTGACGTCGTCCGTCGGA
GTAACAATCTTAAGAAACCAT
TATTATCATGACATTAAC
OP1_FGACCGGACAGTTGAAATACG
OP1_RCGACGTACAGGACAATTTCC
OP2_FATTAGTACACTCCGTGAGCG
OP2_RAGTATTAGGCGTCAAGGTCC
OP3_FAGTCCCAAGTTCAGACGTAC
OP3_RGAAAAGTCCCAATGAGTGCC
OP4_FTCACTTGGTATCGAGAACGG
OP4_RTATCACGGAAGGACTCAACG
OP5_FAGATTGTTACTCCGACGGAC
OP5_RTATAACAGGCTGCTGAGACC
Group1_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGC
ATTTTGCCTACCGGTTTTTGC
Group1_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
TTGCCCGGCGTCAAC
Group2_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNGA
ACGTTTTCCAATGATGAGCAC
Group2_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGT
CCTCCGATCGTTGTCAGAAG
Group3_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNAG
TAAGAGAATTATGCAGTGCTGCC
Group3_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTC
GCCAGTTAATAGTTTGCGC
Group4_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCC
AAACGACGAGCGTGACAC
Group4_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNGC
AATGATACCGCGAGACCC
Group5_FACACTCTTTCCCTACACGAC
GCTCTTCCGATCTNNNNNCG
GCTGGCTGGTTTATTGC
Group5_RGTGACTGGAGTTCAGACGTG
TGCTCTTCCGATCTNNNNNTAT
ATGAGTAAACTTGGTCTGACAG
501_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACTATAGCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
502_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACATAGAGGCACA
CTCTTTCCCTACACGAC
503_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACCCTATCCTACAC
TCTTTCCCTACACGAC
504_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACGGCTCTGAACA
CTCTTTCCCTACACGAC
505_FAATGATACGGCGACCACCGA
GATCTACACAGGCGAAGACA
CTCTTTCCCTACACGAC
701_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATCGAGTAATGTGACTG
GAGTTCAGACGTG
702_RCAAGCAGAAGACGGCATAC
GAGATTCTCCGGAGTGACTG
GAGTTCAGACGTG

Ссылки

  1. Hutchison, C. A. 3rd, et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
  2. Mullis, K. B., Faloona, F. A. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 155, 335-350 (1987).
  3. Papworth, C., Bauer, J. C., Braman, J., Wright, D. A. Site-directed mutagenesis in one day with >80% efficiency. Strategies. 9 (3), 3-4 (1996).
  4. Higuchi, R., Krummel, B., Saiki, R. K. A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 16 (15), 7351-7367 (1988).
  5. Rennell, D., Bouvier, S. E., Hardy, L. W., Poteete, A. R. Systematic mutation of bacteriophage T4 lysozyme. J Mol Biol. 222 (1), 67-88 (1991).
  6. Markiewicz, P., Kleina, L. G., Cruz, C., Ehret, S., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIV. Analysis of 4000 altered Escherichia coli lac repressors reveals essential and non-essential residues, as well as 'spacers' which do not require a specific sequence. J Mol Biol. 240 (5), 421-433 (1994).
  7. Kleina, L. G., Miller, J. H. Genetic studies of the lac repressor. XIII. Extensive amino acid replacements generated by the use of natural and synthetic nonsense suppressors. J Mol Biol. 212 (2), 295-318 (1990).
  8. Huang, W., Petrosino, J., Hirsch, M., Shenkin, P. S., Palzkill, T. Amino acid sequence determinants of beta-lactamase structure and activity. J Mol Biol. 258 (4), 688-703 (1996).
  9. Fowler, D. M., et al. High-resolution mapping of protein sequence-function relationships. Nat Methods. 7 (9), 741-746 (2010).
  10. Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. Experimental illumination of a fitness landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (19), 7896-7901 (2011).
  11. McLaughlin, R. N., Poelwijk, F. J., Raman, A., Gosal, W. S., Ranganathan, R. The spatial architecture of protein function and adaptation. Nature. 491 (7422), 138-142 (2012).
  12. Deng, Z., et al. Deep sequencing of systematic combinatorial libraries reveals beta-lactamase sequence constraints at high resolution. J Mol Biol. 424 (3-4), 150-167 (2012).
  13. Stiffler, M. A., Hekstra, D. R., Ranganathan, R. Evolvability as a Function of Purifying Selection in TEM-1 beta-Lactamase. Cell. 160 (5), 882-892 (2015).
  14. Matagne, A., Lamotte-Brasseur, J., Frere, J. M. Catalytic properties of class A beta-lactamases: efficiency and diversity. Biochem J. 330 (Pt2), 581-598 (1998).
  15. Salverda, M. L., De Visser, J. A., Barlow, M. Natural evolution of TEM-1 beta-lactamase: experimental reconstruction and clinical relevance. FEMS Microbiol Rev. 34 (6), 1015-1036 (2010).
  16. Weinreich, D. M., Delaney, N. F., Depristo, M. A., Hartl, D. L. Darwinian evolution can follow only very few mutational paths to fitter proteins. Science. 312 (5770), 111-114 (2006).
  17. Stewart, S. M., Fisher, M., Young, J. E., Lutz, W. Ampicillin levels in sputum, serum, and saliva. Thorax. 25 (3), 304-311 (1970).
  18. Giachetto, G., et al. Ampicillin and penicillin concentration in serum and pleural fluid of hospitalized children with community-acquired pneumonia. Pediatr Infect Dis J. 23 (7), 625-629 (2004).
  19. Ambler, R. P., et al. A standard numbering scheme for the class A beta-lactamases. Biochem J. 276 (Pt 1), 269-270 (1991).
  20. Magoc, T., Salzberg, S. L. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies). Bioinformatics. 27 (21), 2957-2963 (2011).
  21. Melamed, D., Young, D. L., Gamble, C. E., Miller, C. R., Fields, S. Deep mutational scanning of an RRM domain of the Saccharomyces cerevisiae poly(A)-binding protein. RNA. 19 (11), 1537-1551 (2013).
  22. Bank, C., Hietpas, R. T., Jensen, J. D., Bolon, D. N. A systematic survey of an intragenic epistatic landscape. Mol Biol Evol. 32 (1), 229-238 (2015).
  23. Dove, S. L., Joung, J. K., Hochschild, A. Activation of prokaryotic transcription through arbitrary protein-protein contacts. Nature. 386 (6625), 627-630 (1997).
  24. Romero, P. A., Tran, T. M., Abate, A. R. Dissecting enzyme function with microfluidic-based deep mutational scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (23), 7159-7164 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113TEM 1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены