JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Клетки , растущие в трехмерной (3-D) среды представляют собой значительное улучшение по сравнению с выращиванием клеток в 2-D средах (например, колбах или блюда). Здесь мы опишем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, культивируемых в условиях микрогравитации, представленной вращающейся стенки сосуда (RWV) биореакторах.

Аннотация

Поскольку клетки растут в трехмерной (3-D) среде имеют потенциал для преодоления многих пробелов культивирования клеток в 2-D средах (например., Колбах или блюда). На самом деле, широко признается, что клетки, выращенные в колбах или блюда, как правило, де-дифференцироваться и теряют специализированные особенности тканей, из которых они были получены. В настоящее время существует в основном два типа систем культивирования 3-D, где клетки высевают в каркасах, имитирующие нативную внеклеточного матрикса (ECM): (а) статические модели и модели (б) с использованием биореакторов. Первый прорыв был статические модели 3-D. 3-D модели, использующие биореакторы, такие как вращающейся стенки-сосуда (RWV) биореакторы являются более недавнее развитие. Первоначальная концепция RWV биореакторов была разработана в Космическом центре имени Джонсона НАСА в начале 1990-х годов и, как полагают, чтобы преодолеть ограничения статических моделей, таких как развитие гипоксических, некротических ядер. В RWV биореакторов может обойти тысявляется проблемой, обеспечивая гидродинамику, которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода. Эти биореакторы состоят из вращающей базы , которая служит для поддержки и вращения двух различных форматов культуры судов , которые отличаются по типу источника аэрации: (1) Slow Turning Боковые Сосуды (STLVs) с коаксиальным оксигенаторе в центре, или (2 ) Коэффициент сосудов высокого Aspect (HARVs) с оксигенации при помощи плоского, силиконового каучука газообмена мембраны. Эти суда позволяют эффективную передачу газа, избегая образования пузырьков и последующее турбулентность. Эти условия приводят к ламинарного потока и минимальным усилием сдвига, что модели пониженной гравитации (микрогравитации) внутри сосуда для культивирования. Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека, состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов, культивируемых в условиях микрогравитации, предоставленной RWV биореакторе. </ Р>

Введение

Первый прорыв в построении модели 3-D сообщалось в начале 1980 - х , когда ученые начали исследовать различные типы эшафоте (например., Ламинин, коллаген типа I, коллаген IV, и фибронектин) и коктейли факторов роста для улучшения от клетки к клетке и ECM взаимодействий "статических" 3-D модели 1-7. С тех пор, основная проблема с этими моделями были ограничения в передаче питательных веществ и кислорода внутри среды и тканевых конструкций 8. В отличие от клеток в окружающую среду в естественных условиях , которая получает постоянный поток питательных веществ и кислорода из окружающих сетей кровеносных сосудов, статическая природа этих моделей препятствует эффективному распределению их к клеткам. Например, клеточные агрегаты , образующиеся в статических моделях в пробирке , которые превышают размером в несколько миллиметров неизбежно будет развиваться гипоксические, некротические ядра 9. В RWV биореакторов может обойти эту проблемуобеспечивая гидродинамику , которые позволяют эффективно диффузию питательных веществ и кислорода 10-12. Тем не менее, на сегодняшний день работы с использованием RWV биореакторов были ограничены включением одного или двух типов клеток 13-17. К тому же, вместо пространственной ориентации, подобной нативных тканей, эти клетки образуются клеточные агрегаты. Основной причиной этих ограничений является отсутствие лески, способного включать клетки комплексно. Леса , используемые в RWV биореакторах на сегодняшний день состоят, с некоторыми исключениями 16-18, в основном из синтетических микросфер, трубчатых цилиндров или небольших листов 13-15,19-23. Эти жесткие материалы, состав и гибкость не может манипулировать, и к которым клетки прикрепляются к их поверхности. Таким образом, маловероятно , что эти модели будут обеспечивать систему , в которой , чтобы оценить, в интегрированной форме, различные клеточные компоненты , такие как стромальные клетки (например., Фибробласты, иммунные и эндотелиальные клетки) , что should быть рассредоточены в эшафот, чтобы точно имитировать ткани человека.

Здесь мы описываем развитие многоклеточного 3-D модели органотипического слизистой оболочки кишечника человека , состоящей из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов 24. Эти клетки культивировали в условиях микрогравитации, отданных RWV биореакторе 13,25-30. В нашем 3-D модели, ЕСМ обладает многими различными свойствами, такими как осмотическое давление , подобной культуральной среды (например., Незначительные диффузионные удерживающие устройства во время культивирования) и способностью включать клетки и другие соответствующие белки внеклеточного матрикса, а также как соответствующая жесткость для использования в биореакторах 24. Биологические системы очень сложны, и в течение последних нескольких лет наблюдается сдвиг в фокусе исследований через слизистую оболочку в направлении изучения клеточных взаимодействий с их окружением, а не изучать их в isolatioп. В частности, важность межклеточных взаимодействий в оказании влияния на выживание кишечника и дифференцировки клеток хорошо документирован 31-34. В частности, связь между эпителиальными клетками и их нишей оказывает глубокое влияние на расширение эпителиальных клеток и дифференцировки 35. В самом деле, широко признается, что не только от клетки к клетке, но и клетка-ECM взаимодействия имеют решающее значение для поддержания и дифференцировки эпителиальных клеток в моделях 3-D культуры. Предыдущие исследования показали , что кишка ECM белки , такие как коллаген I 24,36,37, ламинин 38 и фибронектин 39 играют важную роль в оказании влияния на эпителиальные клетки кишечника приобрести пространственную ориентацию , подобную нативной слизистую оболочку. Таким образом, разработка новых технологий, как наш 3-D модели 24, которая может имитировать требуется фенотипическое разнообразие кишечника , если исследователи намерены воссоздать сложную клеточную и структурную архитектуруи функции кишечника микросреды. Эти модели представляют собой важный инструмент в разработке и оценке новых препаратов и оральных вакцин-кандидатов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Заявление по этике: Все образцы крови были собраны у добровольцев , которые участвовали в номер протокола HP-00040025-1. Университет штата Мэриленд Совета по рассмотрению Institutional одобрил этот протокол и санкционировал сбор образцов крови от здоровых добровольцев для исследований, включенных в этой рукописи. Целью данного исследования было объяснено добровольцев, и все добровольцы дали информированное, подписанное согласие до взятия крови.

Примечание: смотри таблицу 1 для получения среднего дополнения. В таблице 2 при подготовке 3-D культуральной среды.

1. Подготовка судов культуры

  1. Отвинтить крышку заливной порта мл-сосуда 50 и залить 50 мл стерильной культуральной среды (например., RPMI). Выполните все процедуры в стерильных условиях в ламинарном шкафу.
  2. Замените крышку и вытрите пролитое среду на любой поверхности с 70% этанола.
  3. Дайте судну incubели в течение по крайней мере 15 мин до O / N при комнатной температуре.
  4. Используйте порт заливки, чтобы отбрасывать культуральной среды и добавляют 30 мл 3-D культуральной среды.
  5. Протрите пролитое среду на любой поверхности с 70% этанола.

2. Получение клеток

  1. Человеческой эпителиальной линии клеток (НСТ-8) 24,40.
    1. Культура клеток в среде RPMI с добавлением 100 ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 50 мкг / мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 10 мМ HEPES-буфера и 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС ) (приложение 1). При 70% сплошности, расщепленные клетки в соотношении 1: 5.
  2. Ободочной кишки человека фибробласты (CCD-18Co клетки) 24,41.
    1. Культура клеток в среде базального Орла , обогащенной добавки 1 В сплошности, расщепленные клетки в соотношении 1: 3..
  3. Человек пупочной вены (HUVEC) клетки 24,42.
    1. Культура клеток эндотелиальной базальной среды (EBM) среде , обогащенной 100 мкг / мл гепарина, 3 мкг / мл эндотелиальной Supplement клеточного роста (ECGS), и дополнения 1 при 70% сплошности, расщепленных клеток в соотношении 1: 2 . .
  4. Лимфоциты / Моноциты
    1. Изолировать мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) из крови путем центрифугирования в градиенте плотности с использованием стандартных методик 43.
      1. Если коротко, то с помощью 10 мл пипетки, осторожно добавляют 30 мл разбавленной крови (1: 1 в крови: забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР)) в 50 мл-коническую пробирку, содержащую 10 мл плотности центрифугирование сред. После стадии центрифугирования, лимфоциты и моноциты будет находиться в "белом" слое между плотностью центрифугирования сред и плазменных слоев.
      2. Возьмите белый слой с помощью пипетки передачи. Избегайте загрязнения гранулоцитов путем ограничения сбора плотности центрифугирования сред. После промывки 43, UРВМС себе как есть или криоконсервации в жидком N 2.
        Примечание: Важно подчеркнуть, что РВМС в основном состоит из лимфоцитов и моноцитов, с небольшой долей дендритных клеток и других типов клеток.
  5. Растут все клетки в стандартных условиях культивирования при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2.

3. Получение коллагеном внедренных клеток

  1. Определить количество вставок необходимости, исходя из числа экспериментальных условий, которые необходимо установить вверх-. Поместите необходимое количество вставок в лунки 6-луночного планшета.
  2. Приготовьте суспензию HUVEC и фибробластов:
    1. Промыть колб дважды в PBS и открепления клеток с помощью трипсина, 0,25% (1x) с 0,05% трипсин-тетранатриевый этилендиаминтетраацетат (трипсин-ЭДТА). Добавьте достаточное количество раствора трипсина, чтобы покрыть полноту площади поверхности клеточной культуры. Отрыв обычно происходит в течение 5 до 15 мин
    2. собиратьотдельные клетки в 50 мл-пробирку, содержащую 30 мл среды Игла в модификации Игла (DMEM) -30% ЭТС среды.
    3. Центрифуга трубки при 500g в течение 10 мин.
    4. Ресуспендируют клеток в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
    5. Подсчитать общее количество жизнеспособных клеток путем разбавления 20 мкл ресуспендировали клеток с 20 мкл трипанового синего красителя. Загрузите гемоцитометра со смесью клеток. Приемлемые МНПК будет белым ясно; нежизнеспособными РВМС приобретет краситель и станет синим.
      1. Ресуспендируют каждый тип клеток в среде DMEM-30% FBS среде при концентрации 5 - 8 х 10 7 кл мл - 1.
  3. Подготовка клеток, содержащих коллаген гели
    Примечание: Каждое судно потребует подготовки ~ 5 мл клеточной содержащих коллагеновый гель.
    1. В 50 мл-коническую трубку готовят смесь коллагена путем добавления 1 х DMEM средств массовой информации, дополненной 50 мкг / мл гентамицина, 2 мМ L-глутамина и 10% термически inactivatEd ФБС плюс 3 мг / мл бычьего коллагена I, 10 мкг / мл ламинин, 40 мкг / мл коллагена IV, 10 мкг мл фибронектина, 2 мкг / мл гепарин протеогликанов / сульфат и 15 мМ NaOH (для достижения физиологического рН).
    2. Закройте пробирку и взболтайте несколько раз до тех пор, пока смесь не будет полностью гомогенизируют. Избегайте образования пузырьков.
      ВАЖНО: Держите смесь на лед, чтобы предотвратить гелеобразования.
      1. Критический шаг: Если смесь развивается кислый вид (желтоватый цвет), добавьте несколько капель стерильного 1 N NaOH для нейтрализации смеси.
    3. Добавить концентрированный HUVEC и фибробластами при плотности 1,0 - 1,2 и 1,5 - 2,0 × 10 6 клеток / мл, соответственно , к обогащенной смеси коллагена (описанного выше). Закройте пробирки и взболтайте несколько раз, пока смесь не будет полностью гомогенизируют. Избегайте образования пузырьков. ВАЖНО: Держите смесь на лед, чтобы предотвратить гелеобразования.
    4. Добавить 4 - 5 мл клеточной содержащих коллагенгель для каждой вставки, предварительно загружаются в 6 луночного планшета, и позволили gelify в капот практически без движения в течение 1 часа.
    5. Через 1 ч передать 6-луночный планшет с 37 ° C, 5% CO 2 инкубаторе в течение 1 - 2 дополнительных часов.
    6. Вернуть 6-луночного планшета к капоту, и с помощью стерильного пинцета и скальпель асептических отсечение мембрану из вставки отсоединение клеток, содержащих гель из мембраны. Обрежьте отдельностоящий гель на небольшие квадраты (~ 5 х 5 мм).
    7. Добавьте небольшие клетки, содержащие квадраты в 50-мл HARV с использованием порта заполнения.
  4. Приготовьте суспензию HCT 8-эпителиальных клеток:
    1. Вымойте колбы дважды в PBS и открепления клеток с помощью трипсина, 0,25% (1x) с обработкой трипсин-ЭДТА. Добавьте достаточное количество раствора трипсина, чтобы покрыть полноту площади поверхности клеточной культуры. Отрыв обычно происходит в течение от 10 до 15 мин.
    2. Собирают обособленные клетки в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
    3. ЦентробежнаяУГЭ DMEM-30% FBS среду, содержащую трубку при 500g в течение 10 мин.
    4. Ресуспендируют клеток в 30 мл DMEM-30% FBS среды.
    5. Подсчитать общее количество жизнеспособных клеток, как описано в 3.2.5.
    6. Ресуспендируют НСТ-8 эпителиальных клеток в среде DMEM-30% FBS среде при концентрации 10 7 клеток мл - 1.
    7. Добавить 1 мл концентрированного НСТ-8 эпителиальных клеток в 50-мл HARV с использованием порта заливки.
  5. Используя порт заливки, добавить дополнительную питательную среду 3-D до тех пор, пока судно почти полностью заполнен (~ 20 мл).
  6. Замените крышку и протрите губы заполняющего порта с 70% -ным этанолом.
  7. Поместите шприц в каждом шприцевой порту RWV: место в 5 мл-шприц, содержащий 3 - 4 мл 3-D культуральной среды в одном порту и 5 мл шприц пустой в другом порту.
  8. Удалите все видимые пузырьки, потянув в пустой шприц в то время как примерно такой же объем среды вводят через другой порт шприца.
  9. Поместите весиSELS в биореакторе, включите питание и установите скорость приблизительно от 13 до 14 оборотов в минуту.
    Примечание: критический шаг: Частота вращения может потребоваться скорректировать несколько раз во время эксперимента , чтобы поддерживать клетки орбитальные внутри сосуда, тем самым избегая контакта со стенками сосуда.
  10. Культуры клеток при 37 ° С, 5% СО 2 в условиях микрогравитации, предоставляемые RWV биореактора.
  11. Изменение культуральной среды через каждые 3 - 4 дня, заменяя примерно 30 мл свежего 3-D культуральной среды.
  12. После 4 -х дней (± 1 день), удалить сосуды из биореактора и добавить лимфоциты / моноциты к судам (2 х 10 7 / сосуд).
  13. Поместите сосуды обратно в биореакторе при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2 в течение еще ​​5 дней (± 1 день).
  14. После дополнительных 5 дней (9 -й день культуры), добавляют лимфоциты / моноциты к судам (2 х 10 7 / сосуд) и по- прежнему культур до 12 дополнительных дней.
  15. Изменение культуральной среды через каждые 3 - 4 дня, заменяя примерно 30 мл свежего 3-D культуральной среды.

4. Заготовка 3-D Культуры для гистологии

  1. С помощью пипетки урожая каждый маленький фрагмент гель, который теперь называется "строить" в шесть-луночного планшета, содержащую 10 мл 10% -ного буфера формалина. Оставьте в течение 3 ч при комнатной температуре или в течение 12 - 16 ч при температуре 4 ° С.
  2. Приготовьте обработки тканей и встраивание кассеты путем маркировки и добавление двух кусков пены биопсии прокладок в каждой кассете.
  3. Погружают кассеты в 10% формалине буфера.
  4. С помощью пинцета поместите с фиксированной конструкции между двумя подушках из пеноматериала.
  5. Погружают кассеты в 10% формалине буфера.
  6. Продолжить со стандартными процедурами для встраивания, секционирования и окрашивания 44.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Ранее мы разработали многоклеточного 3-D модели органотипической слизистой оболочки кишечника человека состоит из кишечной эпителиальной клеточной линии и первичных человеческих лимфоцитов, эндотелиальных клеток и фибробластов , культивируемых в условиях микро...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В этой рукописи мы опишем развитие биоинженерного модели слизистой оболочки кишечника человека , состоящего из типов клеток , включая кратные первичных человеческих лимфоцитов, фибробластов и эндотелиальных клеток, а также эпителиальным клеткам кишечника линии 24. В этом 3-D моде?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors declare that a US Non-Provisional Patent Application has been filed in the U.S.Patent and Trademark Office (Number: 13/360,539).

Благодарности

This work was supported, in part, by NIAID, NIH, DHHS federal research grants R01 AI036525 and U19 AI082655 (CCHI) to MBS and by NIH grant DK048373 to AF. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institute of Allergy And Infectious Diseases or the National Institutes of Health.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Quad Rotator/Independent Rotating Wall Vessel (RWV) bioreactor SyntheconRCCs-4DQFor up to 4 vessels. Models with more or less vessels are also available.
Disposable 50 ml-vesselSyntheconD-405Box with 4 vessels
HCT-8 epithelial cells ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblasts ATCCCRL-1459
Human Umbilical Vein Endothelial CellsATCCCRL-1730HUVEC
Fibroblast Growth Factor-Basic SigmaF0291bFGF
Stem Cell Factor SigmaS7901SCF
Hepatocyte Growth Factor SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolated from mouse Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Vascular Endothelial Growth Factor SigmaV7259VEGF
Leukemia Inhibitory Factor Santa Cruzsc-4377(LIF
AdenineSigmaA2786
InsulinSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Cholera ToxinSigmaC-8052
FibronectinBD354008Isolated from human plasma
apo-TransferrinSigmaT-1147
HeparinSigmaH3149
Heparan sulfate  proteoglycanSigmaH4777Isolated from basement membrane of mouse  Engelbreth-Holm-Swarm tumor
Collagen IVSigmaC5533Isolated from human placenta
Heat-inactivated fetal bovine serum Invitrogen10437-028
D-MEM, powderInvitrogen12800-017
10% formalin–PBS Fisher ScientificSF100-4
Bovine type I collagen InvitrogenA1064401
Trypsin-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070
Gentamicin Invitrogen15750-060
Penicillin/streptomincin Invitrogen15140-122
L-GlutamineInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Ham's F-12Invitrogen11765-054
Basal Medium EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endothelial Basal MediumLonzaCC-3156EBM-2
Endothelial cell growth supplementMillipore02-102ECGS

Ссылки

  1. Aumailley, M., Timpl, R. Attachment of cells to basement membrane collagen type IV. J Cell Biol. 103, 1569-1575 (1986).
  2. Buset, M., Winawer, S., Friedman, E. Defining conditions to promote the attachment of adult human colonic epithelial cells. In Vitro Cell Dev Biol. 23, 403-412 (1987).
  3. Fitzgerald, T. J., Repesh, L. A., Blanco, D. R., Miller, J. N. Attachment of Treponema pallidum to fibronectin, laminin, collagen IV, and collagen I, and blockage of attachment by immune rabbit IgG. Br J Vener Dis. 60, 357-363 (1984).
  4. Goetschy, J. F., Ulrich, G., Aunis, D., Ciesielski-Treska, J. Fibronectin and collagens modulate the proliferation and morphology of astroglial cells in culture. Int J Dev Neurosci. 5, 63-70 (1987).
  5. Paye, M., Lapiere, C. M. The lack of attachment of transformed embryonic lung epithelial cells to collagen I is corrected by fibronectin and FXIII. J Cell Sci. 86, 95-107 (1986).
  6. Pourreau-Schneider, N., et al. Estrogen response of MCF-7 cells grown on diverse substrates and in suspension culture: promotion of morphological heterogeneity, modulation of progestin receptor induction; cell-substrate interactions on collagen gels. J Steroid Biochem. 21, 763-771 (1984).
  7. Pratt, B. M., Harris, A. S., Morrow, J. S., Madri, J. A. Mechanisms of cytoskeletal regulation. Modulation of aortic endothelial cell spectrin by the extracellular matrix. Am J Pathol. 117, 349-354 (1984).
  8. Jessup, J. M., et al. Microgravity culture reduces apoptosis and increases the differentiation of a human colorectal carcinoma cell line. In vitro cellular & developmental biology - Animal. 36, 367-373 (2000).
  9. Sutherland, R. M., et al. Oxygenation and differentiation in multicellular spheroids of human colon carcinoma. Cancer Res. 46, 5320-5329 (1986).
  10. Unsworth, B. R., Lelkes, P. I. Growing tissues in microgravity. Nat Med. 4, 901-907 (1998).
  11. Zwezdaryk, K. J., Warner, J. A., Machado, H. L., Morris, C. A., Honerzu Bentrup, K. Rotating cell culture systems for human cell culture: human trophoblast cells as a model. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  12. Radtke, A. L., Herbst-Kralovetz, M. M. Culturing and Applications of Rotating Wall Vessel Bioreactor Derived 3D Epithelial Cell Models. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  13. Barrila, J., et al. Organotypic 3D cell culture models: using the rotating wall vessel to study host-pathogen interactions. Nat Rev Microbiol. 8, 791-801 (2010).
  14. Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes and infection / Institut Pasteur. 8, 1813-1825 (2006).
  15. Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infect Immun. 69, 7106-7120 (2001).
  16. Alcantara Warren, C., et al. Detection of epithelial-cell injury, and quantification of infection, in the HCT-8 organoid model of cryptosporidiosis. J Infect Dis. 198, 143-149 (2008).
  17. Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O'Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
  18. Lin, H. J., O'Shaughnessy, T. J., Kelly, J., Ma, W. Neural stem cell differentiation in a cell-collagen-bioreactor culture system. Brain Res. Dev Brain Res. 153, 163-173 (2004).
  19. He, L., et al. Increased proliferation and adhesion properties of human dental pulp stem cells in PLGA scaffolds via simulated microgravity. Intl Endo J. , (2015).
  20. Straub, T. M., et al. In vitro cell culture infectivity assay for human noroviruses. Emerg Infect Dis. 13, 396-403 (2007).
  21. Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Lack of norovirus replication and histo-blood group antigen expression in 3-dimensional intestinal epithelial cells. Emerg Infect Dis. 19, 431-438 (2013).
  22. Goodwin, T. J., Schroeder, W. F., Wolf, D. A., Moyer, M. P. Rotating-wall vessel coculture of small intestine as a prelude to tissue modeling: aspects of simulated microgravity. Proc Soc Exp Biol Med. 202, 181-192 (1993).
  23. Goodwin, T. J., Jessup, J. M., Wolf, D. A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels. In Vitro Cell Dev Biol. 28, 47-60 (1992).
  24. Salerno-Goncalves, R., Fasano, A., Sztein, M. B. Engineering of a multicellular organotypic model of the human intestinal mucosa. Gastroenterology. 141, 18-20 (2011).
  25. Hammond, T. G., Hammond, J. M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel. Am J Physiol Renal Physiol. 281, 12-25 (2001).
  26. Cherry, R. S., Papoutsakis, E. T. Physical mechanisms of cell damage in microcarrier cell culture bioreactors. Biotech and Bioeng. 32, 1001-1014 (1988).
  27. Bergmann, S., Steinert, M. From Single Cells to Engineered and Explanted Tissues: New Perspectives in Bacterial Infection Biology. Int Rev Cell Mol Biol. 319, 1-44 (2015).
  28. Xu, B., et al. Simulated microgravity affects ciprofloxacin susceptibility and expression of acrAB-tolC genes in E. coli ATCC25922. Int J Clin Exp Pathol. 8, 7945-7952 (2015).
  29. Han, C., Jiang, C., Yu, C., Shen, H. Differentiation of transforming growth factor beta1-induced mesenchymal stem cells into nucleus pulposus-like cells under simulated microgravity conditions. Cell Mol Biol (Noisy-le-Grand, France). 61, 50-55 (2015).
  30. Wang, C., et al. Microgravity activates p38 MAPK-C/EBPbeta pathway to regulate the expression of arginase and inflammatory cytokines in macrophages. Inflamm Res. 64, 303-311 (2015).
  31. Iliev, I. D., et al. Human intestinal epithelial cells promote the differentiation of tolerogenic dendritic cells. Gut. 58, 1481-1489 (2009).
  32. Kerneis, S., Bogdanova, A., Kraehenbuhl, J. P., Pringault, E. Conversion by Peyer's patch lymphocytes of human enterocytes into M cells that transport bacteria. Science. 277, 949-952 (1997).
  33. Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. , (2010).
  34. Lei, N. Y., et al. Intestinal subepithelial myofibroblasts support the growth of intestinal epithelial stem cells. PLoS One. 9, e84651(2014).
  35. Voog, J., Jones, D. L. Stem cells and the niche: a dynamic duo. Cell Stem Cell. 6, 103-115 (2010).
  36. Jabaji, Z., et al. Use of collagen gel as an alternative extracellular matrix for the in vitro and in vivo growth of murine small intestinal epithelium. Tissue Eng Part C Methods. 19, 961-969 (2013).
  37. Jabaji, Z., et al. Type I collagen as an extracellular matrix for the in vitro growth of human small intestinal epithelium. PLoS One. 9, e107814(2014).
  38. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, 2354-2368 (2014).
  39. Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Exp Biol Med. 239, Maywood, N.J. 1124-1134 (2014).
  40. Tompkins, W. A., Watrach, A. M., Schmale, J. D., Schultz, R. M., Harris, J. A. Cultural and antigenic properties of newly established cell strains derived from adenocarcinomas of the human colon and rectum. J Natl Cancer Inst. 52, 1101-1110 (1974).
  41. Hinterleitner, T. A., Saada, J. I., Berschneider, H. M., Powell, D. W., Valentich, J. D. IL-1 stimulates intestinal myofibroblast COX gene expression and augments activation of Cl- secretion in T84 cells. Am J Physiol. 271, 1262-1268 (1996).
  42. Hoshi, H., McKeehan, W. L. Brain- and liver cell-derived factors are required for growth of human endothelial cells in serum-free culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 81, 6413-6417 (1984).
  43. Salerno-Goncalves, R., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. Characterization of CD8(+) Effector T Cell Responses in Volunteers Immunized with Salmonella enterica. Serovar Typhi Strain Ty21a Typhoid Vaccine. J Immunol. 169, 2196-2203 (2002).
  44. Poggioli, T., Sarathchandra, P., Rosenthal, N., Santini, M. P. Intramyocardial cell delivery: observations in murine hearts. J Vis Exp. , e51064(2014).
  45. Eastburn, D. J., Mostov, K. E. Laying the foundation for epithelia: insights into polarized basement membrane deposition. EMBO Rep. 11, 329-330 (2010).
  46. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. a report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Altern Lab Anim. 33, 261-287 (2005).
  47. Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111, 1021-1046 (2014).
  48. Hartung, T., et al. Good Cell Culture Practice. ECVAM Good Cell Culture Practice Task Force Report 1. Altern Lab Anim. 30, 407-414 (2002).
  49. Blanchet, O., et al. Altered binding of regulatory factors to HLA class I enhancer sequence in human tumor cell lines lacking class I antigen expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 3488-3492 (1992).
  50. Palmisano, G. L., et al. HLA-E surface expression is independent of the availability of HLA class I signal sequence-derived peptides in human tumor cell lines. Hum Immunol. 66, 1-12 (2005).
  51. Ootani, A., et al. Sustained in vitro intestinal epithelial culture within a Wnt-dependent stem cell niche. Nat Med. 15, 701-706 (2009).
  52. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141, 1762-1772 (2011).
  53. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459, 262-265 (2009).
  54. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunol. , (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

1133 DRWV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены