JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Прижизненные флуоресцентной микроскопии (IVFM) calvarium применяется в сочетании с генетическим животных моделей для изучения самонаведения и приживления гемопоэтических клеток в костном (БМ) ниши.

Аннотация

Все больше фактов указывает, что это нормальное кроветворение регулируется собственный microenvironmental подсказки в БМ, которые включают специализированные сотовой ниши, модулирует критических гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) функции1,2. Действительно более подробную картину гемопоэтических микроокружения теперь формируется, в котором endosteal и эндотелиальных ниши образуют функциональные единицы для регулирования обычных HSC и их потомства3,4,5 . Новые исследования показали важность периваскулярной клеток, адипоциты и нейрональные клетки в сохранении и регулировании HSC функции6,,78. Кроме того есть свидетельства того, что клетки от различных линий, т.е. миелоидного и лимфоидных клеток, дома и проживают в конкретных нишах в BM микроокружения. Однако полное картирование BM микроокружения и его обитатели все еще продолжается.

Трансгенные мыши штаммов, выражая линии конкретных флуоресцентные маркеры или мышей, генетически не хватает отдельных молекул в определенные ячейки BM нишу теперь доступны. Нокаут- и линии отслеживания модели, в сочетании с подходами, трансплантация, предоставляют возможность уточнить знания о роли конкретных «нишу» клетки для определенных гемопоэтических населения, например HSC, B-клетки, Т-клетки, миелоидных клеток и эритроидных клеток. Эта стратегия может быть далее потенцированные путем слияния использование двух Фотон микроскопии calvarium. Предоставляя в vivo изображений высокого разрешения и 3-D визуализации BM calvarium, мы теперь местоположение можно определить точно где конкретных подмножеств гемопоэтических дома в BM и оценить кинетику их расширения с течением времени. Здесь Lys-GFP трансгенных мышей (маркировка миелоидных клеток)9 и RBPJ нокаут-мышей (без канонических Notch сигнализации)10 используются в сочетании с IVFM для определения приживления миелоидных клеток к вырезка дефектных BM микроокружения.

Введение

Прижизненные multiphoton флуоресцентной микроскопии (IVFM) – это мощный изображений метод, который позволяет с высоким разрешением в реальном времени визуализации тканей с глубиной до 1 мм, в зависимости от ткани. При применении к calvarium мыши, позволяет наблюдения за поведением гемопоэтических клеток в BM неинвазивным способом до 60-100 мкм11. Этот подход используется здесь для определения кинетика приживления нормальной миелоидного прародителями мышей нокаут-БМ RBPJ, не хватает канонические Notch сигнализации.

Последние работы из нашей группы продемонстрировали, что дефектных канонические Notch сигнализации в BM микроокружения приводит к болезни миелопролиферативных как12. Потеря Notch сигнализации был получен условного удаления ДНК привязки домена RBPJ, критических транскрипционный фактор, вниз по течению канонических выемки, сигнализации, используя Mx1-Cre индуцированной рекомбинации10. В этом исследовании была использована модель мышиаргона/lox Mx1-Cre/RBPJ. Условного удаления ДНК связывающих мотив RBPJ приводит к потере сигнализации от всех Notch рецепторов. В модели Mx1-Cre, КРР, выражение управляется промоутер Mx1, активируется после отправления polyI:C, что приводит к индукции удаления целевых генов в клетки крови, а также стромальные компонентов нескольких органов, в том числе BM, селезенки и печени.

Mx1-Cre+/RBPJжидкий кислород/lox и мышейаргона/lox Mx1-Cre–/RBPJ индуцированных с polyI:C (расписка указано как RBPJKO и RBPJWT, соответственно) были смертельно облученных и пересадить с нормальной, дикого типа гемопоэтических клеток. Начиная с 4 недели после пересадки, RBPJKO получателей разработали значительное лейкоцитоза, следуют спленомегалия. Хотя RBPJKO мышей представил увеличение доли миелоидного прародителями БМ на неделе 8 после пересадки и позднее момента времени, анализ БМ на 4 и 6 недель не выявить различия в их содержание миелоидных клеток, по сравнению с контролем RBPJWT получателей. Это наблюдение, а также тот факт, что Mx1-Cre выражается в различных кроветворных органов, возникает вопрос, ли BM микроокружения имел непосредственное влияние на возбуждение миелопролиферативных фенотип.

Чтобы определить, является ли BM критическим местом первоначального развития болезни, IVFM мыши calvarium был использован в сочетании с BM трансплантации (БМТ), нокаут-модель RBPJ и линии, системы слежения. Трансгенных мышей, выражая EGFP под контролем конкретных лизоцима промоутер (Lys-GFP)9 были использованы для получения клеток донора, которые могут быть визуализированы в BM изображений после ТКМ. Лизоцим выражение для миелоидных клеток и Lys-GFP знаменует клетки от общей миелоидного progenitor (CMP) до зрелых гранулоцитов13.

IVFM BM в разное время точках продемонстрировали, что Lys-GFP клетки указаны аналогичным получателям БМ RBPJWT и RBPJKO, но расширена и быстрее прижившимися, в БМ RBPJKO получателей. Эта разница была резко на предшествующий момент времени (2 недели) и со временем (недели 4 и 6). Однако в этих более поздних точках времени, оценки гемопоэтических отсека в же получателю показал устойчивый рост числа миелоидных клеток, циркулирующих в PB и локализованы в селезенке RBPJKO мышей, показывающее увеличение производства клеток от БМ в кровоток. Анализ Lys-GFP клетки локализации в BM пересаженных мышей на 6 недель показали, что миелоидных клеток проживало дальше сосудистую в RBPJKO микроокружения чем в элементе управления.

Коллективно сочетание IVFM с этих конкретных животных моделей позволило получить информацию в динамике приживления миелоидных клеток в RBPJKO BM микроокружения. Экспериментальный дизайн и количественный подход, описанный здесь предлагается в качестве парадигмы, которые могут применяться для решения подобных вопросов. Например, может разрешить использование других клеток конкретных линии отслеживания модели, такие как RAG1-GFP14 или15 мышей Gata1-GFP, после поведение лимфоидной или эритроидные предшественники, соответственно, в BM.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

С разрешения животное уход и использовать Комитет по Индиана школы медицины университета были выполнены все процедуры, связанные с использованием животных. Обеспечить, чтобы придерживаться законодательства о животных экспериментов страны, где выполняется работа.

1. Подготовка Mx1CreRBPJ- / - получателей мышей

  1. Крест Mx1-Cre+ мышей с RBPJжидкий кислород/lox мышей10 для получения Mx1-Creположительные RBPJжидкий кислород/lox мышей12 и Mx1-Cre негативных RBPJжидкий кислород/lox однопометники для использования в качестве элементов управления. Проверьте генотипа, ПЦР10.
  2. Использовать 6-8 недели-старый Mx1Cre+/RBPJжидкий кислород/lox и Mx1Cre–/RBPJжидкий кислород/lox мышей для выполнения polyI:C индукции.
  3. Придать polyI:C 200 мкг и.п. в Cre+ и Cre– мышей. Дать один polyI:C инъекции через день в течение 3 дней первой недели. Дать один polyI:C инъекции второй недели, через 7 дней после предыдущей инъекции (четыре инъекции в общей сложности).
    1. Использовать RBPJKO (индуцированных Mx1Cre+/RBPJжидкий кислород/lox) и RBPJWT (индуцированных Mx1Cre–/RBPJжидкий кислород/lox) мышах как получатели 3 недели после последней инъекции polyI:C.
      Примечание: Рекомендуется использовать мышей, вызванных Пи: ПК 3 недели после инъекции. IFNα реакции, вызванные polyI:C вызывает значительные изменения в БМ, что приводит к расширению иммунофенотипических HSC и пониженной мощности зрелых прародителей в периферической крови16,17. Представление гемопоэтических подмножеств является нормализованный 3 недели после инъекции и мышей может использоваться без смешанные эффекты воспаления. Этот протокол индукции была оптимизирована для RBPJ. Если удаление различных генов, протокол индукции может варьироваться в зависимости от конструкции, и исключения должны быть проверены. Мы проверить ~ 100% удаление RBPJ региона между сайтами loxP по RT-PCR после всего четыре инъекции polyI:C.

2. Подготовка Lys-EGFP клеток костного мозга доноров для трансплантации

  1. Усыпить один Lys-EGFP мышь (диоксид углерода, следуют шейки матки дислокации) 1 или 2 h до пересадки.
  2. Брызг поверхность тела животного с 70% этиловом спирте.
  3. Используйте Ножницы хирургические сделать разрез кожи по обе ноги вокруг лодыжки и с Щипцы хирургические тронуться кожи и меха вместе, чтобы разоблачить чистой мышечной ткани.
  4. Используйте Ножницы хирургические для удаления столько мышц из ноги как можно скорее. Ножницами, вырезать кости (на коленного и голеностопного сустава) и очистить любые оставшиеся мышечной ткани от бедра и tibias с помощью губки марлей. Поместите кости (два бедра и два tibias) в 6-ну пластины, содержащие DMEM 10% FBS.
  5. Раздавить кости в ступке с 10 мл холодной 2 мм ЭДТА PBS и пипетки клеток костного мозга для приведения ячеек в одну ячейку подвеска. Кроме того промойте кости с 2 мм ЭДТА PBS 3 раза с каждой стороны 1 мл шприц.
  6. Фильтр клеток костного мозга в 15 мл пластиковых пробирок с помощью 70 мкм фильтром. Промойте фильтр с 2-3 мл ФСБ. Спиновые клетки вниз 10 мин на 460 x g, Ресуспензируйте клетки в 10 мл свежего DMEM 10% FBS.
  7. Подсчет клеток костного мозга на Горяева и регулировка концентрации 1,5 x 107 кл/мл в IMDM без сыворотки. Используйте 3 x 106 клеток на животное с объемом 200 мкл. Около 1/3 клетки всего BM являются миелоидных GFP + клеток. Оставьте клетки на льду до готовности для инъекций. Для определения экспрессия гена GFP в СУИМ9использовать 0,5 x 105 клеток.

3. костного мозга Lys-GFP клеток в RBPJKO мышей

  1. Ограничения получателей мышей в клетке пирог. Облучить мышей с смертельной дозой гамма-излучения (1200 Rad) на Cs 137 облучателя. Использовать протокол дозы Сплит: 900 заявках вечером следуют 300 заявках следующее утро (16 h друг от друга).
  2. Пересадка смертельно облученного получателей мышей RBPJWT и RBPJKO 5-6 часов после второй дозы радиации. Придать BM клетки заготавливаемым от Lys-EGFP мышей в концентрации 3 х 106 клеток / животных через инъекции Вену хвост (см. детали для уборки клеток в разделе 2).
  3. Изображение независимых когорты пересаженных мышей, IVFM в разное время точках: 24 h и недели 2, 4 и 6, как описано ниже (см. раздел 4 и 5 для в vivo imaging процедуры).

4. Хирургическая подготовка для прижизненной визуализации

  1. Стерилизуйте хирургические инструменты. Два хорошо щипцы (один прямой, один угловой), одна пара тонкой ножницы и одна пара Иглодержатели. Подготовка оперативного района с все материалы, необходимые для процедуры.
  2. Дать мыши IP инъекции коктейль кетамин анестезии (Ксилазина 2,5-5 мг/кг + acepromazine 1,0-2,5 мг/кг + кетамин 90-100 мг/кг) с помощью 26-28 G иглу шприца.  Животное будет контролироваться каждые 15 минут во время процедуры и анестезии будут дополняться при необходимости на ¼ первоначальная доза.
  3. Поместите курсор мыши на соответствующий тепловой источник (37 ° C грелку, животное, защищены от прямого контакта с грелка) и визуально контролировать частоту дыхания.
  4. Проверьте что рефлексы, используя палец щепотка ответ. Убедитесь, что животное находится полностью под наркозом, до начала каких-либо хирургических процедур.
  5. Использование 26-28 калибровочных иглой шприца дать мышей инъекции Вену хвост флуоресцентные сосудистой маркера (декстрана, 100 мкл раствора 20 мг/мл).
  6. Применять мазь глаз ветеринара для обоих глаз. Клип дорсальной поверхности головы животного с небольшой электрической машинки. Применение крема для 5 минут использования марлевых губки для удаления крема и затем промыть соленой удаления волос. Подготовьте чистую кожу головы с 70% алкоголя с помощью ватного тампона.
  7. Используйте тонкой щипцами и ножницы сделать небольшой срединной Кожный разрез (10-20 мм) на кожу головы, чтобы разоблачить подстилающей поверхности спинной черепа. Используйте 5-0 Хирургический Шелковый поставить два пребывания швы на коже на каждой стороне разреза, создавая лоскут подвергать calvarium для воображения.
  8. Поместите мышь на их обратно и погрузите подвергаются головы в блюдо дно стекла заполнены маслом микроскопа. Транспорт животных для визуализации номер mutiphoton.
  9. Поместите животное на микроскопа с calvarium позиционируется на стеклянную посуду выше цели и затем накрыть 37° C грелку (животное должно быть защищено от прямого контакта с теплом).

5. in Vivo высоким разрешением изображений Calvarium мыши

  1. Использовать систему Перевернутый конфокальный, модифицированные для multiphoton изображений (см. материалы таблицу). Инструкции производителя следующие настройки 2-Фотон лазер 830 нм, место 20 X W, NA 0,95 объектива микроскопа носа кусок и проверка выравнивания лазерного луча.
    Примечание: Вертикальном Микроскоп системы наиболее часто используются для этих исследований, однако Перевернутый multiphoton системы также могут быть использованы. В этом исследовании пользовательских разработана атравматической стереотаксического устройство было использовано. Хотя существует несколько коммерчески доступных стереотаксического устройств для систем вертикально микроскопа, существует не коммерчески доступных стереотаксического устройство для системы инвертированным микроскопом, направленных на обеспечение мыши черепа. Как альтернатива пользовательских стереотаксического устройство черепа может быть обеспечено в положение над задачей, используя различные методы ленты или клея для стабильности.
  2. Откройте изображение приобретение программного обеспечения. В параметрах «приобретение» группа проверить, если выбран один направленный режим сканирования. Установите скорость сканирования до 4 μs/пикселей, частота кадров до 512 x 512 пикселов и увеличить до 1,5. Выберите из списка доступных объективов для соответствия объектив, дислоцированные в Стволы пожарные 20 X W Na 0,95 цель.
  3. Доступ к «Краситель список» на панели «Изображения приобретения контроля» и выберите «Два фотона». Открыть окно «Свет путь & красителей» и выберите DM690-980 возбуждения DM. Откройте затвор лазера 2P, установив флажок в лазерный блок 2. В окне «Микроскоп контроллер» выберите RDM690 зеркало.
  4. Выберите «EPI лампа», выберите куб epi фильтр B/G и сосредоточиться цель на образец для визуализации кровоток и calvarium костного нишу, с использованием в качестве образца бифуркации центральной жилки (а) и коронарного шва (b) (рис. 2A).
  5. Собирайте изображения с помощью-descanned режим. Выберите три внешние датчики: detector1 ПЛТ для сбора сигнала ГСП коллагена (выбросов фильтр - 430/100 Нм), ХААСП detector2 собирать GFP сигнал (выбросов фильтр - 525/50) и Хаасп detector3 для сбора сигналов TRITC-декстрана (выбросов фильтр - 605/90 Нм).
    1. Выполнение визуализации со скоростью сканирования 4μs/пиксель с не усреднения для сведения к минимуму Фототоксичность. Собирайте изображения на постоянный лазерная мощности и детектор выгоды скорректирована использовать полный динамический диапазон детектора с минимальными насыщения.
    2. Соберите серию разделов через глубины ткани (60 x 1 мкм Z-стеки) из 6 регионов calvarium костного мозга. Используйте параметры Размер шага 1 мкм, zoom 1.5 и размер кадра: 512 x 512 пикселей (423 мкм x 423 мкм).
      Примечание: В целом общее время, необходимое для изображения одним нажатием-1-1,5 ч.

6. количественный анализ

  1. Выполните реконструкций количественный и 3D изображения, с помощью выделенного изображения 3D / 4D количественный и визуализации программного обеспечения в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов). Визуализируйте интерактивно Z-стеки в 3D, используя максимальная интенсивность проекции (ПМС), альфа смесь или теневой проекции объем визуализации алгоритмов.
  2. Сегмент GFP клеток с использованием «модуль сегментация месте объекта». Примените стека арифметические обработки (канал вычитание) для ликвидации ложных положительных количество клеток GFP (это устраняет сигнал костных клеток, отображение сильная флуоресценция в красный и зеленый каналы).
  3. Выполнение сегментации сосудистую и костной поверхности, используя модуль поверхности сегментации. При необходимости расчета расстояний клеток к любой из выше поверхности путем применения алгоритмов X-напряжение, под названием «расстояние места на поверхности».

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Когорты 2 RBPJKO и 2 RBPJWT получателей были отражаться в отдельных изображений сессии в разное время точках: 24 h и 2, 4 и 6 недель после пересадки BM Lys-GFP клеток (рабочий процесс проиллюстрирован на рисунке 1A).

В каждой мыши изображения бы?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот протокол описывает экспериментальный дизайн, оптимизированный для изучения кинетики приживления гемопоэтических клеток с флуоресцентными прижизненной микроскопии. В этом исследовании расширение клеток миелоидного progenitor в WT BM или в зазубрине сигнализации дефектных BM был отсле?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Визуализация была проведена в центре Индиана для биологических микроскопии в университете Индианы, режиссер доктор Кен Dunn. Стереотаксическая устройство является прототипом разработана и изготовлена, Марк Soonpaa, центр Уэллс педиатрических исследований. Эта работа была поддержана NIH/R01DK097837-09 (NC), NIH/R01HL068256-05 (NC), NIH/NIDDK1U54DK106846-01 (Размыкающих), MPN исследовательский фонд (NC) и CTSI совместных проектов IUSM/Нотр Дам (NC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ketamine cocktailIU School of MedicineKetamine 90-100 mg/kg, Xylazine 2.5-5.0 mg/kg, Acepromazine 1.0-2.5 mg/kg
TRITC dextranTdb ConsultancyTD150-100mgOther color dextran may be used.
Andis hair trimmerBraintree ScientificCLP-323 75
Gauze spongeMed Vet InternationalPK2244-ply, 2 x 2
Nair depilatory creamCommercial store
SalineMed Vet InternationalRXSAL-POD1LT0.9% Sodium Chloride poly bottle
Insulin syringeFisher Scientific14-826-7928 g, 1/2 cc
Fine ForcepsFine Science Tools00108-11, 00109-11straight forcep, angled forcep
ScissorFine Science Tools15018-10
Needle holderFine Science Tools12002-14
5-0 silk sutureFisher ScientificMV-682Other non-absorbable suture may be used
WillCo- glass bottom dishWillCoGWSt-5040
Optical microscope oilLeica
Stereotaxic stage insert IU School of MedicineCustom design
Olympus FV1000 confocal microscope system Olympus
Olympus XLUMPLFL 20XW, NA 0.95 objective Olympus
Small heating padCommercial storeZoo Med reptile heating pad
Imaris 8.1 imaging softwareBitplane3/4 D Image Visualization and Analysis software

Ссылки

  1. Carlesso, N., Cardoso, A. A. Stem cell regulatory niches and their role in normal and malignant hematopoiesis. Curr Opin Hematol. 17 (4), 281-286 (2010).
  2. Lo Celso, C., Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124 (PT 21), 3529-3535 (2011).
  3. Calvi, L. M., et al. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425 (6960), 841-846 (2003).
  4. Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  5. Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425 (6960), 836-841 (2003).
  6. Mendez-Ferrer, S., et al. Mesenchymal and haematopoietic stem cells form a unique bone marrow niche. Nature. 466 (7308), 829-834 (2010).
  7. Naveiras, O., et al. Bone-marrow adipocytes as negative regulators of the haematopoietic microenvironment. Nature. 460 (7252), 259-263 (2009).
  8. Scheiermann, C., et al. Adrenergic nerves govern circadian leukocyte recruitment to tissues. Immunity. 37 (2), 290-301 (2012).
  9. Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 716-726 (2000).
  10. Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol. 14 (6), 637-645 (2002).
  11. Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457 (7225), 92-96 (2009).
  12. Wang, L., et al. Notch-dependent repression of miR-155 in the bone marrow niche regulates hematopoiesis in an NF-kappaB-dependent manner. Cell Stem Cell. 15 (1), 51-65 (2014).
  13. Miyamoto, T., et al. Myeloid or lymphoid promiscuity as a critical step in hematopoietic lineage commitment. Dev Cell. 3 (1), 137-147 (2002).
  14. Luc, S., et al. Down Regulation of Mpl marks the transition to lymphoid-primed multipotent progenitors with gradual loss of granulocyte-monocyte potential. Blood. 111 (7), 3424-3434 (2008).
  15. Suzuki, M., Moriguchi, T., Ohneda, K., Yamamoto, M. Differential contribution of the Gata1 gene hematopoietic enhancer to erythroid differentiation. Mol Cell Biol. 29 (5), 1163-1175 (2009).
  16. Essers, M. A., et al. IFNalpha activates dormant haematopoietic stem cells in vivo. Nature. 458 (7240), 904-908 (2009).
  17. Pietras, E. M., et al. Re-entry into quiescence protects hematopoietic stem cells from the killing effect of chronic exposure to type I interferons. J Exp Med. 211 (2), 245-262 (2014).
  18. Scott, M. K., Akinduro, O., Lo Celso, C. In vivo 4-dimensional tracking of hematopoietic stem and progenitor cells in adult mouse calvarial bone marrow. J Vis Exp. (91), e51683(2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

121In vivoLineage

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены