In Vitro Проникновение ФИТЦ-нагруженных ферритинов через Rat гематоэнцефалический барьер: модель для изучения Поставка Nanoformulated Molecules

Резюме

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

Аннотация

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

Введение

Сопротивление центральной нервной системы (ЦНС) , заболевания (т.е.. Рак, эпилепсия, депрессия, шизофрения и ВИЧ-ассоциированные неврологические расстройства) к фармакологической терапии из - за различных различных механизмов, в том числе трудного проникание лекарственного средства через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) , ВВВ является границей, которая изолирует ткани мозга от веществ, циркулирующих в крови. В пределах этого барьера, слой мозга микрососудистых эндотелиальных клеток (BMECs), поддержанный перицитов и астроцитов endfeet, отвечает за высокой селективности ВВВ до тех водорастворимыми препаратами с молекулярной массой выше , чем 400 Да ^1. Другой механизм сопротивления , связанное с наркотиками связано с наличием на BMECs истече- наркотиков транспортеров (Р-гликопротеина и множественной лекарственной устойчивости белков), которые сотрудничают с целью уменьшения проникновения наркотиков в ЦНС и облегчить их выдавливание из мозга ^2.

В последнее десятилетие, Большое количество нанотехнологических подходов были разработаны для удовлетворения клинической и биологической проблемой доставки лекарств через ВВВ ^3-6. В этом контексте, ферритин наносферы (БНС) представляют собой совершенно инновационное и перспективное решение. FNn 12 нм сферы 24 самосборки ферритина (Fn) мономеров, которые расположены в полой сферической структуре 8 нм внутреннего диаметра. Ферритина субъединиц могут быть разобраны при кислом рН и вновь в моде памяти формы путем доведения рН до нейтральности, позволяя различные органические молекулы быть воплощен. Поэтому БНС представляют собой интересную модель для развития многофункциональной системы доставки лекарственных средств ^7,8. Кроме того, БНС может взаимодействовать с BMECs благодаря специфическим узнаванием рецептора трансферрина (TfR) 1, который экспрессируется на полостной мембране этих клеток ^9.

До сих пор, по- разному в пробирке моделей ГЭБ были разработаны в Ordeг выяснить транс-ВВВ проницаемость для различных препаратов, токсичность по отношению к ВВВ, или взаимодействия молекул с эффлюксных транспортеров. Действительно, эти модели считаются действительными в пробирке подходы для быстрого скрининга активных молекул , прежде чем приступить к исследованиям в естественных условиях. Эти модели состоят из одного эндотелиального слоя BMECs или совместно культивировали BMECs и астроцитов (реже перицитов), полученные от животных (крысы, мыши, свиньи и бычий) или клеточные линии человека ^10,11,12. Трансэндотелиальную Электрическое сопротивление (TEER) и кажущаяся проницаемость (P _{приложение)} трассеров с определенной молекулярной массой представляют собой две критические параметры, которые используются для определения качества модели в пробирке. Здесь мы описываем занятость в ВВВ модели в пробирке, основанный на совместной культуре крысы BMECs (RBMECs) и коры головного мозга крыс астроциты (Rcas) для изучения транс-ВВВ проникания ферритина наноклеток заключающую флуоресцеина isothiocyanate (FITC).

протокол

1. Создание модели ВВВ

Примечание: Для создания модели ВВВ мы предлагаем использовать коммерчески доступные первичные RBMECs и Rcas. Все шаги должны быть выполнены стерильными реагентами и расходными материалами, обрабатываются в ламинарном потоке.

1. Культура клеток
   1. Coat для культивирования клеток колбах с поли-L-лизин 100 мкг / мл (1 час при комнатной температуре) или фибронектина 50 мкг / мл (1 ч при 37 ° С), чтобы содействовать прикреплению RCAs или RBMECs, соответственно. Затем оттепели 1 х 10 ⁶ RCAs и 5 х 10 ⁵ RBMECs эндотелиальной клеточной среде, дополненной 5% фетальной бычьей сыворотки, 1% добавки роста эндотелиальных клеток и 1% пенициллина / стрептомицина (МЭСМ). Семенной RCAs в Т175 колбу в 20 мл МЭСМ и RBMECs в T75 колбу в 10 мл МЭСМ.
      Примечание: оттаивание и посевные проходы RCAs и RBMECs должны быть скорректированы, с точки зрения плотности клеток и времени в культуре, в зависимости от числа экспериментальных условий тестируемой с моделью ВВВ. начинающимиING с 1 ампуле 1 × 10 ⁶ RCAs и 1 флакон 5 × 10 ⁵ RBMECs, можно получить до 20 ВВВ-подшипниковых вкладышей.
   2. Поддерживать клетки при 37 ° С и 5% CO ₂ в увлажненной атмосфере в течение приблизительно 6 дней, примерно до 80% слияния для RCAs и более 90% сплошности для RBMECs. Отделить клеток с использованием раствора трипсина-ЭДТА (трипсина 1: 250) в течение 5 мин (1 мл трипсина для Т75 колбы и 2 мл для T175 колбы). Прекратить активности трипсина с МЭСМ (2: 1), клеточные суспензии центрифуге при 750 × г в течение 5 мин и ресуспендируют гранул в 60 мл МЭСМ.
   3. Разделить RBMECs на 3 Т175 колб и культуры в МЭСМ в течение еще 3-х дней перед посевом на вставки. Подсчитать общее количество живых Rcas, наблюдая клеточную суспензию разводят в соотношении 1: 1 трипановым синим под оптическим микроскопом в камере Бюркера.
2. Cell Посев на Вставки
   1. Рассматривать одну сторону Полиэтилентерефталат (ПЭТ) мембрана 6 многоскважинных transparлор вставки с поли-L-лизина, 100 мкг / мл, а с другой стороны с фибронектин 50 мкг / мл, чтобы позволить прикрепление RCAs и BMECs. Ручка вставок с помощью пинцета, чтобы избежать контакта с мембраной ПЭТ.
      1. Поместите вставки в 6-луночного планшета и добавляют в раствор фибронектина (не менее 500 мкл) в верхнюю камеру. После 1 часа инкубации при 37 ° С, удаления раствора фибронектина, принимают вкладыши Съезжаете с мульти-луночного планшета и поместить их вверх дном на дне 150 см ² чашки Петри, который используется здесь в качестве стерильного также выражена поддержка уже покрытые вставки.
      2. Осторожно добавьте 800 мкл поли-L-лизина на нижней стороне режущей пластины (как показано на рисунке 1А; упоминается как Rcas высева), и держать решение на вставках в течение 1 часа при комнатной температуре.
      3. Аспирируйте решение и пусть вставки высохнуть при комнатной температуре в течение 15-30 мин. Вставки теперь готовы к посева клеток, но также могут быть сохранены в нескольких луночный планшет для несколькихдней при температуре 4 ° С, прежде чем приступить к строительству ВВВ.
         Примечание: Не забудьте сохранить по крайней мере, 3 Вставки с износостойким покрытием свободного от клеток, которые будут использоваться в качестве контроля для проверки установления ВВВ путем FD40 измерения потоков.
   2. Семенной RCAs (35000 / см ²⁾ на нижней стороне вставки поли-L-лизин-покрытием, понижая 800 мкл клеточной суспензии на перевернутой вставку (Рис . 1А) Оставьте подвеску RCA на вставках в течение 4 ч при комнатной температуре, для того, чтобы обеспечить эффективное присоединение клеток к мембране.
   3. Аспирируйте остаточного раствора, размещения вставок в лунки , содержащие 2 мл SecM и поддерживать мульти-луночный планшет при 37 ° С и 5% CO ₂ в увлажненной атмосфере, изменяя МЭСМ каждые 2 дня.
   4. Через 3 дня, когда RCAs были покрыты нижней поверхностью вставки, семенные RBMECs на верхнюю сторону вставки, выполнив следующие действия:
      1. Отделить RBMECs от Т175 колбах и посчитайтеОбщее количество живых клеток, как сообщалось в пунктах 1.1.2 и 1.1.3.
      2. Семенной RBMECs (60000 / см ²⁾ на верхней поверхности пластины в МЭСМ (1000 мкл) (Фигура 1В), оставляя 3 вставок с астроцитов, которые будут использоваться в качестве фона Тир. Поместите мульти-луночный планшет в стандартных условиях культивирования. Поддерживать систему в культуре в течение по крайней мере 3-х дней, изменяя SecM во внутренней и нижней камерой через каждые 2 дня.

2. Проверка ВВВ

1. Измерение TEER
   1. На 3 - ^й день совместного культивирования, проверьте TEER путем вставки ВВВ-несущие вставки в соответствующую камеру (которая имеет крышку и где обе камеры и крышка содержат пару напряжения зондирования и токовых электродов), заполненный 4 мл МЭСМ. Подключение к эпителиальной ткани вольт / омметром.
   2. Вместе с измерениями Teer клеточных ВВВ-систем, запишите значения Teer из 3-х вставок, несущих Rcas-йпри будет вычитаться из значений, полученных с БББС. Умножить полученные значения Teer поверхностью вставки (4,2 см ^2), для того , чтобы выразить результаты в виде Ω х см ^2.
   3. С 3 - ^го дня совместного культивирования, измеряют TEER каждый день. Примечание: После того, как первоначальный период , когда TEER увеличивается, записанные значения должны оставаться стабильными в течение по крайней мере двух последовательных дней (обычно между 5 - ^й и 7 - ^й день совместного культивирования). В этот момент ВВВ готов к второй стадии валидации (раздел 2.2) и / или для экспериментов транс-ВВВ.
      Примечание: Процедура, описанная в разделе 2.1, могут быть выполнены на тех же самых БББ-систем, посвященных следующим экспериментам проницаемости (раздел 3). Эксплуатация в стерильных условиях.
2. Транс-ВВВ Поток FITC-декстран 40 (FD40)
   1. Измерьте поток FD40 от верхней до нижней палаты моделей ВВВ по сравнению с через 3 пустых вставок(См ноту раздел 1.2.1), в соответствии со следующими этапами:
      1. Добавляют 1 мг / мл FD40 (разведенный в МЭСМ) в верхний отсек БББС, и после того, как 1, 2 и 3 ч вывести 200 мкл SecM из нижней камеры и измеряют интенсивность флуоресценции с помощью спектрофлуориметра (X _Ex 488 нм, А _ЕМ 515 нм, щель 5).
      2. Получить значения для SecM фоне fluorescenceby измерения 500 мкл девственной среды с использованием тех же аналитических параметров. Вычтите МЭСМ фоновой флуоресценции от всех значений флуоресценции FD40.
      3. Определить количество проникшего FD40 путем сравнения наблюдаемых значений флуоресценции с калибровочной кривой , полученного с известной концентрацией (т.е.. 0,312, 0,625, 1,25, 2,5 мкг / мл) флуоресцентного индикатора , растворенного в 500 мкл МЭСМ.
      4. Вычислить кажущуюся коэффициент проницаемости (P) _{приложение} от средних значений потока в соответствии с:
         P = _{приложение} J / AC
         , Где J представляет поток молекулы (моли / сек), А площадь проникающая (см ²⁾ и С обозначает концентрацию молекулы в верхнем отделении (моли / см ^3).
         Примечание: Три или более ВВВ-системы, которые достигли подходящие значения Тир, должны быть исключительно посвящены этой процедуре проверки, и не должны быть использованы для следующих экспериментов проницаемости (раздел 3). Стерильность не является обязательным.

3. Транс-ВВВ Проникновение ФИТЦ-нагруженной ферритинов (БНС)

Примечание: вариант рекомбинантного человеческого ферритина (Fn), произведенный в кишечной палочки и собраны в наноклеток (БНС) для инкапсулирования различных флуоресцентных молекул, можно получить у NanoBioLab профессора Prosperi (Университет Милан-Бикокка, Италия). FNn загружаются с FITC, в соответствии с описанным ранее протоколом ¹³ и концентрации обоих Fn и загруженных молекул точно determinредактор

1. Транс-ВВВ Поток FITC и FITC-БНС
   1. Измерьте поток FITC-БНС от верхней до нижней палаты проверенных моделей ВВВ ( как правило , на 5 - ^й - 7 - ^й день совместного культивирования), по сравнению с свободного красителя после 7 и 24 ч инкубации, в соответствии с следующие шаги:
      1. Добавить ФИТЦ-БНС (50 мкг / мл БНС, 1,1 мкМ FITC) или равное количество свободного FITC в верхнюю часть камеры по меньшей мере 6 систем БББ для каждой композиции, для того, чтобы вывести 2 мл раствора SecM из нижней палаты по меньшей мере, 3 вкладыша после 7 часов, а из нижней палаты других 3-х вставок после 24 часов.
      2. Измерьте интенсивность флуоресценции 500 мкл собранных образцов спектрофлоуриметре (X _ех 488 нм, λ _ет 515 нм, щель 5).
      3. Получение фоновой флуоресценции SecM путем измерения 500 мкл среды с использованием тех же аналитических параметров. Вычтите фоновой флуоресценции МЭСМот всех FITC или FITC-БНС значений флуоресценции.
      4. Определить концентрацию FITC , прошедшая через мембрану или FITC-FNn путем сравнения полученных значений флуоресценции с двумя различными калибровочными кривыми , произведенных с известной концентрацией (т.е.. 6,87, 13,75, 27,5, 55 нм) или свободного nanoformulated красителя , растворенного в 500 мкл МЭСМ.
2. FITC-БНС Локализация в RBMECs
   1. Удалить МЭСМ из верхней камеры систем ВВВ, мыть вставки с PBS и фиксируют RBMECs по меньшей мере, двух вставок для каждой экспериментальной группы путем добавления 500 мкл параформальдегида (4% в фосфатный буфер солевом-PBS) в верхнем отсеке для 10 мин при комнатной температуре.
   2. Промыть Вставки три раза PBS для удаления остаточного количества формальдегида.
      Примечание: С этого момента, стерильность не нужно.
   3. Вырезать подходящие куски мембраны ПЭТ, и приступить к immunodecoration клеток в соответствии следующие шаги:
      1. PermeabiLize RBMECs с 0,1% Тритон Х-100 в PBS в течение 10 минут. Выполнение стадии блокирования в течение 1 ч при комнатной температуре с раствором, содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (BSA), 2% козьей сыворотки в PBS. Инкубируйте образцы с анти-фактора Виллебранда (ФВ) при разбавлении 1:20, в течение 2 ч при комнатной температуре.
      2. После промывания три раза PBS, подвергать клетки в течение 2 ч при комнатной температуре на 2% БСА, 2% -ный раствор сыворотки козьего, содержащий подходящее вторичное антитело на 1 с: 300 разбавления для того, чтобы выявить анти-VWR и DAPI в точке а 1: 1500 разбавления для обнаружения ядер.
   4. Установите части вставки на предметные стекла микроскопа с использованием antifade монтажа раствора (одна капля на фрагменте вставки), затем закройте образец с крышкой скольжения. Анализ с помощью конфокальной микроскопии с использованием масляного иммерсионного объектива при 40-кратном увеличении, 1.5 зумом и 1024 х 1024 пикселей.

Результаты

Во время создания модели ВВВ, прикрепление клеток и рост на вставках можно контролировать с помощью светового микроскопа, благодаря прозрачной природы ПЭТ-мембран. RCAs, высевали при плотности 35000 клеток / см ^2, присоединять эффективно к нижней стороне вставки посл...

Обсуждение

Метод в пробирке , описанный здесь представляет собой полезный подтвержденный подход к изучению доставки транс-ВВВ флуоресцентных молекул при nanoformulation с наночастицами. Здесь мы используем БНС, который представляет собой хороший кандидат для изучения транслокации молекул грузов ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Brain Microvascular Endothelial Cells	Innoprot	P10308	isolated from Sprague Dawley rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen
Cortical Astrocytes	Innoprot	P10202	isolated from 2 days rat brain tissue, cryopreserved at passage one and delivered frozen.
Endothelial Cell Medium kit	Innoprot	P60104	ECM (500 ml) and fetal bovin serum (25 ml), endothelial cell growth supplement (5 ml) and penicillin/streptomycin (5 ml). Warm in 37 °C water bath before use and protect from light
Trypsin-EDTA without Phenol Red	EuroClone	ECM0920D	Warm in 37 °C water bath before use
Fluorescein isothiocyanate-dextran 40,000	Sigma	FD40S	protect from light
paraformaldehyde	Sigma	158127	diluition in chemical hood
Dulbecco's phosphate buffer saline w/o Ca and Mg	EuroClone	ECB4004L
Triton X-100	Sigma	T8787
bovine serum albumin	Sigma	A7906
goat serum	EuroClone	ECS0200D
mouse monoclonal anti-Von Willebrand Factor	Dako	M0616
AlexaFluor 546-conjugated antibody against mouse IgGs	ThermoFischer Scientific	A-11003	protect from light
DAPI (4’ ,6-diamidino-2-phenylindole)	ThermoFischer Scientific	D1306	protect from light
ProLong Gold Antifade Mountant	ThermoFischer Scientific	P36934
Poly-L-lysine Hydrobromide	Sigma	P1274	the same solution can be used several times
fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141	the same solution can be used several times
Polyethylene terephthalate (PET) inserts	Falcon	F3090	Transparent Polyethylene terephthalate (PET) membranes; surface area: 4.2 cm2; pore size 0.4 µm/surface area
T75 Primo TC flask	EuroClone	ET7076
T175 Primo TC flask	EuroClone	ET7181
EVOM2 Epithelial Tissue Volt/Ohmmeter	World Precision Instruments Germany	EVOM2
Endohm- 24SNAP cup	World Precision Instruments Germany	ENDOHM-24SNAP
Light/fluorescence microscope with camera	Leica Microsystems	DM IL LED Fluo/ ICC50 W Camera Module	inverted microscope for live cells with camera
Confocal Microscope	Leica Microsystems	TCS SPE
Spectrofluorimeter	Jasco	FP-8000