JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает использование инерциальной микрофлюидики на основе стратегии буфер обмена для очистки микро / наночастиц сконструированные клетки с эффективным истощению несвязанных частиц.

Аннотация

Инженерные клетки с активным ингредиентом загруженным микро / наночастиц (NPS) становится все более популярным методом для повышения нативные терапевтические свойства, позволяют био визуализации и контроля клеточного фенотипа. Критическим еще недостаточно поставленный вопрос, является значительное количество частиц, которые остаются несвязанными после мечения клеток, которые не могут быть легко удалены с помощью обычного центрифугирования. Это приводит к увеличению био фонового изображения шума и могут придавать трансформирующие эффекты на соседние не-клеток-мишеней. В этом протоколе, мы представляем инерциальную микрофлюидики стратегию на основе буфера обмена называется, как Дин Flow фракционирования (DFF) эффективно отделить меченые клетки от свободных NPs в высокой пропускной способности способом. Разработанная спираль Микроприбор облегчает непрерывный сбор (> 90% восстановления клеток) очищенных клеток (THP-1 и МСК), взвешенных в новом буферном растворе, при достижении> 95% истощение несвязанного флуоресцентного красителя или красителя загружены NPs (SilВСА или PLGA). Этот одноступенчатый, размер на основе стратегии очистки кювет позволяет использовать пропускную способность обработки высокой клетки (10 6 клеток / мин) и является весьма полезным для очистки клеток большого объема микро / наночастиц инженерии клеток для достижения без помех клинического применения.

Введение

Инженерной клетки агентом загруженным микро / наночастиц (NPS) представляет собой простой, геномная интеграция свободной и универсальный метод для повышения способности биоимиджинга и увеличить / дополнить свои собственные лечебные свойства в регенеративной медицине. 1-3 Клеточные модификации достигается путем маркировки плазменной мембраны или цитоплазмы с избыточной концентрацией агента загружены NPs насытить сайты связывания. Тем не менее, основным недостатком этого метода является значительное количество несвязанных частиц , оставшихся в растворе после процессов маркировки клеток, которые потенциально могут посрамить точной идентификации частиц инженерии клеток или усложняют результаты лечения. 4,5 Кроме того, воздействие NPs содержащих преобразующей агенты (факторы роста, кортикостероиды и т.д.) , при слишком высокой концентрации может привести к цитотоксичности и неверно направленное воздействие может вызвать непредсказуемые последствия на нецелевые клетки. Даже частицы носители, содержащие OF "биосовместимые" материалы [например, поли (молочной и гликолевой кислоты), ПЛГА] может подстрекать сильнодействующие реакцию иммунных клеток при определенных условиях, а. 6 Это особенно рискованными у лиц с ослабленным иммунитетом (например, ревматоидный артрит) , которые потенциально задержки системный наночастицами зазор. 7 Таким образом, эффективное удаление свободных частиц до введения частиц инженерии клеток имеет большое значение , чтобы минимизировать профиль токсичности и уменьшить неверно направленное воздействие частиц агента загруженным в естественных условиях.

Обычные центрифугирование в градиенте часто используется, чтобы отделить сконструированные клетки от свободных частиц, но является трудоемким и работать в пакетном режиме. Кроме того, касательные напряжения , испытываемые клеток при высокоскоростном центрифугировании и составляющих градиента плотности среды может поставить под угрозу целостность клеток и / или повлиять на поведение клеток. 8 Микрофлюидикс является привлекательной альтернативой с SEVEral технологии разделения включая детерминированной бокового смещения (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 и acoustophoresis 12 , разработанная для разделения мелких частиц и буфера обмена приложений. Однако эти методы страдают от низкой пропускной способностью (1-10 мкл · мин - 1) и склонны к засорению проблем. Активные разделений, такие как диэлектрофореза на основе методов требуют также различия в собственных фенотипов dielectrophoretic клеток или дополнительных шагов маркировки клеток для достижения разделения. Более перспективный подход включает в себя инерциальную микрофлюидики - боковое перемещение частиц или клеток через упорядочивает сосредоточиться на различных позициях из - за доминирующих сил подъема (F L) при высоких числах Рейнольдса (Re) 13 Благодаря своим условиям высокого потока и превосходное разрешение размера. , она часто эксплуатировались размера на основе разделения клеток 14,15 и буферных приложений обмена. 16-18 Howeveг, обмен буфер производительность остается на низком уровне с ~10-30% загрязняющего раствора , как выделенные клетки обычно остаются близко к границе между первоначальным и новым буферных растворов. 16-18 Что еще более важно, распределение размеров клеток - мишеней должен быть похож на достижение точная инерциальная фокусировка и разделение от первоначального буферного раствора , который создает проблему , особенно при обработке гетерогенных размеров типов клеток , таких как мезенхимальных стволовых клеток (МСК). 19

Ранее мы разработали новый метод сортировки инерциальная микрофлюидики клеток называется Dean Flow фракционирования (DFF) для выделения циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) 20 и 21 бактерии из цельной крови с использованием 2-наливной, 2-выпускную спиральное устройство микроканальных. В этом видео-протокол, мы опишем процесс маркировки ТНР-1 (острый моноцитарный лейкоз линия клеток человека) суспензии моноцитов (~ 15 мкм) и ПКЦ (10-30 мкм) с кальцеиновой-лтины NPs, с последующим изготовлением и эксплуатацией спиральной микроустройство DFF для эффективного извлечения меченых клеток и удаления несвязанных NPs. 22 Эта одна стратегия стадия очистки обеспечивает непрерывное восстановление меченого подвески и прилипшие клетки суспендируют в свежей буферном растворе без центрифугирования. Кроме того, он может обрабатывать до 10 миллионов клеток · мл -1, плотность клеток , поддающихся для применения в регенеративной медицине.

протокол

1. Наночастицы (NPS) Маркировка мезенхимальных стволовых клеток и моноцитов

  1. Культура мезенхимальные стволовые клетки (МСК) в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и антибиотиков до ≥80% сплошности до маркировки. Точно так же, культура ТНР-1 клетки (ATCC) в Институте Roswell Park Memorial (RPMI) 1640 , дополненной 10% FBS до плотности ~ 10 6 клеток / мл.
  2. Нагрузка кремнезема NPs (~ 500 мкм) с раствором кальцеин красителя (200 мкМ) с использованием перемешивания в течение ночи. Изготовить PLGA-кальцеина AM (CAM) с использованием протокола , описанного ранее. 22
    1. Растворить 250 мкг кулачком и 100 мг PLGA (50:50) в хлороформе при температуре 4 ° С.
    2. Генерация одиночных NPS эмульсии с использованием высокоскоростного гомогенизатора (13600 XG, 60 сек) при комнатной температуре. Упаривают хлороформа в химической вытяжкой (≥3 ч) до сбора с помощью центрифугирования (3,400 мкг в течение 5 мин), мытья (двойные Distiзаполненными водой), сублимационной сушки и хранения в -20 ° C.
  3. Выдержите CAM-PLGA NPS (1 мг) или Кальцеин кремнеземные NPS (150 мкг) в 0,01% поли-L-лизина (ФАПЧ) при комнатной температуре в течение 15 - 20 мин.
  4. Центрифуга при 3,400 мкг в течение 5 мин для удаления избытка ФАПЧ супернатант до того NPS ресуспендирования в 1 мл соответствующей культуральной среды.
  5. Инкубируйте NPS с клетками (ПКЦ или ТНР-1, ~ 1 - 2 × 10 6 клеток в общей сложности) в течение приблизительно 24 ч (0,1 мг · мл -1 концентрации этикетирование).
  6. Диссоциируют и урожай меченых прилипших MSCs с использованием 2 мл 0,25% трипсина (5 мин, 37 ° C) и гасили 6 мл DMEM. Спин вниз клетки при (1000 XG, 4 мин) и ресуспендируют до концентрации 10 5 - 10 6 клеток / мл для микрожидком обработки. Использование меченых клеток ТНР-1 (10 5 - 10 6 кл / мл) непосредственно для очистки микрофлюидики.

2. Подготовка микрожидкостных устройств

  1. Изготовление устройств
    1. Изготовить микрожидкостных спиральное устройство (500 мкм (W) × 115 мкм (Н)) с полидиметилсилоксан (PDMS) из коммерческого набора , используя стандартные мягкие шаги литографии. 23
    2. Смешайте 30 г базового форполимера и 3 г отвердитель тщательно в взвешенную лодочку. Де-газ смесь в эксикаторе в течение 60 мин, чтобы удалить воздушные пузырьки.
    3. Поток смесь PDMS на мастер-формы, кремниевой пластины с узорной конструкции спирального канала тщательно к высоте ~ 5 - 10 мм.
    4. Де-газ смесь в эксикаторе в вакууме в течение 60 мин еще раз, чтобы удалить пузырьки воздуха. Повторите процесс, пока все пузырьки не будут устранены.
    5. Вылечить смесь PDMS в качестве C духовке 80 ° С в течение 2 ч, пока PDMS не установлен. Убедитесь, что пластина не перекошена в процессе отверждения, чтобы иметь постоянную высоту устройства.
    6. Вырежьте спиральное устройство PDMS с помощью скальпеля и тщательно очистить плиту PDMS от мастера формы.
    7. Трим края устройства с помощью скальпеля, чтобы обеспечить гладкую поверхность для склеивания.
    8. Удар два отверстия (1,5 мм) для входных отверстий и два отверстия (1,5 мм) для выходов на устройстве PDMS с помощью перфоратора биопсии 1,5 мм.
    9. Промыть устройство с изопропиловым спиртом (IPA), чтобы удалить любой мусор и высушить устройство в печи 80 ° С в течение 5 мин.
    10. Очистите нижнюю поверхность PDMS устройства (с особенностями канала), используя клейкую ленту.
    11. Чистая одна сторона предметного стекла (2 "3") с помощью липкой ленты.
    12. Осторожно поместите и подвергать очищенные поверхностей PDMS устройства и стекло в камере пылесоса плазмы и подвергать их вакуумом в течение 60 сек. Затем включите питание плазмы максимальное и понизить давление в камере, пока камера не станет розовым цветом.
      1. Защиту поверхности в воздушной плазмы в течение 60 сек. Плазмы создает реактивный вид на открытых поверхностях PDMS и стекла, которое обеспечивает плотное соединение при приведении в физикоаль контакт. Выключите питание плазмы и отпустите давление со стороны очистителя плазмы для извлечения слайд устройства и стекла.
    13. Бонду устройство PDMS и предметное стекло вместе, нажав плазменном открытые поверхности плотно и обеспечить, чтобы не было пузырей в ловушке между двумя поверхностями.
    14. Нагреть присоединенную прибор используя конфорку установленный при температуре 80 ° С в течение 2 ч, чтобы усилить соединение.
  2. Эксплуатация устройства
    1. Отрежьте два куска трубы (1,52 мм ОП) ~ 15 - 20 см для впускных шприцев и прикрепить шприц наконечник (калибр 23) на одном конце каждой трубки.
    2. Отрежьте два куска трубы (1,52 мм ОП) ~ 5 - 10 см для розеток и прикрепить к выходным отверстиям устройства PDMS.
    3. До образца хода, вручную простое устройство с помощью шприца, содержащего 70% этанола до тех пор, пока не вытечет из выпускной трубки. Разрешить сидячую этанола в течение 30 сек до 1 мин для стерилизации устройства.
    4. Загрузите 30 мл фильтруется(0,2 мкм пор) буферная оболочка (забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (БСА)) в 60 мл шприц и обеспечить шприц на шприцевой насос. Установите насос на правильные настройки (размер шприца: 60 ​​мл, Volume: 60 000 мкл).
      Примечание: Добавление BSA в PBS, чтобы свести к минимуму клетка-клетка связывания и неспецифического связывания между клетками и устройством PDMS.
    5. Нагрузка 3 мл меченых клеток в 3 мл шприца и закрепить шприц на отдельном шприцевой насос. Установите насос на правильные настройки (размер: Шприц 3 мл, Объём: 3000 мкл).
    6. Убедитесь, что пузырьки воздуха не попали в шприцы, чтобы обеспечить стабильный поток. Удалите любые воздушные пузырьки, осторожно выбрасывания несколько капель жидкости из сопла.
    7. Соедините кончики на входе шприца и трубки к шприцам, и вставьте их в соответствующие входы устройства (оболочки и на входе пробы). Убедитесь в том, что нет никаких пузырей вдоль трубки.
    8. Установите устройства на перевернутогое изд фазового контраста микроскопа для визуализации в режиме реального времени во время процесса сортировки клеток.
    9. Безопасные небольшой химический стакан отходов и две 15 мл пробирки близко к устройству на столике микроскопа с помощью клея.
    10. Поместите выпускной тюбинги в стакан отходов.
    11. Установите соотношение потока для образца в буфер оболочки до 1:10 и начать оба шприцевые насосы, чтобы инициировать процесс сортировки (Пример: 120 мкл / мин для образца шприца и 1200 мкл / мин для шприца оболочки; скорость потока канала ~ 0,38 м / сек ).
    12. Запуск устройства в течение 1,5 мин для скорости потока для стабилизации. Это может быть подтверждено наличием инерционно сфокусированных клеток вблизи канала внутренней стенки под ярко-поле с фазовым контрастом с помощью камеры высокоскоростной (~ 5000 - 10000 кадров в секунду (FPS), время экспозиции: 10-50 мксек).
    13. Установить выпускной тюбинги в разные пробирки для сбора элюентов из розетки клеток и выхода отходов.

Результаты

После мечения клетки с био визуализации агента загруженным NPs в течение ночи, меченые клетки (содержащие свободные частицы) собирают и очищают с помощью DFF спиральной микроустройство для удаления свободных NPS в одном процессе шаг (рисунок 1А). 2-впуск, 2-розетка ?...

Обсуждение

Технология очистки клеток ДФФ, описанные здесь обеспечивает быстрое и непрерывное разделение меченых клеток в высокой пропускной способности способом. Такой подход разделения идеально подходит для большого объема образца или высокой концентрации клеток в обработке образцов, и лучш?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего раскрывать.

Благодарности

Kind gift of THP-1 cells from Dr. Mark Chong and assistance in microfabrication from Dr. Yuejun Kang and Dr. Nishanth V. Menon (School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University) were greatly acknowledged. This project was funded by NTU-Northwestern Institute of Nanomedicine (Nanyang Technological University). H.W.H. was supported by Lee Kong Chian School of Medicine (LKCMedicine) postdoctoral fellowship.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)LonzaPT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Lonza12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)ATCCTIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediaLonza12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)Sigma-AldrichP8920
3 ml SyringeBD302113Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml SyringeBD309653Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)BiowestP6154-100GR
Calcein, AM (CAM)Life TechnologiesC1430
CalceinSigma-AldrichC0875
IsopropanolFisher Chemical#P/7507/17HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Lonza17-516Q/12
Plain Microscope SlidesFisher ScientificFIS#12-550D75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)Dow CorningSYLGARD® 184
Scotch tape3M2120070204418 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)Sigma-Aldrich748161Pore size 4 nm
Syringe TipJEC Technology701830223 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)Life Technologies25200-056
Tygon TubingSpectra-Teknik06419-010.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)Sigma-AldrichP2191
Equipment
Biopsy punchHarris Uni-Core69036-151.50 mm
DessicatorScienceware111/4 IN OD
High-speed CameraPhantom V9.1
Inverted phase-contrast microscope NikonEclipse Ti
Plasma cleanerHarrick PlasmaPDC-002
Syringe PumpChemyxCX Fusion 200

Ссылки

  1. Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
  2. Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
  3. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
  4. Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
  5. Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
  6. Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
  7. Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
  8. Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
  9. Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
  10. Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
  11. Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
  12. Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
  13. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
  14. Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
  15. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
  16. Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
  17. Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
  18. Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
  19. Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
  20. Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
  21. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
  22. Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
  23. Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
  24. Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
  25. Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

113Flow

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены