Внедрение системы инфекционного проницаемой мембраны Вставка на основе для изучения влияния секретируемых бактериальными токсинами на млекопитающих клеток-хозяев

Резюме

При этом способ с использованием проницаемой мембраны вставки на основе Инфицирование системы для изучения влияния стрептолизином S, секретируемого токсина , вырабатываемого стрептококк группы А, на кератиноциты описана. Эта система может быть легко применен к изучению других секретируемых бактериальных белков на различных типах клеток хозяина во время инфекции.

Аннотация

Многие патогенные бактерии выделяют токсины сильнодействующими, чтобы помочь в разрушении ткани хозяина, чтобы инициировать передачу сигналов изменения в клетках-хозяевах или манипулировать реакции иммунной системы во время инфекции. Хотя методы были разработаны , чтобы успешно очистить и производить многие из этих важных факторов вирулентности, есть еще много бактериальных токсинов , чья уникальная структура или обширные пост-трансляционные модификации делают их трудно очистить и учиться в системах в пробирке. Кроме того, даже когда чистый токсин может быть получен, существует много проблем, связанных с изучением специфических эффектов токсина в рамках соответствующих физиологических условиях. Большинство в пробирке моделей клеточных культур , предназначенных для оценки влияния секретируемых бактериальных токсинов на клетки - хозяева включают инкубирование клеток - хозяев с разовой дозой токсина. Такие методы плохо аппроксимировать, что клетки-хозяева на самом деле опыт во время инфекции, где токсин постоянно производимогоБактериальные клетки и давали возможность накапливать постепенно в течение инфекции. Этот протокол описывает конструкцию полупроницаемую мембрану вставки на основе системы бактериальной инфекции для изучения влияния стрептолизином S, мощного токсина , вырабатываемого стрептококк группы А, на эпителиальных кератиноцитов человека. Эта система более точно имитирует естественные физиологические среды во время инфекции, чем методы, где чистый токсин или бактериальные супернатанты, применяются непосредственно к клеткам-хозяевам. Важно отметить, что этот метод также устраняет смещение ответов-хозяев, которые из-за непосредственного контакта между бактериями и клетками-хозяевами. Эта система была использована для эффективной оценки воздействия стрептолизином S (SLS) на целостность мембраны хозяина, жизнеспособности клеток и клеточных реакций сигнализации. Этот метод может быть легко применен к изучению других секретируемых факторов вирулентности на различных типах клеток-хозяев млекопитающих исследовать специфическую роль секретируемого бактериального фактора Dйти во время хода инфекции.

Введение

Понимание функции бактериальных факторов вирулентности в контексте клетки-хозяина инфекции является одним из основных направлений исследований бактериального патогенеза. Многие патогенные бактерии активно выделяют токсины и другие растворимые факторы , чтобы помочь в разрушении ткани хозяина, чтобы инициировать передачу сигналов изменения в клетках - хозяевах или манипулировать реакции иммунной системы во время инфекции ^{1 - 10.} Хотя методы были разработаны , чтобы успешно очистить и производить многие из этих важных факторов вирулентности для изучения, некоторые бактериальные продукты имеют уникальные структуры или обширные пост-трансляционные модификации , которые делают их несговорчивых кандидатов методов очистки и , таким образом , не могут быть изучены в отрыве использования в системах пробирке , Например, стрептококк группы А, бактериальный патоген ответственность за несметного инфекций , начиная от фарингита до некротический фасциит и синдрома токсического шока, производит секретируетсябактериальный токсин , известный как стрептолизином S (SLS) ^{11 - 17.} Этот пептид ribosomally произведенный кодируется кластера Стрептолизин S , связанный ген (SAG) и зрелый продукт, по оценкам, 2,7 кДа в размере ^{14 - 17.} Протоксином, кодируемый Saga, модифицируется посттрансляционно несколькими ферментами (SagB, SagC и ПГД) для получения зрелой, функциональной форме ^{15 - 17.} Сложность этих посттрансляционных модификаций в сочетании с необычной последовательностью токсина аминокислоты оказали токсин , несовместимую со всеми очистки и структуры усилий выяснению, которые были предприняты попытки на сегодняшний день ^15,17. Эти проблемы имеют сложные усилия, чтобы определить конкретную роль этого токсина в принимающей патогенезе.

В тех случаях, когда препарат очищенных токсинов или других секретируемых факторов либо сложный или не представляется возможным, механизмы длявыяснить функции этих продуктов традиционно были изучены путем подготовки отфильтрованных бактериальных супернатантов, которые затем применяются к клеткам - хозяевам ^{18 - 20.} Есть несколько проблем, связанных с этой техникой. Во-первых, многие из этих секретируемых факторов, в том числе СЛС, не поддерживать максимальную или последовательную работу при хранении и применительно к клеткам-хозяевам, в более позднее время. Кроме того, когда супернатанты собирают в один момент времени, а затем применяется к клеткам-хозяевам, что трудно определить, физиологическое значение и сделать прямые выводы о естественном процессе инфицирования, где секретируемые факторы накапливаемых в процессе инфицирования до А физиологически соответствующая концентрация. Эта вторая проблема относится не только к использованию бактериальных надосадочных, но и к использованию очищенных токсинов в исследованиях клеток хозяина ^{1 - 3,8.} Для решения этих проблем, проницаемой мембраны InseИнфицирование системы RT на основе была разработана для оценки влияния СЛС на клетки-хозяева, таким образом, который обеспечивает оптимальную активность токсина, а также исключает переменную прямого контакта между бактериями и клетками-хозяевами. В этой системе, эпителиальные клетки человека выращивают в монослое в нижней камере две камеры хорошо, и бактерии, вводят в верхнюю камеру той же скважине. Пористую мембрану (0,4 мкм поры) разделяет верхнюю и нижнюю камеры, что позволяет секретируемые факторы для обмена между двумя камерами, но препятствует прохождению бактерий. Эта система позволила для эффективной оценки ответов хозяев , которые являются исключительно из - за устойчивых бактериальных секретируемых компонентов, устраняя любые реакции , которые могут произойти в результате прямого контакта во время группы стрептококковой инфекции. Хотя другие секретируемые бактериальные факторы, помимо СЛС также могут проходить через пористую мембрану, использование изогенного мутанта панели в том числе дикого типа (WT), создается СЛС-KNockout (ΔsagA) и Saga дополняется штамм (ΔsagA + Saga) позволяет точно оценить ответы хозяев, которые строго SLS-зависимые ^21.

Хотя аналогичные проницаемые системы мембранной вставки были использованы для изучения секретируемых факторов , участвующих в вирусных инфекций, биологии рака, и миграция ²² иммунных клеток ^{- 26,} несколько исследований с участием бактериальных взаимодействий с клетками - хозяевами использовали этот подход ^6,27,28. Даже исследования, которые использовали такие системы для изучения взаимодействия между бактериями и клетками-хозяевами были сосредоточены главным образом на миграцию воспалительных клеток или бактерий через эпителиальные или эндотелиальные монослоя гальванопокрытием на проницаемой мембраны вставки. Проницаемый система мембранной вставки на основе инфекция, описанная здесь, простой и эффективный метод, который основан на разделении бактерий и клеток-хозяев, через пористую мембрану для оценки EffeЦТС секретируемого токсина, СЛС, на целостность мембраны хозяина, жизнеспособности клеток, клеточной сигнальной трансдукции и секретируемых факторов клетки-хозяина. Эта техника может быть адаптирована к изучению других секретируемых факторов вирулентности на различных типах клеток-хозяев млекопитающих, чтобы исследовать роль конкретного бактериального фактора над течением инфекции.

протокол

1. Бактериальные культуры

1. Генерировать изогенных мутантные штаммы , которые будут использоваться для изучения специфического секретируемого фактора интереса ^21.
   Примечание: GASM1T1 5448 штаммы, используемые для этих экспериментов включали WT ГАЗ ', сага Δ кот SLS-дефицитных мутант (сокращенно в тексте как Д Saga) и Saga дополняется штамм (сокращенно в тексте как Д + Saga Saga) ^21.
2. Приготовьте овернайт жидкие культуры бактериальных штаммов, представляющих интерес. Grow газе M1T1 5448 штаммов в -10 мл Тодд Хьюитт-бульоне при температуре 37 ° С в течение 16-20 ч до инфицировать клетки человека.
3. Центрифуга ночной бактериальной культуры (2400 RCF в течение 10 мин) и ресуспендируют в свежей бактериальной среды.
   Примечание: в ресуспензии же объем, что в течение ночи культуры выращивали в (5-10 мл) обычно приводит к получению желаемого первоначальную оптическую плотность.
4. Нормализация бактериальных культурравные концентрации ачало не разбавляя ресуспендировали культур в дополнительной бактериальной среды до той же оптической плотности при 600 нм (OD ₆₀₀₎ получено для всех штаммов для тестирования (OD ₆₀₀ примерно 1,0 рекомендуется для удобства).
   Примечание: В этих исследованиях стационарная фаза бактериальные культуры использовали для инфицирования клеток-хозяев сразу после нормализации. Тем не менее, так как некоторые штаммы бактерий выхода стационарной фазы несинхронно может быть более целесообразно начинать хост инфекции с логарифмической фазой культур, если это будет признано в случае штаммов, представляющих интерес.
5. До дальнейшего анализа, провести подсчет колоний анализ для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) в миллилитре, присутствующих в исходном культурах так, что множественность инфекции (MOI), или отношение бактерий на клетку-хозяина, может быть определена.
   1. Подготовить 1 мл серийные разведения бактериальных культур, которые были нормированы к желаемому оптическому Densiти в фосфатно-солевом буфере (PBS) или соответствующей средой роста бактерий (Todd-Hewitt бульон был использован в этих исследованиях). Готовят разбавлении в диапазоне от 10 ^-1 до 10 ^-6 для получения по меньшей мере , один набор пластин агара со счетными колоний (30-300 колоний). Выполните все разведений в трех экземплярах.
   2. Перенести 100 мкл каждого серийного разведения на чашки с агаром, содержащую соответствующую среду для бактериальных видов анализируемой.
      Примечание: Todd-Hewitt агар используется в этих исследованиях.
   3. С помощью стеклянной или пластиковой бактериальный распорку, чтобы равномерно распределить 100 мкл аликвоты по всей поверхности чашки с агаром, и продолжать распространение, пока жидкость не впитается в агар. Выполнение под пламенем с использованием стерильной техники.
   4. Инкубируйте агаром при 37 ° С в течение ночи или до появляются счетные колоний.
   5. Подсчитывают колонии, которые растут на каждой пластине и вычислить КОЕ / мл в исходной культуре следующим Formuла: число колоний х обратного последовательного разбавления объема / культуры высевают в миллилитрах.
      например (200 колоний х 1/10 ^-5 разведение) / 0,1 мл высевали = 2,0 × 10 ⁸ КОЕ / мл

2. Хост клеточной культуры

1. Получить соответствующую линию клеток хозяина для желаемых анализов.
   Примечание: НаСаТ эпителиальные кератиноциты человека ^29, своего рода подарок от В. Nizet, были использованы для этих исследований.
   1. Поддержание клеток HaCat в 100 мм чашки для культивирования в модифицированной среде Дульбекко Игла (DMEM) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS). Инкубируют при 37 ° С с 5% CO _2.

3. клетка-хозяин Инфекция проницаемой мембраны Вставка системы

1. Пластина клеток в соответствующей ткани чашки для культивирования и позволяют им расти, пока не достигнет 90% слитности.
   Примечание: Клетки HaCat, используемые в этих исследованиях обычно достигают слитности в пределах 2-3 гAYS после посева.
   1. Для сбора лизата (например , сигнализации и анализа аденозинтрифосфата (АТФ) анализы , определения), плиты клетки HaCat в 6 - луночные планшеты при плотности посева около 3 × 10 ⁵ клеток / лунку.
   2. Для экспериментов с изображениями иммунофлюоресценции, клетки пластины на стерильные стеклянные покровные в течение 6 - луночные при плотности посева около 3 × 10 ⁵ клеток / лунку.
   3. Для этидия гомодимер мембраны пермеабилизации и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) высвобождения анализов, клетки пластины HaCat в 24 - луночные планшеты при плотности высева приблизительно 5 × 10 ⁴ клеток / лунку.
2. Непосредственно перед началом лечения, мыть клетки с 1x стерильной PBS.
3. Нанести свежую среду роста для клеток. Для условий, описанных здесь, применимы 2 мл среды на лунку в течение 6-луночные планшеты или 0,5 мл среды на лунку в течение 24-луночные планшеты. Если фармакологическое лечение проходят испытания, смешать со свежей средой и применять в течение этого STEп.
   Примечание: Некоторые анализы могут потребовать альтернативных средств массовой информации. Например, в качестве фенола концентрации красных и высоких сыворотке вли ни на анализ высвобождения ЛДГ, фенолового красного DMEM, дополненной 1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) (вес / объем), 2 мМ L-глутамина и 1 мМ пирувата натрия было используется для этих экспериментов.
4. После того, как был применен свежую среду, осторожно поместить стерильный 0,4 мкм мембраной, проницаемой вставки в каждую лунку. Выполните этот шаг в ламинарном потоке, а также использовать стерильного пинцета для передачи проницаемой мембраны вставки в каждую лунку.
5. Нанесите свежую среду для культивирования клеток в верхней палате каждую лунку в соответствии с инструкциями изготовителя. Для условий, описанных здесь, применяют 1 мл среды на лунку в течение 6-луночных планшетах или 0,1 мл среды на лунку в течение 24-луночные планшеты.
6. Применить соответствующий объем нормированных бактериальных культур (см раздел 1) в верхней палате проницаемой системы мембранной вставки. Использование бактериальной среды для неинфицированных Contrола лечения. Для получения результатов, описанных здесь, добавьте 25 мкл нормированных культур в камеру на 24-луночные планшеты и добавляют 100 мкл культур в камере в течение 6-луночные планшеты.
   Примечание: В этих исследованиях дикого типа или мутантный газ был применен к клеткам-хозяевам, при множественности заражения 10. МВД России была рассчитана на основе конечных чисел эукариотических клеток (например , 2 × 10 ⁶ клеток / лунку), таким образом, что в 10 раз больше бактерий , были добавлены в клетку - хозяина в начале периода инфекции (например , 2 х 10 ⁷ КОЕ на лунку). Соответствующая MOI будет меняться в зависимости от различных видов бактерий и с желаемыми последующих анализов.
   Примечание: В дополнение к использованию бактериальной среды для неинфицированных лиц контрольной группы, другие полезные элементы управления для некоторых применений этой методики могут включать убитых нагреванием бактерий или отработавшим бактериальной среды для сравнения.
7. Инкубируйте инфицированных клеток при температуре 37 ° С с 5% CO _2.

4. Сбор образцов

<ол>

Для сбора среды для культивирования клеток, клетки-хозяина лизатов или покровные стекла с интактными клетками для последующих анализов, начинают тщательно удаляя полупроницаемую мембрану вставку с стерильным пинцетом.

Для оценки секретируется хоста Protiens:

1. Собирают среды из нижней камеры в 1,5 мл пробирки. Избегайте нарушения монослой во время сбора.
2. Центрифуга образцов при 14000 RCF в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
3. Удалить все, кроме 50 мкл надосадочной жидкости в свежую 1,5 мл пробирку и хранят при -20 ° С или использовать немедленно.

Для оценки клетки-хозяина, Lystates:

1. Аккуратно аспирата среды над монослоем клеток-хозяев. Избегайте нарушения монослой, так как это может привести к потере образца.
2. Промойте клетки один раз с 1x PBS.
3. Аккуратно аспирата PBS. Сразу же применить соответствующий объем охлажденного льдом буфера для лизиса, чтобы достичь желаемой концентрации белка, и инкубациюобразцы на льду в течение 15 мин. Нанести между 200 мкл и 350 мкл буфера для лизиса на лунку каждого 6-луночного планшета для достижения концентрации белка от 0,5 до 1,5 мг / мл.
   Примечание: Буфер для лизиса, используемый в этих исследованиях была составлена ​​из деионизованной воды, 1% (об / об) Нонидет Р40 Замены, ингибитор фосфатазы коктейль, и ингибитор протеаз. Конкретные реагенты перечислены в разделе Материалы и оборудование.
4. Используйте клеточным скребком для открепления клеток от поверхности пластины каждую лунку и пипетку все содержимое каждой лунки в 1,5 мл пробирку.
5. Центрифуга образцов при 14000 RCF в течение 20 мин при 4 ° С.
6. Для оценки растворимых компонентов лизат, удалить супернатант в новую пробирку и хранить при -20 ° С или использовать немедленно.
7. Для оценки ядерных или других нерастворимых компонентов лизатов, оставляем за собой осадок и хранят при -20 ° С или использовать немедленно.

Для оценки иммунофлюоресценции изображений:

1. В видепират средних и мыть клетки в 1x холодной PBS.
2. Закрепить клетки в течение ночи в 4% параформальдегида (PFA) раствор в PBS (вес / объем).
   Примечание: В этих исследованиях 1 мл PFA добавляли в каждую лунку каждого 6-луночного планшета.

5. Предложенные применения

1. Хост трансдукции сигнала Анализ с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ и Вестерн-блоттинга
   1. Соберите лизатов клетки-хозяина, как описано в разделе 4.3.
   2. Определить концентрацию белка каждого лизата образца под воздействием бицинхониновой кислоты (BCA) анализа или эквивалентных с использованием белковых стандартов ^30.
   3. Нормализация концентрации белка между образцами до загрузки и запуска образцов на гель 4-15% полиакриламидном или соответствующего альтернативного ^31.
      1. Нормализация концентрации образца пипеткой одинаковое количество белка из каждого образца (например , 20 мкг) в новый 1,5 мл трубки и добавления переменных объемов буфера для лизиса (объем буфера = общий объем - объем выборкидобавлены) в каждую пробирку , чтобы получить общий объем (например , 50 мкл) и конечной концентрации белка эквивалент через образцах.
   4. Образцы Переложить в поливинилиденфторида (PVDF) мембрану (или эквивалент). Для получения результатов, описанных здесь, передавать образцы при 25 вольтах в течение 2 часов, прежде чем увеличить напряжение до 70 вольт в течение еще 45 мин. Использование буфера переноса, состоящий из 200 мМ Трис-основание, 1,5 М глицина и 20% метанола (об / об) в деионизированной воде.
   5. Блок мембраны в 5% БСА + 0,1% твин 20 в Трис-солевом буферном растворе (TBS). Отрегулируйте соответствующим образом, основываясь на рекомендациях производителя для антитела, которые будут использоваться.
   6. Инкубируйте мембран с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 ° С. Использование в рекомендованных производителем разбавления.
   7. Мытье мембран в течение 1,5 ч в TBS + 0,1% Tween 20; обновить буфер через каждые 10-15 мин.
   8. Инкубируйте с пероксидазой хрена (HRP) вторичного антитела в разведении 1: 5000 в течение 1,5 ч при комнатной TEMPERATЮр.
   9. Мытье мембран в течение 1,5 ч в TBS + 0,1% Tween 20; обновить буфер каждые 10 - 15 мин.
   10. Инкубируйте мембраны с реагентом для обнаружения хемилюминесценции до разработки на пленку в соответствии с инструкциями изготовителя. Другие методы обнаружения могут быть использованы по желанию.
2. Хост Cell Иммунофлуоресценции Окрашивание и обработка изображений
   1. Fix покровные содержащие клетки-хозяева, как описано в разделе 4.4.
   2. Удалить решение PFA и мыть покровные, содержащие Обработанные клетки два раза в PBS, аспирационных между стирок.
      Примечание: PFA является высокотоксичным и должны быть утилизированы надлежащим образом.
   3. Блок покровные в течение 2 ч при комнатной температуре в PBS с 1% (вес / об) нормальной козьей сыворотки, 2% (об / об) Тритона X-100, и 0,5% (об / об) твина 20.
   4. Вымойте покровные с PBS в течение 30 мин, освежающими буфер через каждые 10 мин.
   5. Инкубируйте покровные с первичным антителом при соотношении 1:50 (или в соответствии с рекомендациями производителя) в блокировании зольсоциологическое загрязнение в течение ночи при температуре 4 ° С.
   6. Вымойте покровные в течение 1,5 ч в PBS, освежающий буфер через каждые 30 мин.
   7. Инкубируйте покровные в течение 2 ч при комнатной температуре в вторичных антител (козьих антител против кроличьего IgG, AlexaFluor488 использовали для этих исследований), используя соотношение 1: 200, антитела к блокирующим раствором.
   8. Вымойте покровные в течение 1 часа, освежающими буфер каждые 20 мин.
   9. Применить желаемые пятна.
      Примечание: Эти исследования использованы DAPI (окрашивающий ядра) и родамина-фаллоидином (актина пятно) в соотношении 1: 1000 в блокирующем растворе.
   10. Инкубируйте покровные с ядерными и актина пятен в течение 30 мин при комнатной температуре.
   11. Промыть покровные в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, освежающими порцией буфера каждые 10 мин.
   12. Установите покровные на стеклянных пластинках с использованием монтажной среды.
   13. Разрешить покровные установить на слайдах на ночь перед герметизацией и обработки изображений. Для получения результатов, описанных здесь, собирать изображения на флуоресцентный микроскоп USIнг стандартной цели 20X. обрабатывать захваченные изображения Используйте ImageJ и визуализации микроскопа программного обеспечения.
3. Этидий гомодимере Анализ гибель клеток
   1. Отберите среду из каждой лунки и промыть клетки дважды стерильной PBS.
   2. Применить 4 мкМ этидий гомодимер-1 в PBS.
   3. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте.
   4. Определить уровень флуоресценции с помощью планшет-ридера установлен на 528 нм возбуждение и 617 нм эмиссии со значением отсечки 590 нм.
   5. Добавить 0,1% (вес / объем) сапонин в каждую лунку после начального чтения и позволить планшет инкубировали в течение еще 20 мин при комнатной температуре (с качанием) перед чтением Пластину во второй раз при тех же самых условиях.
   6. Определить процент мембран пермеабилизации индивидуально для каждой лунки путем деления первоначальной флуоресценции чтения (пост-обработка) с помощью второго флуоресценцию чтение (пост-сапонин).
4. АТФ Определение анализа
   1. Соберите лизатов, как описано в разделе 4.3 выше.
   2. Нормализуют уровень белка в лизатах с помощью анализа BCA или аналогичного ^30.
   3. Определение клеточных уровней АТФ с использованием люминесценции на основе набора определения АТФ или его эквивалент в соответствии с инструкциями изготовителя.
   4. Осуществить нормировку, обработанные значения соответствующим образцам неинфицированных контрольных.
5. Анализ выпуска ЛДГ
   1. После заражения, собирают супернатанты, как описано в разделе 4.3.
   2. Оценка высвобождения LDH с использованием набора для обнаружения цитотоксичности для высвобождения ЛДГ в соответствии с инструкциями изготовителя.

Результаты

Вставка на основе протокола Инфицирование системы проницаемая мембрана , разработанная для изучения секретируемых бактериальных факторов подробно на рисунке 1. Эта система основана на разделении бактерий и клеток - хозяев , через пористую мембрану для оценки влияния секретируемых бактериальных факторов, в данном случае , Стрептолизин S (СЛС), на ответах хозяева , такие как целостности узла мембраны, клеточной жизнеспособности, клеточной сигнальной трансдукции и секретируется факторов клеток - хозяев. на рисунке 2 представлен репрезентативные данные Вестерн - блоттинга , демонстрирующих , что эта система может быть использована для оценки изменений в активации контакта -независимый хост сигнальных белков. В частности, представительные данные показывают значительно повысить активацию р38 МАРК в присутствии штаммов ГАЗОВЫХ СЛС-продуцирующие. Эта система также может быть применен для визуализации эффектов, секретируемых бактериальных факторов на локализацию белка хозяина с помощью иммунофлуоресценции микроскопии (<сильный> Рисунок 3). Данные показывают , SLS-зависимой активации ключевого воспалительного медиатора ядерного фактора каппа В (NFκB), который транслоцирует из цитоплазмы в ядро , при активации ^21. Результаты на рисунках 2 и 3 , показывают , что оба SLS-зависимых воспалительных реакций передачи сигналов не требуют непосредственного контакта между бактериями и клетками - хозяевами. Как предыдущие эксперименты уже показали , SLS-зависимой р38 и активация NFκB в прямых моделях инфекции ^21, аналогичные уровни p38 или активации NFκB среди трех газовых напряжений в системе вставки на основе проницаемой мембраны указывало бы , что ответ требуется прямой контакт между бактерии и клетки - хозяева. Рисунок 4 показывает , что эта система инфекция может быть применена для оценки токсин-зависимые изменения в хост - цитотоксичности через этидий гомодимер и высвобождения ЛДГ анализов. Об этом свидетельствует значительное увеличение Iп как мембрана пермеабилизации и в освобождении ЛДГ из клеток-хозяев, подвергшихся воздействию ГАЗОВЫХ штаммов, содержащих SLS по сравнению с неинфицированных клеток или клеток, подвергшихся воздействию SLS-дефицитный штамм. Эти изменения в цитотоксичности не сразу, а значимые эффекты не очевидны до 12 ч после заражения в случае мембранной проницаемости и 16 ч в случае выпуска ЛДГ. Представительные данные иллюстрируют важность выбора соответствующих моментов времени и условий заражения для оценки этих ответов хозяина. В дополнение к возможности для оценки принимающих сигнализации изменений и цитотоксичности, вставка на основе Инфицирование системы проницаемая мембрана применима к изучению метаболических изменений , таких как точное определение уровней хозяина АТФ путем предотвращения бактериального заражения клеток хозяина лизатов (рис 5) , Эти данные показывают существенную потерю кератиноцитов АТФ в ответ на ГАЗ-инфекции на 16 часов после инфицирования, с повышенной АТФ потери яп наличие СЛС. Эти результаты согласуются с наблюдаемыми токсин-зависимой увеличение сигнализации стресс-реакции организма хозяина и цитотоксичности.

Рисунок 1: Схема проницаемой мембраны Вставка на основе Заражение системы Протокол для оценки влияния секретируемых Бактериальные факторов на человека клеток - хозяев кератиноциты высевают в нижнем отсеке и выращивают до 90% слияния.. Мембрана коллаген покрытием 0,4 мкм порами отделяет верхнюю и нижнюю камеры, и бактерии добавляются в верхнюю камеру проницаемой мембранной системы вставки на требуемый период инфекции. Супернатантах клеточных культур и клетки - хозяева могут быть собраны после периода инфицирования и используются для различных анализов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы увидеть увеличенную версиюэтой фигуры.

Рисунок 2:. Проницаемая мембрана Вставка на основе Заражение система может быть использована для хоста клеточного лизата анализа с помощью SDS-PAGE и Вестерн - блоттинга Представительные данные свидетельствуют о том, что СЛС усиливает активацию р38 МАРК пути в инфицированных кератиноцитов. (A) HaCaTs были заражены с газом в течение 7 ч через проницаемую систему инфекции мембранной вставки (при MOI = 10) и лизаты были оценены для активации р38. (B) Денситометрию из трех независимых Вестерн - блоттинга было проведено с целью количественной оценки относительной активации р38 в ответ на GAS'infection. Средние значения из трех биологических повторностях, показаны с ошибками, представляющими стандартное отклонение. Относительная активация р38 представлена ​​в виде / фосфорилированных общего уровня белка. Статистическую значимость определяли по сравнению снеинфицированных клеток. Общее значение р определялось ANOVA (р = 0,0063). Тесты Даннет были выполнены постфактум для сравнения каждое условие к соответствующему неинфицированных контроля означают. *, Р = 0,01-0,05; **, Р = 0,001-0,01; ***, Р = 0,0001-0,001; ****, Р <0,0001. Эта цифра была изменена с Флаэрти и др. 2015 ^21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 3: проницаемая мембранная Вставка на основе Инфекция Система позволяет Визуализация хоста Signaling Изменения иммунофлюоресценции микроскопией Представительные данные показывают , что Стрептолизин S усиливает провоспалительных сигнализацию через активацию NFκB. НаСаТ кератиноциты человека были заражены с газом на М OI 10 в течение 8 часов с использованием проницаемой Инфицирование системы мембранной вставки на основе. (А и Б) по ядерной локализации NFκB оценивали с помощью визуализации иммунофлюоресценции. Процент ядерных локализованных клеток рассчитывали путем подсчета числа клеток, в которых NFκB был транслоцированы из цитоплазмы в ядро ​​для данного поля и делением этого числа на общее число клеток на том же поле. Масштабные полоски показывают 100 мкм. (А) Среднее из трех повторностей биологических представлены для каждого состояния с ошибками , представляющими стандартное отклонение. Общее значение р определялось ANOVA; р <0,0001. Тесты Даннета были выполнены для сравнения каждое условие к соответствующему неинфицированному состояния управления. *, Р = 0,01-0,05; **, Р = 0,001-0,01; ***, Р = 0,0001-0,001; ****, Р <0,0001. Эта цифра была изменена с Флаэрти и др. , 2015 ^21./ftp_upload/54406/54406fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рис . 4: проницаемая мембранная Вставка на основе Инфекция Система позволяет определять бактериально-опосредованный Мембранная пермеабилизирующего и цитотоксичности в отсутствие прямого контакта между бактериями и клеток - хозяев Представительные данные свидетельствуют о том, что жизнеспособность кератиноцитов снижается в присутствии активного токсина СЛС , ГАЗ - индуцированный гибель клеток оценивали в клетках HaCaT в присутствии WT, СЛС-дефицитных или Saga дополнена GAS кератиноцитов подвергаются воздействию газа с использованием вставного на основе Инфицирование системы проницаемой мембраны в течение 8-16 ч при MOI 10. (. А) Жизнеспособность оценивали с помощью анализа этидий гомодимерной или (анализа высвобождения Б) ЛДГ. В обеих панелях, 3 повторноусложнению усредняются и Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Значение для каждой временной точки определяли с помощью дисперсионного анализа (А) 8 ч, p = 0.0241; 12 ч, р <0,0001 (В) 8 ч, р = 0,0287; 12 ч, р = 0,1977; 16 ч, р = 0,0031. Тесты Даннета были выполнены, чтобы сравнить средства от каждого условия для дикого типа инфекции на соответствующий момент времени. *, Р = 0,01-0,05; **, Р = 0,001-0,01; ***, Р = 0,0001-0,001; ****, Р <0,0001. Эта цифра была изменена с Флаэрти и др. 2015 ^21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: проницаемая мембрана Вставка на основе Заражение системы Позволяет для точного определения уровней АТФ хоста путем предотвращения BacTПерс Заражение Узел клеточных лизатов. Представительные данные демонстрируют SLS-зависимые потери АТФ во время группы стрептококковой инфекции. Клетки HaCaT были заражены с газом в течение 8-16 ч с использованием проницаемой Инфицирование системы мембранной вставки на основе. Технические повторностей (n = 3) , одного из представителей биологической повторности (2 × 10 ⁶ клеток на образец) , были усреднены для каждого условия, с ошибками , представляющими стандартное отклонение. Общие р-значения определялись ANOVA (12 ч, р <0,0001; 16 ч, р <0,0001). Тесты Даннета были выполнены, чтобы сравнить каждое условие дикого типа инфекции для соответствующей точки времени. *, Р = 0,01-0,05; **, Р = 0,001-0,01; ***, Р = 0,0001-0,001; ****, Р <0,0001. Эта цифра была изменена с Флаэрти и др. 2015 ^21. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь описан способ с использованием проницаемой мембраны вставки на основе Инфицирование системы для изучения влияния бактериального токсина Стрептолизин S на эпителиальных кератиноцитов человека в системе в пробирке. Этот протокол может быть адаптирован для изучения других секретируемых бактериальных вирулентных факторов, а также альтернативные типы клеток хозяина. Недавно разработанная система предоставляет несколько преимуществ по сравнению с экспериментальными методами , которые используют очищенные токсины или фильтруются бактериальные супернатанты ^{1 - 3,8,18 - 20.} Система мембранной вставки на основе проницаемой обеспечивает посто нным дозу соответствующего бактериального токсина к клеткам-хозяевам, как он производится, что позволяет максимальная активность токсина, чтобы поддерживать, а также повышает согласованность между экспериментами. Кроме того, эта система более точно имитирует физиологические условия, позволяя секретируемый фактор накапливать с течением времени, как инфекция прогрессирует и Elimiвизирной необходимость произвольно выбирать определенные концентрации токсина, чтобы применить к клеткам-хозяевам. Кроме того, эта система также будет обеспечивать средства для исследователей для оценки бактериального фактора интерес поступает ли к клеткам-хозяевам, в контакт-зависимым образом. Контакт-зависимость часто проходят через поколения изогенных бактериальных мутантов, дефицитных в присоединении или посредством использования реагентов, которые предотвращают сцепление. Система, описанная здесь, обеспечит простую альтернативу в дополнение или вместо этих традиционных подходов.

В дополнение к тестируемых приложений, описанных в разделе 5 протокола, другие приложения, к которым эта система инфекция может быть легко адаптирована включать сбор образцов для цитокина массивов и анализов ELISA. В обоих этих случаях, аналогичный протокол, который описан для анализов высвобождения ЛДГ может следовать. Хотя это и не показано здесь, эта система использовалась, чтобы эффективно собирать образцы клетки хозяина, чтобы бытьnalyzed с помощью проточной цитометрии. В этом применении проницаемой вставки мембрана удаляется после периода инфицирования, клетки промывают для удаления клеточной культуральной среды, и трипсин применяется для обеспечения сбора клеток для анализа. Физическое разделение бактерий из клеток-хозяев, особенно полезно для такого применения, поскольку она помогает предотвратить образование крупных агрегатов, состоящих из прилипших бактерий и клеток-хозяев, которые могли бы в противном случае мешают точному подсчету клеток с помощью проточной цитометрии.

Хотя очень последовательные ответы хозяева наблюдались при сравнении результатов вставки на основе исследований инфекции проницаемой мембраны с традиционными исследованиями прямых инфекции, некоторые заметные различия в кинетике этих реакций хозяев наблюдались ^21. Например, изменения в передаче сигналов хоста и мембраны на основе цитотоксичности принимают на 30-50% больше происходить в вставки на основе модели инфекции проницаемой мембраны, чем коротвечать на прямые модели инфекции. Поскольку мембрана вставки на основе системы требует среды для нанесения на верхний и нижний отсеки каждой скважины, система, разработанная для исследований, описанных здесь требуется -ное увеличение общего объема среды 30% в каждую лунку по сравнению с соответствующей прямой модели инфекции использовали ранее ^21. Эта разница в общем объеме среды, в сочетании с увеличением расстояния между бактериями и клетками-хозяевами, когда прямой контакт запрещен, вероятно, увеличивает время, необходимое для СЛС диффундировать через среду, чтобы достичь клеток-хозяев и вызывают наблюдаемые эффекты. Кроме того, проницаемой мембранная система вставки на основе устраняет многие факторы ГАЗ вирулентности, которые могут внести свой вклад в хозяйничать повреждения клеток; отсутствие этих дополнительных факторов в этой системе также может способствовать задержке смерти клетки - хозяина и начала принимающих сигнальных событий по сравнению с прямой инфекцией ^21. Эти факторы следует учитыватьпри проектировании экспериментов для оценки других секретируемых бактериальных компонентов.

Для того, чтобы определить наиболее значимые условия для тестирования эффектов секретируемых бактериальных факторов на клетки-хозяева, испытывая различные моменты времени для каждого применения вставки на основе системы инфекции проницаемой мембраны рекомендуется. Это важно учитывать при каких условиях конкретный фактор вирулентности интерес оптимально производится (например , логарифмической фазой, стационарная фаза, в ответ на определенные сигналы окружающей среды и т.д.) для того , чтобы успешно наблюдать за его последствия. В экспериментах , направленных на оценке изменений в принимающих сигнальных белков, что необходимо выбрать моменты времени , что позволило достаточно времени для СЛС , чтобы достичь клеток - хозяев и производить в достаточном количестве , чтобы вызвать сигнализацию изменения ^21. В то же время, оценка изменений хоста сигнализации нужно проводить до СЛС-индуцированной мембранной проницаемости, так как этот эффект Complicates сбор клеток хозяина лизатов для анализа. Гибель клеток , индуцированное SLS может быть оптимальным образом наблюдается как прямой и проницаемыми мембранами моделей вставных на основе инфекции через несколько часов после начала сообщенных сигнальных событий ^21. Кроме того, при выборе временных точек, представляющих интерес, также важно, чтобы гарантировать, что изучаемые бактерии не могут проникать через пористую вставку мембраны в течение периода исследования. Производство некоторых бактериальных компонентов в течение длительного периода может привести к нарушению целостности мембраны и обеспечивают прохождение бактерий в нижний отсек. Для того, чтобы определить, является ли потенциальная проблема в системе интерес, бактериальные штаммы, которые будут изучены могут быть применены к верхней камере мембранной системы вставки на основе проницаемой в диапазоне моментов времени. В каждый момент времени, вставка может быть тщательно удалены, и среда из нижней камеры может быть собрана и использована в стандартной колонии сохота анализ (смотри раздел 1.5). Если колонии не образуются из клеточной культуральной среды в нижней камере, вставка мембрана может считаться эффективно предотвратить поступление бактерий в момент времени, и бактериальной нагрузки тестируемой.

Другой экспериментальный дизайн компонент, который, вероятно, потребует оптимизации для эффективного анализа секретируемых бактериальных факторов является множественность инфекции (MOI). MOI относится к отношению бактериальных клеток на клетку-хозяина, и, следовательно, под влиянием клетки-хозяина сплошности в момент заражения и количеством бактериальных колониеобразующих единиц (КОЕ), примененной к клеткам. В этих исследованиях клеток кератиноцитов выращивают до 90% сплошности, что позволило эти клетки, чтобы сформировать сплоченную монослой с интактными плотных контактов. Вдумчивый рассмотрение физиологической организации клеток-хозяев, которые будут изучены, необходимо выбрать соответствующий слитности для экспериментов инфекции. После того, как approprIate количество клеток-хозяев на лунку определяется, подходящая бактериальная КОЕ может быть вычислена на основе от желаемого Mol. В исследованиях, описанных здесь, газ был применен к клеткам-хозяевам, при MOI из 10. Соответствующая MOI будет меняться в зависимости от различных бактерий и с желаемыми последующих анализов. Низкое начало MOI, как правило, более физиологически актуальны и позволяет бактериального фактора интерес накопить достаточно медленно, чтобы захватить тонкие изменения в передаче сигналов клетки-хозяина, прежде чем кардинальные изменения в жизнеспособности клеток хозяина очевидны. Высшие MOIS используются во многих исследованиях, оценивающих цитотоксичность, но этот эффект также может быть достигнут, начиная с низкой MOI и позволяя инфекции прогрессировать в течение более длительного периода времени. Важно, чтобы определить точное значение КОЕ следствию оптической плотности для всех штаммов бактерий, подлежащих испытанию, в качестве изогенных мутанты могут иметь измененную скорость роста по сравнению с бактериями дикого типа и, следовательно, может потребовать, чтобы более высокий или более низкий КОЕ быть добавлены в каждую лунку вобеспечить надлежащее сравнение реакции организма хозяина между штаммами. В тех случаях, когда изучаемые клетки-хозяева млекопитающих способны убить бактерии или ингибирования их роста, или если несинхронных рост между бактериальными штаммами подозревается, оно также может быть полезно проведение исследований с целью оценки окончательной бактериальной нагрузки в конце периода инфекции. Это может быть достигнуто путем сбора содержимого проницаемой вставки и выполнения подсчета анализа колоний, аналогичную описанной в разделе 1.5 процедуры.

Выбор соответствующего размера скважины для требуемого анализа также имеет важное значение для получения оптимальных результатов. Проницаемой мембраны вставки доступны в различных размерах, но наблюдались наиболее последовательные результаты для исследований, показанных здесь с использованием вставок, предназначенных для 24-луночного и 6 пластин культуры ткани. Эти размеры вставки относительно просты в обращении со стерильным пинцетом, и легкость манипуляций имеет решающее значение в PreventИнг нежелательный перенос бактерий из верхнего отсека в нижний отсек скважины. Для экспериментов с участием сбор лизатов клеток-хозяев, 6-луночные чашки обеспечивают соответствующее количество клеток на каждое условие для большинства анализов и достаточно велики, чтобы вместить скребки клеток для сбора проб. Для цитотоксичности , в котором клетки - хозяева остаются прилипший и помечены флуоресцентным или colorometric краситель , который может быть измерен на планшет - ридере (например , этидием анализ гомодимер, трипанового синего анализа), использование 24 - луночного планшета с соответствующими вставками является рекомендуемые. Для экспериментов , в которых среда для культивирования клеток , будут собраны и проанализированы (например , высвобождения ЛДГ, цитокин исследования) либо 24 скважины или планшеты с 6 лунками могут быть использованы, хотя мелкие скважины обычно обеспечивают достаточные объемы проб для этих анализов и свести к минимуму использование требуемых реагенты. В целом, метод является универсальным и может быть адаптирован по мере необходимости для подготовки SAMPLэс для многочисленных последующих приложений.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Todd-Hewitt broth	Acumedia	7161A	Use appropriate broth for bacterial species of interest.
BioSpectrometer	Eppendorf	basic model	Any UV-Vis spectrophotometer is suitable.
Petri Dishes	Fisher Scientific	FB0875713	Other brands are suitable.
Agar	Sigma	A1296-1kg	Other brands are suitable.
HaCaT human epithelial keratinocytes			Gift from lab of Victor Nizet.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	Life Technologies	11995-073	Use appropriate media for cell line of interest.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Biowest	S162H	Use appropriate media additives for cell line of interest.
10 cm tissue culture dishes	Nunc	150350	Other brands are suitable.
6 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7506	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
24 well tissue culture dishes	CytoOne	cc7682-7524	Other brands are suitable but need to be compatible with the Corning insert.
Glass coverslips	Fisherbrand	12-541-B	These must be autoclaved prior to use for cell plating.
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	10010-023
Phenol Red Free DMEM	Life Technologies	31053028	Phenol Red Free media is only required for the LDH release assay.
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP1600-100
L-glutamine	Gibco	25030149	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Sodium pyruvate	Gibco	BP356100	Only required to supplement cell culture media for LDH release assay.
Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (6 well)	Corning	3540
Collagen-coated 0.4 μm Transwell inserts (24 well)	Corning	3595
Forceps	Fisher	3120018	These must be sterilized with ethanol prior to handeling Transwell inserts.
Cell scrapers	Fisherbrand	08-100-241	These are only required for the collection of cell lysates.
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	04042-500	TOXIC.  This is only required for immunofluorescence imaging.
Bicinchoninic acid (BCA) assay kit	Pierce	23227	Other protein quantification assays may be used.
Tris-glycine 4 - 15% polyacrylamide gels	BioRad	4561083	Buffer system and percent polyacrylamide should be selected based on proteins of interest.
Electrophoresis cassette supplies	BioRad	1658063	Only required for Western Blotting.
Electrophoresis power supply	BioRad	1645050	Only required for Western Blotting.
Western blot transfer cassette	BioRad		Only required for Western Blotting.
Polyvinylidene (PVDF) Membrane	EMD Millipore	IPVH00010	Only required for Western Blotting.
Tween 20	Sigma	P1379-500ml
Rabbit IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2030	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Mouse IgG-HRP secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc2031	The secondary antibody should be determined based on the selected method of detection.
Phospho-p38 (T180 + T182) MAPK antibody	Cell Signaling	4511	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Total p38 MAPK antibody	Cell Signaling	8690	Select appropriate primary antibodies based on proteins of interest.
Goat anti-rabbit IgG Alexafluor 488	Molecular Probes	A-11034	Other secondary antibodies may be used for immunofluoresence imaging detection.
LumiGLO Detection Reagent	KPL	54-61-00	Only required for Western Blotting with detection on film.
Detection film	Biodot	BDB57	Only required for Western Blotting with detection on film.
DeltaVision Nikon 90i fluoresence microscope	Nikon		Other fluorescence microscopes are suitable for these analyses.
Normal goat serum	Thermo Scientific	31873
Triton X-100	Sigma	T9284-500mL
DAPI nuclear stain	Cell Signaling	4083	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Rhodamine-phalloidin actin stain	Molecular Probes	R415	Select stains based on specific immunofluorescence applications of interest.
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Only required for immunofluorescence imaging.
Ethidium homodimer 1	Molecular Probes	E1169	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Spectramax M5 Microplate Reader	Molecular Devices		Other microplate readers capable of detecting UV-vis, fluorescence and luminescence may be suitable.
Saponin	Sigma	47036-50G-F	Only required for membrane permeabilization cytotoxicity assay.
Molecular Probes ATP Determination Kit	Life Technologies	A22066	Other kits are likely to be suitable.
Cytotoxicity Detection Kit for LDH release	Roche	11644793001	Other kits are likely to be suitable.
Nonidet P40 Substitute	Sigma	74385-1L	Other suppliers are suitable.
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Thermo Scientific	78420B	Other cocktails are likely to be suitable.
SIGMAFAST Protease Inhibitor Cocktail Tablets, EDTA-free	Sigma	S8830-2TAB	Other cocktails are likely to be suitable.