JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Accurate assessment of anti-inflammatory effects is of utmost importance for the evaluation of potential new drugs for the treatment of inflammatory bowel disease. Digital holographic microscopy provides assessment of inflammation in murine and human colonic tissue samples as well as automated multimodal evaluation of epithelial wound healing in vitro.

Аннотация

Частота воспалительных заболеваний кишечника, то есть, болезнь Крона и язвенный колит, значительно возросло за последнее десятилетие. Этиология ВЗК остается неизвестной и в настоящее время терапевтические стратегии основаны на неспецифическое подавление иммунной системы. Разработка методов лечения, которые специально направлены воспаление кишечника и эпителиальной заживление раны может значительно улучшить управление IBD, однако это требует точного выявления воспалительных изменений. В настоящее время потенциальные кандидаты наркотиков, как правило , оцениваются с использованием моделей животных в естественных условиях или с помощью методов , основанных на культуре клеток в пробирке. Гистологическое исследование обычно требует клеток или тканей, представляющих интерес для окрасить, которые может привести к изменению характеристик образца и, кроме того, интерпретация результатов может варьироваться следователем экспертизы. Цифровой голографический микроскопия (DHM), основанный на обнаружении оптической линии задержки длины, позволяетПятно свободной количественный фазовый контраст изображения. Это позволяет результаты прямо коррелирует с абсолютными биофизических параметров. Показано, как измерение изменений плотности ткани с DHM, на основе рефракционной измерения индекса, можно определить количество воспалительных изменений, без окрашивания, в различных слоях образцов ободочной ткани от мышей и людей с колитом. Кроме того, мы покажем непрерывную мультимодального без наклеек мониторинг эпителиальной заживления ран в пробирке, возможно , используя DHM через простой автоматизированной определения раненой области и одновременного определения морфологических параметров , таких как сухой массы и толщины слоя мигрирующих клеток. В заключение DHM представляет собой ценный, новый и количественный инструмент для оценки кишечного воспаления с абсолютными значениями параметров возможных, упрощенную количественную оценку эпителиальной заживления ран в пробирке и , следовательно , имеет высокий потенциал для поступательной диагностической Uсе.

Введение

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), т.е., язвенного колита (UC) и болезнь Крона (CD) являются идиопатические воспалительные заболевания желудочно - кишечного тракта 1. Исследования в патофизиологии ВЗК и оценки потенциальных новых лекарственных препаратов или новых диагностических подходов особенно важное значение. В обоих фундаментальных исследований и клинического лечения пациентов с воспалительной болезнью кишечника, слизистая оболочка кишечника стала центром внимания 2,3. Слизистая оболочка представляет собой анатомическую границу, при которой взаимодействие между синантропных бактерий, эпителиальных клеток и различных клеточных компонентов кишечной иммунной системы кишечника оркестровать гомеостаза 4,5. Тем не менее, у пациентов с воспалительной болезнью кишечника, неконтролируемое и настойчивый воспаление кишечного тракта приводит к повреждению слизистой оболочки, обнаруживаемый в изъязвления или стеноз, который может , наконец , достигают высшей точки при пробое эпителиального барьерной функции, которая сама по себе обостряет локальное воспаление 6.

Эпителиальное заживление ран Поэтому крайне важно для регенерации эпителия следующие воспаления , но также является основным требованием для исцеления желудочно - кишечных язв или анастомоза утечки после желудочно - кишечной хирургии 7. Эпителиальные заживление ран может быть смоделирована в экстракорпоральное заживления ран анализы и в мышиных моделях воспаления кишечника 8,9. И в пробирке и в естественных условиях подходы имеют свои недостатки, которые ограничивают точность экспериментальной оценки. В пробирке анализы, как классические скретч анализы, требуют длительных процедур окрашивания или трансфекция флуоресцентных хромофоров. Они часто ограничены их разрывной мониторинга пролиферации и миграции клеток , которые не могут быть автоматизированы 10. В естественных условиях модели, такие как сульфат декстрана натрия (DSS) индуцированная колита, часто не хватает надежных чтения аутов, отчасти из - за значительного изменения видели в лабораторных маркеров, макороль такие маркеры неуместные для оценки тяжести колита 11,12. Гистологический анализ воспаленной слизистой оболочки в настоящее время до сих пор наиболее обоснованный подход для определения степени тяжести колита , но это, как эпителиальные заживлении ран анализов в пробирке, требует окрашивания и зависит от опыта исследователя 13.

Недавно цифровой голографической микроскопии (DHM), вариант количественной фазовой микроскопии 14, был идентифицирован как полезный инструмент для оценки эпителиальной заживления ран в пробирке и в естественных условиях 15. DHM позволяет оценить плотность ткани путем измерения оптической линии задержки длины (РОП) , что диагноз рака перспективы романа 16-18 и количественное определение воспаления тканей , связанных с изменениями 19. Кроме того, DHM позволяет осуществлять мониторинг динамики морфологии клеток путем определения толщины ячейки, ячейка покрыта площадь поверхности и внутриклеточных (белок) количество контента 15,20. В анализах в пробирке, DHM также позволяет анализировать физиологических процессов, например, проницаемости клеточной воды путем оценки изменения объема клеток и толщиной 21,22. Кроме того, измерения DHM могут быть автоматизированы, который предотвращает смещение выборки исследователя-ассоциированной.

Здесь мы демонстрируем использование DHM в мышиной модели воспаления кишечника, а также применять DHM для анализа образцов тканей человека для количественного мониторинга заживления ран в качестве метки , свободной от анализа в пробирке. Во-первых, мы оцениваем воспалительные изменения различных ободочной стеновых слоев в colitic мышей и срезов ткани от людей с IBD. После описания процедуры визуализации количественной фазы DHM, мы предоставляем подробные инструкции по использованию компонентов микроскопа, подготовку срезов тканей, а также описывают оценку полученных количественных фазовых изображениях.

Далее мы покажем, что DHM может быть ИМПтрализованную для непрерывного мониторинга мультимодального эпителиального заживления ран в пробирке, и описать анализ клеточных характеристик , таких как толщина слоя клеток, сухой массы и клеточного объема дают представление наркотиков индуцированных и физиологическая клеточных изменений.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все эксперименты на животных были одобрены региональным комитетом по этике в (в Landesamt für Natur, Umwelt унд Verbraucherschutz, LANUV, Германия) в соответствии с немецким Законом о защите животных. Местного комитета по этике Университета Мюнстера одобрил использование человеческих тканей для гистологического и микроскопического анализа.

1. Животные и материалы

  1. Использование женского или мужского пола мышей требуемого DSS восприимчивых штамма, который весит от 20 до 25 г, и дом в соответствии с местным законодательством по уходу за животными. Обеспечить специальную чау для грызунов и автоклавируют питьевой воды вволю.
  2. Индуцируют острый DSS колитов путем введения 3% вес / объем декстрана сульфата натрия (DSS, молекулярная масса: 36,000-50,000 Da) в автоклавного водопроводной воде в течение 5 дней.
    Примечание: Действенность DSS сильно варьирует в зависимости от производителя и партии. Проверка поставщика предоставленного DSS сначала для индукции активности заболевания, для которых даILY масса тела является надежным и объективным показателем.
  3. Для гистологического исследования образцов тканей толстой, усыпить мышей CO 2 вдувания (или , как это указано в национальных и институциональных принципов) в конце эксперимента.

2. Экспериментальная установка для DSS-колита и in-vitro заживлении ран Assays

  1. Клеточные культуры и создание ранозаживления анализа.
    1. Рост клеток Сасо-2 , в 95% влажности и 5% СО 2 окружающей среды при 37 ° С. Используйте RPMI среду с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина.
    2. Семенной клетки Сасо-2 при плотности 4 × 10 5 клеток / см 2 на 35 мм чашки Петри с высокой культурой-вставкой (рис 4а).
      Примечание: вставка создает две области ячейки покрыты, которые разделены с определенным свободное пространство клеток , представляющее раненую область , которую необходимо проанализировать.
    3. Изменение среднего за два дня после того, как seedinг. Выполните сначала аспирационных остатки среды с остатков клеток с помощью автоматической пипетки, полоскание с 100 мкл фосфатно-буферного раствора (PBS) и добавляют свежую среду RPMI или сывороточный лишенной среды.
    4. Культуры клеток в течение 24 ч в сыворотке лишенной среде (0,1% FBS) с добавлением 20 нг / мл EGF сыворотки или 2 мкг митомицина / мл сыворотки для обнаружения изменений в процессе заживления ран поведения. Добавить нормальную среду RPMI с контрольными клетками в течение 24 ч.
    5. Через 24 ч культуры, снимите и выбросьте культуры вставки, как описано в шаге 3.4 и выполнить DHM.
  2. Индукционная острого колита DSS
    1. Растворить 3 г ДСС в 100 мл автоклавного воды, чтобы получить 3% (вес / объем) раствора DSS. Обеспечить это решение вместо питьевой воды мышам вволю в течение 7 дней. Рассчитать 5 мл DSS-раствора на мышь / день. Обеспечить автоклавированы воду без DSS для контрольных мышей вволю.
  3. Приготовление криостатированной секций мышиных и толстой кишки человека
    1. Эвтаназии мышей СО 2 вдувания в конце эксперимента.
    2. Рассеките живота животных по лапаротомии 23. Удалите всю толстую кишку тщательно с помощью пинцета и разрезать подвздошную и ректальное конец с помощью хирургических ножниц. Вырезать толстую кишку с ножницами в продольном направлении от слепой кишки до прямой кишки конца и открыть толстую кишку. Удалить все фекалии из образца с помощью пинцета с последующим промыванием PBS , 24.
    3. Приготовьте рулеты путем сворачивания всю толстую кишку с ватным тампоном в продольном направлении от слепой кишки до прямой кишки конца со слизистой оболочкой изогнутой внутрь. Встраивание ободочной образцов в оптимальной температуре резания (ОКТ) соединения и держать в замороженном состоянии при -80 ° С до дальнейшего использования.
    4. Встраивание ободочной ткани человека от хирургического образца в оптимальной температуры резания ОКТ соединения и держать в замороженном состоянии при -80 ° С до дальнейшего использования.
    5. Срезанные участки 7 мкм толщиной образцов ОСТ-соединением, внедренный с помощью cryotoмне только до экзамена.
      Примечание: Оптимальная толщина образца зависит от настойчивости и рассеивающих свойств типа ткани исследуемого. Для описанных экспериментов с использованием ткани толстой кишки, толщина среза> 10 мкм вызывают значительное увеличение шума из-за рассеяния света в количественных контрастных изображений DHM фазы, в то время как образцы толщиной <5 мкм показывают более высокий риск повреждений, вызванных артефактов из процесса крио резки.
    6. Перенос разделов на предметное стекло объекта-носителя.

3. Техническое оборудование, программное обеспечение и процедуры для сбора и оценки цифровых голограмм

  1. Цифровой голографический микроскоп для количественного клеток и визуализации тканей
    1. Используйте Внеосевое цифровой голографической системы микроскопии Маха-Цандера для клеток живого изображения 25, как показано на рисунке 1. Убедитесь в том, что микроскоп оснащен10X микроскоп объектив, столик микроскопа с держателем для несущих слайдах объектов из стекла и чашки Петри диаметром 35 мм, нагревательную камеру для сохранения физиологической температуры при 37 ° C и программное обеспечение для количественного фазового изображения 25.
      Примечание: Например, как описано в разделе Kemper и соавт 26 и Langehanenberg и др. 27..
      Примечание: В качестве альтернативы, использовать подобную систему, которая способна выполнять светлопольной микроскопии и количественного фазового визуализации живых клеток и рассеченных тканей слайдов.
    2. Чистый объектив микроскопа и конденсатор с бумагой для очистки объективов и моющего средства (например, этанол) в соответствии с рекомендациями производителя микроскопа для удаления пыли и других загрязнений.
    3. Запустите программу захвата изображений микроскопа DHM, выберите режим "Светлое поле" изображения и переключатель "на" освещении белым светом. Обеспечить Колер-Корреквания образца в соответствии с рекомендациями производителя микроскопа при наблюдении образца в окне живого изображения программного обеспечения захвата изображений (в качестве альтернативы стандартное программное обеспечение захвата изображения можно использовать на этом этапе).
      Примечание: Интенсивность изображения должны быть равномерно распределены в поле зрения и положение образца не должен двигаться при оптическом переориентацию с фокусной приводом микроскопа.
    4. Выберите режим "DHM" изображения, включить "выключено" белого света освещения и переключатель "на" лазерного света. Убедитесь , что освещение лазерным светом является однородным (т.е., что интенсивность света равномерно распределен в окне живого изображения программного обеспечения сбора изображений микроскопа DHM) и заметим , что вне оси несущей картина интерференционных полос появляется с достаточной контрастности в захваченные изображения (цифровые голограммы).
  2. Приготовление криостата секций для визуализациис DHM
    1. Возьмем (раздел криостата на объект носитель стекла, толщина: 7 мкм, как это описано в разделе 2.3) образец из морозильника. Размораживание образца в течение примерно 5 мин при комнатной температуре и нормальной атмосфере.
    2. Добавить 50 - 100 мкл фосфатно-солевой буфер (PBS) в качестве вложение среды на участке ткани, используя пипетку, пока она не будет полностью покрыт буфером. Накройте образец покровным стеклом чистое стекло (стекло толщиной 170 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: пересушивание может вызвать значительные изменения показателя преломления и рассеяния свойства образца.
    3. Убедитесь, что в нижней части держателя стекла и покровного стекла очищают от пыли и других загрязнений, которые могут вызвать рассеивание света. Образец готов к исследованию с ярким полем микроскопии и DHM.
  3. Количественная фаза формирования изображения срезов ткани с DHM
    1. Включите цифровой голографический микроскоп, выбрать 10X микроскопа объектив для работы с изображениями. Начало Iмагом приобретение программного обеспечения микроскопа DHM и выберите режим яркого изображения файла.
    2. Поместите слайд ткани, как это описано в пункте 2) в держатель стекло микроскопа, с покровным стеклом, обращенной объектива микроскопа.
    3. Переключатель "на" светлом поле освещения микроскопа DHM. Поместите образец с столику микроскопа и убедитесь, что область ткани интереса видна в окне мониторинга в реальном времени. Повышение резкости изображения с помощью фокуса диска микроскопа.
      Примечание: Так же , как область интереса, область скольжения без ткани должны также присутствовать в поле зрения.
    4. Захват светлого поля изображение резко сосредоточены образца с использованием программного обеспечения получения изображений.
    5. Выберите режим съемки "DHM", включить "выключено" в освещении белым светом и повернуть "на" лазерного светового освещения. Выберите "время экспозиции" для записи голограмм ниже 3 мс, заметим, что holographic внеосевая интерференционные полосы появляются с достаточной контрастности в окне живого изображения программного обеспечения сбора изображений и захватить цифровую голограмму.
    6. Повторите шаги 3.3.3 - 3.3.5, пока достаточное количество ярких полевых изображений и цифровых голограмм различных областей образца не зафиксировано. Голограмма приобретение завершена.
  4. Подготовка заживление ран анализов для визуализации DHM
    1. Включите блюдо нагревательной камеры Петри микроскопа DHM около 1 - 3 ч до начала эксперимента для обеспечения стабильных температурных условий в процессе измерений DHM.
    2. Подготовьте рабочее место с необходимым оборудованием (чашки Петри для заживления ран анализ описан в разделе 2.3): пипеток, пинцета стеклянной крышкой для чашки Петри, 4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислоты (HEPES) буферным среда для культивирования клеток с физиологическим температура (37 ° С) для подготовки проб в стерильной среде.
      Примечание: Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , состоит из 10% фетальной сыворотки Calve (FCS), 20 мМ HEPES (4- (2-гидроксиэтил) -1-пиперазинэтансульфонова кислота) и 850 мг / л NaHCO 3.
    3. Удалите пластиковую крышку от чашки Петри и удалить среду для культивирования клеток с помощью пипетки. Удалите вставку из тарелки дна Петри с помощью пинцета.
    4. Отмывки образца 1 - 2 раза с 1 мл HEPES буферизованных среда для культивирования клеток для того , чтобы удалить мертвые клетки и оставшиеся клеточные компоненты (например, сыворотки) в области раны. Добавляют 2 мл HEPES забуференного среда для культивирования клеток и крышки чашки Петри со стеклянной крышкой.
    5. Убедитесь в том, что стеклянная крышка и блюдо дно Петри были очищены от пыли и других загрязнений. Образец готов к времени наблюдения покадровой с DHM.
  5. Непрерывное мультимодальный мониторинг заживления ран в пробирке с DHM
    1. Включите камеру нагрева блюдо Петри из DHM микроскопа около 1 - 3 ч додо начала эксперимента для обеспечения стабильных температурных условий в процессе измерений DHM.
    2. Переключатель "на" цифровой голографический микроскоп, выберите 10X микроскопа объектив для работы с изображениями. Запустите программу захвата изображений микроскопа DHM и выберите режим визуализации "светлого поля". Убедитесь, что камера нагрева для чашки Петри работает физиологической температуры (37 ° С).
    3. Поместите чашку Петри с ранозаживляющих анализа, полученного, как описано в 4), в нагревательной камере микроскопа DHM.
    4. Выберите режим яркого изображения поля и поместить образец с столик микроскопа, наблюдая его в окне мониторинга в реальном времени программного обеспечения захвата изображений микроскопа DHM. Заметим, что требуемая площадь образца появляется целенаправленными при освещении белым светом.
    5. Захват яркие полевые изображения различных областей образца (раневой области и прилегающих районах с сливающихся клеток) под белымсветовой освещенности с программным обеспечением захвата изображений и внешний вид документа, плотности клеток и однородности.
    6. Выберите "светлое поле" режим визуализации микроскопа DHM. Выберите подходящую область раны при освещении белым светом в окне мониторинга в реальном времени с программным обеспечением захвата изображений микроскопа DHM. Убедитесь, что рана площадь свободна от мертвых клеток и без сыворотки остается, и обеспечить, чтобы обе стороны включают одну гомогенную клеточный слой, предпочтительно с прямыми границами.
    7. Захват белого света изображение исходной области раны в режиме яркого изображения поля с программным обеспечением захвата изображений микроскопа DHM.
    8. Включите "выключено" белого света освещения, выберите режим "DHM" и переключатель "на" лазерной подсветкой. Выберите время экспозиции ниже 3 мс для записи голограммы (отметим, что голографический внеосевой интерференционные полосы появляются с достаточной контрастности в окне живого изображения программного обеспечения захвата изображений из тон DHM микроскоп) и захватить цифровую голограмму.
    9. Захват образца голограммы в режиме DHM с программным обеспечением захвата изображений и реконструировать количественный фазовый изображение с программным обеспечением реконструкции микроскопа DHM для того, чтобы проверить качество изображения.
    10. Выберите подходящую задержку по времени (например, 3 - 5 мин) для покадровой приобретения голограммой с программным обеспечением захвата изображений микроскопа DHM.
    11. Выберите режим приобретения покадровой программного обеспечения получения изображений, в котором образец подсвечивается только лазерным светом во время получения голограммы.
    12. Начало замедленную наблюдение DHM в заживлении ран анализа.
    13. Прекратить приобретение покадровой после предполагаемого времени, выберите режим формирования изображения яркое поле и документировать окончательный вид образца под белым светом визуализации.
  6. Реконструировать цифровые голограммы рассеченных тканей и определяют средний показатель преломления в качестве параметра для количественной оценкиплотность ткани
    1. Реконструировать количественных фазовых изображений с цифровых голограмм расчлененный тканей с программным обеспечением микроскопа DHM, например, как описано в Кемпер и др. 26 и Langehanenberg и др. 27.
    2. Определить средний фазовый контраст ДФ в разных слоях ткани (эпителий, подслизистая, стромы) в специально выбранных областей интересов (Rois) 19.
    3. Определить показатель преломления вложение среды с помощью рефрактометра или в качестве альтернативы, используя соответствующее значение из литературы. (значения индекса рефракции для типичного вложения сред: N воды = 1,334 28, н забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) = 1.337 29, п среда для культивирования клеток = 1.337-1.339 29,30).
    4. Расчет показателей преломления различных слоев ткани от среднего значения контрастности фазы 19
      figure-protocol-15819 (1)
      Примечание: В уравнении. 1 λ является длина волны лазерного луча (здесь: λ = 532 нм), d толщина рассеченных тканей (здесь: 7 мкм) и п среда является показатель преломления вложению среды (здесь: N среда = N ПБС = 1,337, определенная Аббе-Рефрактометр).
  7. Реконструировать и оценивать цифровые голограммы с покадровой ранозаживляющее наблюдения серии
    1. Реконструировать количественных фазовых изображений из временных рядов покадровой голограммы , полученной при заживлении наблюдения исцеления с микроскопа программным обеспечением DHM 26,27.
    2. Нормализация каждой серии количественных фазовых изображений к изображению с максимальной фазового контраста.
    3. Определить площадь S ^, которая покрыта клетками в количественных фазовых изображениях DHM путем сегментации изображений, которое может быть вформируется с использованием профилировщика свободного программного обеспечения клеток (www.cellprofiler.org 31).
    4. Вычислить среднюю фазовый контраст клеток Аф сота в области S с.
    5. Получение клеточного сухой массы DM от среднего значения контраста фазы Аф сота в области S C 15
      figure-protocol-17250 (2)
      Примечание: В уравнении 2 ДМ обозначает клеточный сухой массы, S C представляет область, которая занята клетками, а = 0,002 м 2 / кг.
    6. Определить интегральный клеточный показатель преломления п клетки и показателя преломления среды для культивирования клеток н среды. Определить п ячейку отдельно экспериментально от взвешенных клеток , как описано в 30 и измеряют н среду с помощью рефрактометра. Alternaтивно использовать значения литературы для русской ячейки 30 и п среды 29,30.
    7. Расчет средней толщины ячейки d ячейки от X, Аф клетки, клетки и п п средней 26,32
      figure-protocol-18215 (3)
      Примечание: В уравнении. 3 параметр d ячейки является средняя толщина ячейки, λ обозначает свет длина волны лазерного света, Δφ ячейка обозначает среднее фазового контраста, и п клеток и п среда являются неотъемлемой клеточный показатель преломления и показатель преломления окружающей среды.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Типичная установка для DHM визуализации для цифрового голографического микроскопии (DHM)

Для выполнения светлого поля с изображениями и количественного DHM фазового контраста изображений, мы применили инвертированного микроск...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Показано , что DHM обеспечивает точную оценку гистологического повреждения в мышиных моделях колита и образцах тканей человека ободочной бывших естественных условиях. Кроме того, мы показали DHM может непрерывно контролировать эпителиальной заживление ран при одновременном обесп?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

We thank Faekah Gohar for proofreading the manuscript. We thank Sonja Dufentester and Elke Weber for expert technical assistance.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
Azoxymethane (AOM)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyA5486
Cell Culture FlaskGreiner Bio-One, Frickenhausen, Germany658170
Costar StripetteCorning Inc., New York, USA4488
Dextran sulphate sodium (DSS)TdB Consulatancy, Uppsala, SwedenDB001
DMEM/Ham's F12PAA Laboratories - Pasching - AustriaE15-813
EGFSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanySPR3196
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyE 9884
Falcon Tube 50 mlBD Biosciences, Erembodegem, Belgium352070
Isopentane (2-Methylbutane)Sigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM32631-1L
Methylene blueMerck, Darmstadt, Germany1159430025
Mitomycin CSigma - Aldrich, Deisenhofen, GermanyM4287
Microscope SlidesG. Menzel, Braunschweig, GermanyJ1800AMNZ
O.C.T. Tissue Tek compound                                 Sakura, Zoeterwonde, Netherlands4583
Pen/Strep/Amphotericin BLonza, Verviers, Belgium1558
Phosphate buffered saline, PBSLonza, Verviers, Belgium4629
RPMI 1640Lonza, Verviers, Belgium3626
Sodium Chloride 0.9%Braun, Melsungen, Germany5/12211095/0411
Standard dietAltromin, Lage, Germany1320
Tissue-Tek CryomoldSakura, Leiden, Netherlands4566
Trypsin EDTALonza, Verviers, Belgium7815
Vitro – CludR. Langenbrinck, Teningen, Germany04-0002 
 µ-Dish 35 mm with Culture-Insert, highibidi GmbH, Munich, Germany81176
DIC Lid for µ-Dishes, with a glass insertibidi GmbH, Munich, Germany80050
Equipment
MICROM HM550Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, USA46320
Digital holographic microscope
ComponentModelCompany
Inverted MicroscopeiMICTill Photonics, Graefelfing, Germany
LaserCompass 315MCoherent GmbH, Luebeck, Germany
Microscope lensZeiss EC Plan Neofluar 10x/0.3Zeiss, Goettingen, Germany
CCD cameraDMK 41BF02The Imaging Source, Bremen, Germany

Ссылки

  1. Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Inflammatory bowel disease: clinical aspects and established and evolving therapies. Lancet. 369 (9573), 1641-1657 (2007).
  2. Dieleman, L. A., et al. Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines. Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).
  3. Florholmen, J. Mucosal healing in the era of biologic agents in treatment of inflammatory bowel disease. Scand J Gastroenterol. 50 (1), 43-52 (2015).
  4. Merga, Y., Campbell, B. J., Rhodes, J. M. Mucosal barrier, bacteria and inflammatory bowel disease: possibilities for therapy. Dig Dis. 32 (4), 475-483 (2014).
  5. Young, V. B., Kahn, S. A., Schmidt, T. M., Chang, E. B. Studying the Enteric Microbiome in Inflammatory Bowel Diseases: Getting through the Growing Pains and Moving Forward. Front Microbiol. 2, 144(2011).
  6. Atreya, R., Neurath, M. F. IBD pathogenesis in 2014: Molecular pathways controlling barrier function in IBD. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 12 (2), 67-68 (2015).
  7. Jones, M. K., Tomikawa, M., Mohajer, B., Tarnawski, A. S. Gastrointestinal mucosal regeneration: role of growth factors. Front Biosci. 4, 303-309 (1999).
  8. Burk, R. R. A factor from a transformed cell line that affects cell migration. Proc Natl Acad Sci U S A. 70 (2), 369-372 (1973).
  9. Singh, A., Nascimento, J. M., Kowar, S., Busch, H., Boerries, M. Boolean approach to signalling pathway modelling in HGF-induced keratinocyte migration. Bioinformatics. 28 (18), 495-501 (2012).
  10. Sakalar, C., et al. Pronounced transcriptional regulation of apoptotic and TNF-NF-kappa-B signaling genes during the course of thymoquinone mediated apoptosis in HeLa cells. Mol Cell Biochem. 383 (1-2), 243-251 (2013).
  11. Serada, S., et al. Serum leucine-rich alpha-2 glycoprotein is a disease activity biomarker in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis. 18 (11), 2169-2179 (2012).
  12. Turovskaya, O., et al. RAGE, carboxylated glycans and S100A8/A9 play essential roles in colitis-associated carcinogenesis. Carcinogenesis. 29 (10), 2035-2043 (2008).
  13. Perse, M., Cerar, A. Dextran sodium sulphate colitis mouse model: traps and tricks. J Biomed Biotechnol. 2012, 718617(2012).
  14. Lee, K., et al. Quantitative phase imaging techniques for the study of cell pathophysiology: from principles to applications. Sensors (Basel). 13 (4), 4170-4191 (2013).
  15. Bettenworth, D., et al. Quantitative stain-free and continuous multimodal monitoring of wound healing in vitro with digital holographic microscopy. PLoS One. 9 (9), 107317(2014).
  16. Sridharan, S., Macias, V., Tangella, K., Kajdacsy-Balla, A., Popescu, G. Prediction of prostate cancer recurrence using quantitative phase imaging. Sci Rep. 5, 9976(2015).
  17. Wang, Z., Tangella, K., Balla, A., Popescu, G. Tissue refractive index as marker of disease. J Biomed Opt. 16 (11), 116017(2011).
  18. Majeed, H., et al. Breast cancer diagnosis using spatial light interference microscopy. J Biomed Opt. 20 (11), 111210(2015).
  19. Lenz, P., et al. Digital holographic microscopy quantifies the degree of inflammation in experimental colitis. Integr Biol (Camb). 5 (3), 624-630 (2013).
  20. Popescu, G., et al. Optical imaging of cell mass and growth dynamics. Am J Physiol Cell Physiol. 295 (2), 538-544 (2008).
  21. Klokkers, J., et al. Atrial natriuretic peptide and nitric oxide signaling antagonizes vasopressin-mediated water permeability in inner medullary collecting duct cells. Am J Physiol Renal Physiol. 297 (3), 693-703 (2009).
  22. Jourdain, P., et al. Determination of transmembrane water fluxes in neurons elicited by glutamate ionotropic receptors and by the cotransporters KCC2 and NKCC1: a digital holographic microscopy study. J Neurosci. 31 (33), 11846-11854 (2011).
  23. Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. Chemically induced mouse models of intestinal inflammation. Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).
  24. Bettenworth, D., et al. The tripeptide KdPT protects from intestinal inflammation and maintains intestinal barrier function. Am J Pathol. 179 (3), 1230-1242 (2011).
  25. Kemper, B., et al. Modular digital holographic microscopy system for marker free quantitative phase contrast imaging of living cells. Proc. SPIE. 6191, (2006).
  26. Kemper, B., von Bally, G. Digital holographic microscopy for live cell applications and technical inspection. Appl Opt. 47 (4), 52-61 (2008).
  27. Langehanenberg, P., von Bally, G., Kemper, B. Autofocusing in digital holographic microscopy. 3D Research. 2 (1), 1-11 (2011).
  28. Daimon, M., Masumura, A. Measurement of the refractive index of distilled water from the near-infrared region to the ultraviolet region. Applied optics. 46 (18), 3811-3820 (2007).
  29. Przibilla, S., et al. Sensing dynamic cytoplasm refractive index changes of adherent cells with quantitative phase microscopy using incorporated microspheres as optical probes. J Biomed Opt. 17 (9), 0970011-0970019 (2012).
  30. Kemper, B., et al. Integral refractive index determination of living suspension cells by multifocus digital holographic phase contrast microscopy. J Biomed Opt. 12 (5), 054009(2007).
  31. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100(2006).
  32. Marquet, P., et al. Digital holographic microscopy: a noninvasive contrast imaging technique allowing quantitative visualization of living cells with subwavelength axial accuracy. Opt Lett. 30 (5), 468-470 (2005).
  33. Langehanenberg, P., Kemper, B., Dirksen, D., von Bally, G. Autofocusing in digital holographic phase contrast microscopy on pure phase objects for live cell imaging. Appl Opt. 47 (19), 176-182 (2008).
  34. Hanauer, S. B., et al. Maintenance infliximab for Crohn's disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet. 359 (9317), 1541-1549 (2002).
  35. Colombel, J. F., et al. Adalimumab for maintenance of clinical response and remission in patients with Crohn's disease: the CHARM trial. Gastroenterology. 132 (1), 52-65 (2007).
  36. Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. N Engl J Med. 369 (8), 699-710 (2013).
  37. Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease. N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).
  38. Monteleone, G., et al. Mongersen, an oral SMAD7 antisense oligonucleotide, and Crohn's disease. N Engl J Med. 372 (12), 1104-1113 (2015).
  39. Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
  40. Sandborn, W. J., et al. Ustekinumab induction and maintenance therapy in refractory Crohn's disease. N Engl J Med. 367 (16), 1519-1528 (2012).
  41. Natividad, J. M., et al. Commensal and probiotic bacteria influence intestinal barrier function and susceptibility to colitis in Nod1-/-; Nod2-/- mice. Inflamm Bowel Dis. 18 (8), 1434-1446 (2012).
  42. Melgar, S., et al. Validation of murine dextran sulfate sodium-induced colitis using four therapeutic agents for human inflammatory bowel disease. Int Immunopharmacol. 8 (6), 836-844 (2008).
  43. Erben, U., et al. A guide to histomorphological evaluation of intestinal inflammation in mouse models. Int J Clin Exp Pathol. 7 (8), 4557-4576 (2014).
  44. Bruckner, M., et al. Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation. J Vis Exp. (90), (2014).
  45. Zhao, K., Wang, W., Guan, C., Cai, J., Wang, P. Inhibition of gap junction channel attenuates the migration of breast cancer cells. Mol Biol Rep. 39 (3), 2607-2613 (2012).
  46. Pavillon, N., et al. Early cell death detection with digital holographic microscopy. PLoS One. 7 (1), 30912(2012).
  47. Hindryckx, P., et al. Clinical trials in ulcerative colitis: a historical perspective. J Crohns Colitis. 9 (7), 580-588 (2015).
  48. Neurath, M. F., Travis, S. P. Mucosal healing in inflammatory bowel diseases: a systematic review. Gut. 61 (11), 1619-1635 (2012).
  49. Bryant, R. V., Winer, S., Travis, S. P., Riddell, R. H. Systematic review: histological remission in inflammatory bowel disease. Is 'complete' remission the new treatment paradigm? An IOIBD initiative. J Crohns Colitis. 8 (12), 1582-1597 (2014).
  50. Marchal Bressenot, A., et al. Review article: the histological assessment of disease activity in ulcerative colitis. Aliment Pharmacol Ther. 42 (8), 957-967 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

115

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены