В Vivo модели для тестирования влияния гипоксии на метастазирование опухолей

Резюме

This manuscript describes the development of an animal model that allows for the direct testing of the effects of tumor hypoxia on metastasis and the deciphering the mechanisms of its action. Although the experiments described here focus on Ewing sarcoma, a similar approach can be applied to other tumor types.

Аннотация

Hypoxia has been implicated in the metastasis of Ewing sarcoma (ES) by clinical observations and in vitro data, yet direct evidence for its pro-metastatic effect is lacking and the exact mechanisms of its action are unclear. Here, we report an animal model that allows for direct testing of the effects of tumor hypoxia on ES dissemination and investigation into the underlying pathways involved. This approach combines two well-established experimental strategies, orthotopic xenografting of ES cells and femoral artery ligation (FAL), which induces hindlimb ischemia. Human ES cells were injected into the gastrocnemius muscles of SCID/beige mice and the primary tumors were allowed to grow to a size of 250 mm³. At this stage either the tumors were excised (control group) or the animals were subjected to FAL to create tumor hypoxia, followed by tumor excision 3 days later. The efficiency of FAL was confirmed by a significant increase in binding of hypoxyprobe-1 in the tumor tissue, severe tumor necrosis and complete inhibition of primary tumor growth. Importantly, despite these direct effects of ischemia, an enhanced dissemination of tumor cells from the hypoxic tumors was observed. This experimental strategy enables comparative analysis of the metastatic properties of primary tumors of the same size, yet significantly different levels of hypoxia. It also provides a new platform to further assess the mechanistic basis for the hypoxia-induced alterations that occur during metastatic tumor progression in vivo. In addition, while this model was established using ES cells, we anticipate that this experimental strategy can be used to test the effect of hypoxia in other sarcomas, as well as tumors orthotopically implanted in sites with a well-defined blood supply route.

Введение

Саркома Юинга (ES) является агрессивным злокачественности среди детей и подростков. ¹ Опухоли развиваются в мягких тканей и костей, обычно в конечностях. В то время как наличие метастазов является наиболее мощным неблагоприятным прогностическим фактором для пациентов ES, механизмы, лежащие в основе их развития остаются неясными. ² Опухоль гипоксия является одним из немногих факторов , вовлеченных в ES прогрессии. У пациентов, ES, присутствие не-перфузию областей в ткани опухоли ассоциируется с плохим прогнозом. ³ В пробирке, гипоксия увеличивает инвазивность ЭС клеток и запускает экспрессию про-метастатических генов. ^4-6 Тем не менее, несмотря на эти линии доказательств, нет прямых доказательств для гипоксия-индуцированного ES прогрессии и распространения не существует. Кроме того, механизмы, с помощью которых гипоксия оказывает такие эффекты, в настоящее время, неизвестно. Таким образом, мы создали модель в естественных условиях , чтобы заполнить пробел между существующими в пробирке данные и клинической obserдений. Эта модель система позволяет осуществлять прямое тестирование последствий гипоксии на опухолях , происходящих в их естественной среде, с помощью магнитно - резонансной томографии (МРТ) , чтобы следовать прогрессии опухоли и метастазирование в естественных условиях в сочетании с экс естественных условиях патологических и молекулярных анализов (рисунок 1).

Так как не создана трансгенная модель ES в настоящее время доступна, исследования в естественных условиях на метастатических свойств этих опухолей полагаются на инъекции человеческих клеток в иммунодефицитом мышей. В то время как использование иммунологически обесцененных животных может недооценивать влияние иммунной системы на прогрессирование заболевания, способность использовать человеческие клетки увеличивает переводимость таких исследований. Среди различных моделей ксенотрансплантатов, системные инъекции в хвостовую вену легче всего выполнить, но они опускают начальные этапы клеточного intravasation опухоли и уйти от основного сайта роста. ^7-12 С другой стороны, orthoto ПИК ксенотрансплантации, которая включает в себя инъекции опухолевых клеток в кости (бедренной кости, ребра) или мышц, является более технически сложными, но и более биологически отношение к раку человека. ^13-16 Тем не менее, в прошлом, высокая заболеваемость , связанная с быстрым ростом первичных опухолей часто требовали эвтаназии животных до развития метастазов. В данном исследовании мы использовали ранее установленную модель клеточных инъекций в икроножной мышцы с последующим удалением полученной первичной опухоли в сочетании с продольным мониторингом метастатической прогрессии с помощью МРТ. ^17,18 Такие инъекции в икроножной мышцы в непосредственной близости к большеберцовой кости позволяют для роста опухоли в двух природных средах - ES мышц и костей - и в результате отдаленных метастазов в местах , как правило , пострадавших в организме человека. ¹⁸ Таким образом, эта модель точно повторяет метастатического процессы , происходящие у больных ES во время прогрессирования заболевания.

палатка "> Локализация первичной опухоли в нижней задней конечности также облегчает точное управление кровоснабжения ткани опухоли. бедренную артерию лигирование (FAL) является хорошо отработанной технологией используется в исследованиях ангиогенеза, чтобы блокировать приток крови к дистальных отделах нога и исследовать васкуляризации тканей в ответ на ишемию. ^19,20 Важно отметить, что первоначальное снижение кровотока сопровождается залоговой открытия сосуда и реперфузии тканей наблюдается примерно через 3 дня после FAL. ²⁰ Таким образом, когда выполняется в несущей опухоль конечности, эта модель воссоздает гипоксия / реперфузии события , которые происходят естественным образом в быстро растущих опухолей и позволяет вылету метастатических опухолевых клеток вследствие восстановления перфузии к нижней задней конечности через вновь открытые коллатеральные сосуды. ²¹ Важно отметить, что эта процедура должна быть выполнена , когда размер опухоли достаточно мал, чтобы предотвратить чрезмерное гипоксию в контрольных опухолей (как правило, на несущей опухоль телячьей Volумэ 150 - 250 мм ^3), что обеспечивает значительные различия в уровнях опухоли гипоксии между контрольной и FAL-обработанных группах.

В дополнение к продольной мониторинга влияния гипоксии на ES задержки и частоты метастазов, эта модель также позволяет осуществлять сбор тканей и развитие новых клеточных линий из обоих первичных опухолей и метастазов. Важно отметить, что предыдущие работы было установлено, что метастазы полученные из клеточных линий демонстрировать повышенную метастатический потенциал по реинтродукции животных, что свидетельствует о том, что распространение опухоли связано с постоянными изменениями в формировании опухолевого фенотипа клеток, и, таким образом, проверки использования этих клеточных линий расшифровывать процессов метастазирования. ¹⁸ Итак , эти модели теперь могут быть использованы для генетических и молекулярных анализов , необходимых для идентификации индуцированных гипоксией метастатических путей.

Как гипоксии является про-метастатического фактор повышения пагубность различных тumors, наша модель может быть использована в качестве платформы для изучения роли гипоксии в других типах опухолей, которые естественным образом развиваются в конечностях, такие как остеосаркома и рабдомиосаркома. ^21-23 Кроме того, подобный подход может быть применен к злокачественных опухолей , растущих в других местах , с анатомическими четко определенного маршрута кровоснабжения. В конечном счете, модель может быть изменена, и ее полезность продлен, в зависимости от индивидуальных потребностей в области исследований.

протокол

Все процедуры были одобрены Институциональные уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.

1. Cell Подготовка к Ортотопическая Инъекции

1. ЭС клетки культуры человека в стандартных условиях. Используйте примерно одну 15-сантиметровым культуральный планшет, не превышающую 70% сплошности для инъекции 5 мышей.
   Примечание: Для данного исследования, СК-ES1 клетки культивировали в 5A среде McCoy с 15% фетальной телячьей сыворотки (FBS) на коллагене покрытых пластин и клеток TC71 культивировали в среде RPMI с добавлением 10% FBS и 1% 4- (2-гидроксиэтил ) -1-пиперазинэтансульфонова кислота (HEPES). Оба средства массовой информации были дополнены антибиотиками - пенициллином (100 ед / мл), стрептомицина (100 мкг / мл) и Fungizone (1 мкг / мл).
2. Промывают клетки ES с фосфатным буферным раствором (PBS) и Trypsinize на 70% слияния с 0,25% трипсина / этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в течение 5 мин.
3. Удалить клетки ES из пластины с клеточной культуры Mediа, затем центрифугировать в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре. Повторное приостановить клеток ES в 10 мл холодного PBS, а затем подсчитывают количество клеток.
4. Центрифуга ЭС клетки в течение 5 мин при 200g при комнатной температуре, а затем вновь приостановить на 2 х 10 ⁷ (SK-ES1) или 10 ⁷ (TC71) клеток на мл в холодном PBS. Держите конечной суспензии клеток на льду во время выполнения инъекций.

2. Ортотопическая инъекция ЭС клеток в икроножной мышцы

1. Используйте 4-6 недельных самок SCID / бежевых мышей.
2. Для того, чтобы придать ЭС клеток, мягко держать мышь и стабилизировать свою левую ногу между четвертым и пятым пальцами, обнажая медиальной стороны нижней задней конечности.
3. С помощью иглы 28 G ½, вводят 0,1 мл предварительно приготовленной суспензии клеток, содержащей либо 2 х 10 ⁶ (SK-ES1) или 10 ⁶ (TC71) ES клеток в икроножной мышцы (фиг.2А).
   Примечание: Хотя максимальный объем для внутримышечного инъекцections, как правило, 0,05 мл, для этой конкретной процедуре, увеличение объема до 0,1 мл необходимо из-за большого количества клеток вводили. Эта процедура была одобрена Institutional уходу и использованию животных комитета Джорджтаунского университета по.
   1. Вставьте иглу в икроножной мышцы кпереди примерно в 30 - под углом 45 градусов в направлении гребня большеберцовой кости / бугра.
   2. Слегка снять иглу, как только она касается гребня большеберцовой кости / бугристости. Медленно вводят раствора клеточной суспензии, постепенно извлечение иглы для сброса давления.
4. Мониторинг вводили мышам в течение ближайших 24 часов на признаки бедствия.
   Примечание: Исследователи с меньшим опытом в обработке животных следует рассмотреть вопрос о обезболивающее мышей для инъекций опухолевых клеток. Некоторые учреждения могут потребовать анестезии по соображениям безопасности.

3. Мониторинг роста первичной опухоли

1. Контролировать рост первичных опухолей dAily, пока размер опухоли не достигнет желаемого объема.
   Примечание: В настоящем исследовании, объем теленок 250 мм ^3, использовали в качестве отправной точки эксперимента (Фигура 2В). Как правило, она занимает около 1 - 2 недели для опухоли, чтобы достичь такого размера.
   1. Измерьте размер теленка ежедневно с цифровыми измерителями через его медиальной-боковых и передне-задней длины.
   2. Определить объем теленка по формуле (Д ж ^ ^2/6) х 3,14, где D является более длинный диаметр и d является более короткий диаметр несущих опухоль нижней задней конечности.
      Примечание: Размер нормального теленка взрослых мышей составляет приблизительно 40 - 50 мм ^3. Его объем будет увеличиваться за счет роста опухоли и на более поздних стадиях теленок будет в основном состоит из опухолевой ткани.

4. бедренной артерии Лигирование (FAL) для индуцирования гипоксией в условиях опухолевого роста задних конечностей

1. Подготовьте хирургические инструменты, необходимые для этой операции: текущвед или заостренные тонким пинцетом, заостренные щипцы, хирургические ножницы и держатель иглы. Стерилизовать эти инструменты перед операцией с использованием автоклава или горячего шарика стерилизатор. Кроме того, есть прекрасные ватные тампоны готовы к этой операции.
   Примечание: Рекомендуется, чтобы инструменты повторно стерилизуют при кончиков по мере необходимости во время процедуры.
2. Вводят анальгетика (Карпрофен 5 мг / кг) подкожно (SQ). Для того, чтобы обнаружить и подтвердить, гипоксию, впрыснуть hypoxyprobe-1 (pimonidazole, 60 мг / кг).
   Примечание: Эта доза соответствует 1,5 мг на мышь и достигается путем инъекции 0,1 мл 15 мг / мл раствора hypoxyprobe в PBS внутрибрюшинно (IP). Hypoxyprobe затем обнаруживается посмертных в тканях животных с помощью иммуногистохимии.
3. Поместите мышь в наркоз индукционной камере, содержащей 3 - 5% изофлуран в 100% кислорода, при скорости потока 1 л / мин.
4. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное из Induction камера. Поместите животное в положении лежа на спине на стерильной драпировки расположен на вершине согревающей площадку на рабочей поверхности. Используйте носовой конус, чтобы подключить его к непрерывному потоку 1 - 3% изофлуран в 100% кислорода при расходе 0,8 л / мин.
   1. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы. Тщательно депилировать хирургическую область, нанесите крем для удаления волос, оставляя его на коже в течение не более 10 сек. Затем вытрите крем для удаления волос с использованием этанола подготовительную площадку.
5. Расширить и закрепить задней конечности с куском ленты примерно 45 градусов от средней линии мыши. После того, как задних конечностей безопасно, протереть пораженный участок кожи с 10% повидон / йода тампоном / раствор, затем этанолом, повторяя еще два раза каждый. В течение оставшейся части хирургической процедуры, использовать стерео микроскоп для получения увеличенного изображения области задней конечности.
6. Используя острые щипцы и хирургические ножницы, надрезать в скв, длиной около 1 см, от середины бедра по направлению к паховой области. Использование засоленных увлажненных тонкой ватные тампоны, аккуратно смахнуть подкожно-жировой ткани вокруг мышцу бедра.
7. Тщательно выявить основные бедренной артерии с помощью тупой диссекции через подкожной жировой ткани. Стабилизировать рану и операционное поле, чтобы выставить сосудистую верхне-средней части приводящей мышцы.
8. Использование тонких щипцов, осторожно прокалывают через мембранозной бедренной оболочки подвергать сосудисто-нервного пучка. С помощью чистого набора тонких щипцов, рассекают и отделяют бедренную артерию из бедренной вены и нерва на проксимальном месте вблизи паховой области, дистальный к паховой связкой. Соблюдайте осторожность, чтобы избежать прокалывания бедренной вены стенки.
9. После рассечения, пройти прядь 6-0 шелковой нити под бедренную артерию и дистальнее ветви латеральной огибающей бедренную артерию (LCFA). Закупоривать бедренной артерии с использованием двойных узлов (рисунок 3).
10. Закрыть разрез с помощью 6-0 полипропиленовых наложения швов. После закрытия надрез, вводят SQ 0,5 мл теплого физиологического раствора для баланса жидкости терапии. Место животное на вершине завернуто теплой площадку в клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
11. Наблюдение за животными в течение первых 6 ч после операции и вводят анальгезирующее средство (Carprofen 5 мг / кг, SQ) каждый день в течение 3-х дней. Удалить швами 10 дней после операции с использованием стерильных ножниц.

5. Первичная Опухоль Иссечение по ампутации ноги

Примечание: ампутацию несущих опухоль нижнего задней конечности , когда размер теленок достигает 250 мм ³ для контрольной группы , или через 3 дня после FAL для гипоксического группы.

1. Бритье волос от несущей опухоль конечности от дистальной большеберцовой кости к тазовой области с машинки для стрижки волос, осторожно держа животное. Вводят анальгетика (Carprofen 5 мг / кг, SQ) перед процедурой.
2. Поместите мышь в анестезии индукции чянтарный, содержащий 3 - 5% изофлуран в 100% кислорода, при скорости потока 1 л / мин. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры.
3. Место животное в правом боковом лежачем положении на стерильной драпировки, помещенном на согревающего площадку на своей рабочей поверхности. Используйте носовой конус, чтобы подключить его к непрерывному потоку изофлюрана 1 - 3% в 100% кислорода при расходе 0,8 л / мин. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы
4. Подготовьте место операции с использованием 10% повидон / йода тампон / раствор, затем этанолом, с повторением 3 раза. Нанесите стерильную марлю (например, хирургическое драпировку) над мышью , чтобы получить стерильный операционного поля.
5. Сделать средней бедренной кости окружную разрез кожи, а затем тупым и втягивание кожи проксимальнее. Выставляют медиальной бедренной кости сосудисто-нервный ножку на срединный стороне ноги, а затем перевязатьрядом с паховой связки с использованием 4-0 с покрытием (полиглактином 910) рассасывающийся шовный материал.
6. Выполните середины бедренной рассечение мышечных групп с ножницами, а затем тупым рассечением мягких тканей до тазобедренного сустава. Используя резак кости, выполнить середины бедренной остеотомии. С помощью стерильной тонкой ватным тампоном или губкой впитывающийся желатина, слегка нажмите на сайт остеотомии, чтобы свести к минимуму и предотвратить кровотечение.
7. Закройте покрывающей кожи с помощью хирургической раны клипов и вводят 0,5 мл теплого солевого баланса SQ для инфузионной терапии. Место животное на вершине завернуто теплой площадку в клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
8. После операции, собирают образцы тканей от первичных опухолей для РНК, ДНК или выделения белка, оснастки заморозить в жидком азоте и хранят при -80 ° С. Для получения первичной культуры клеток, собирают образцы ткани на этом этапе, как это описано в разделе 9 ниже. Закрепить оставшиеся ткани конечности в 10% нейтральном буферном формалине для гистологии и immunochemisпопробуйте, включая обнаружение hypoxyprobe-1.
9. Монитор животных для передвижения, боли и потребления пищи в течение первых 6 часов после операции, а затем каждый день в течение 3-х дней. Вводят анальгетика (Carprofen 5 мг / кг, SQ) ежедневно в течение 3-х дней. Удалить раны клипы через 10 дней после ампутации, используя для удаления Рана клипа.

6. Мыши для мониторинга наличия метастазов

1. Обратите внимание на мышей ежедневно, и оценивать их для клинических признаков метастазирования, по крайней мере два раза в неделю.
   1. Обратите внимание животных на наличие macrometastases, представляющих как массы, которые развиваются в различных местах, как правило, плечи контралатеральной ноги и челюсти. С этой целью, тщательно ощупывать головы, шеи и области подмышек и контралатеральной задних конечностей. Проверьте наличие метастазов внутренних органов через вздутие живота наряду с МРТ сканирования.
   2. Проверка на наличие метастазов в легких путем нажатия мечевидный отросток (нижний конец грудины) с незах пальцев. ²⁴
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это давление уменьшает диафрагменное способность дыхания. Мыши с развитыми метастазами в легкие признаки дыхательной недостаточности проявляется кропотливой дыхания.
   3. Наблюдать за животными для неврологических симптомов, таких как паралич ног и атаксия предлагая метастазы в центральную нервную систему.
   4. Монитор мышей по крайней мере один раз в неделю для потери веса, как признак прогрессирования потенциального заболевания. Тело потеря веса более чем на 15% от предварительно процедурного веса считается гуманным конечной точки.

7. Магнитно-резонансная томография (МРТ) для обнаружения Метастазы

1. Выполните МРТ для обнаружения метастазов в требуемых временных точках. ¹⁸
   Примечание: В данном исследовании был использован горизонтальный спектрометр 7-Тесла. МРТ проводили в дни 15 и 35 после ампутации для клеток SK-ES1 и на 15-й день для TC71 клеток.
2. Поместите мышь в анестезии индукции ChambeR, содержащий 1 - 3% изофлуран в газовой смеси 30% кислорода и 70% закиси азота.
3. Оставьте мышь в индукционной камере до тех пор, пока не реагирует на внешние раздражители. Затем удалите животное от индукции камеры.
4. Передача под наркозом мыши на стереотаксической держатель с дыханием и температуры monitorization с непрерывным введением 1,5% изофлуран и 30% закиси азота. Применяют стерильные немедикаментозным глазной мази для каждого глаза, чтобы предотвратить сухость роговицы. Изображение животного или в 40 или 23 мм Bruker объема мыши катушки для всего тела или визуализации головного мозга, соответственно в.
5. Используйте двумерную, T2-взвешенные RARE последовательность: TR = 3000 мсек, TE = 24 мс, матрица = 256, FOV = 4,35 х 3,0 см, толщина среза = 0,5 мм, Rare коэффициент = 4 и средние = 4. ¹⁸
6. Поместите животное в теплой клетке восстановления и непрерывно контролировать до бодрствования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши быстро восстанавливаться, так как неглубокий плоскость анестезии используется.
7. Наблюдение за животными в течение первых 6 часов после того, как изображения, чтобы убедиться, что нет никаких побочных эффектов анестезии.

8. Эвтаназия и аутопсия

1. Усыпить мышей один раз животных, присутствующих с метастазами обнаруживаемых с помощью МРТ и / или клинических симптомов прогрессирования заболевания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании мышей умерщвляли в дни 50 и 25 после ампутации для животных, несущих SK-ES1 и TC71 ксенотрансплантаты соответственно. В некоторых случаях, ранее эвтаназии было необходимо из-за высокой заболеваемостью метастаз.
2. Усыпить мышей под воздействием CO ₂ на уровне 1,5 л / мин (CO ₂ на 10 - 30% от эвтаназии камеры объем / мин). Для обеспечения гибели животных, выполнять шейки дислокации после воздействия CO _2.
3. Спрей всю мышь с 70% этанола и поместить его в ламинарный. Собирают кровь путем сердечной пункции с помощью иглы 25 G ½ с 1 мл шприца и передачи сбора крови втбыть, содержащий 2 мг ЭДТА.
4. Соберите следующие ткани: селезенка, надпочечники, яичники, почки, печень, легкие, мозг, правая нога, костный мозг от обоих плечевые кости и позвоночника, а также макроскопических метастазов, присутствующих в других местах. ^25,26
5. Закрепить половину каждой ткани в 10% нейтральном буферном формалине для гистологии и иммунохимии, включая обнаружение hypoxyprobe-1. Привязка заморозить другую половину в жидком азоте, а затем хранят при -80 ° С для РНК, ДНК или белка изоляции. ^25,26 Для получения первичной культуры клеток, собирают образцы ткани , как описано в разделе 9 ниже.

9. Первичные культуры клеток

1. Для выполнения первичной культуры клеток, рассекают ткани от ампутированной конечности (раздел 5 выше), или во время аутопсии (раздел 8 выше) в стерильных условиях в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.
2. Подготовка среды для культивирования клеток, подходящие для клеточной линии, используемой для ортотопических инъекций, с добавлением пенициллина (200 ед / мл),стрептомицин (200 мкг / мл), Fungizone (1 мкг / мл), и 0,2% Mycoplasma профилактический антибиотик. Поместите 2,5 мл среды первичной культуры в 6-см клеточной культуральный планшет.
3. Выберите жизнеспособные участки опухоли тканей от первичных опухолей или метастазов, а затем изолировать от двух до трех сегментов на 2-3 мм каждый с помощью стерильных ножниц.
   Примечание: жизнеспособные ткани опухоли обычно находится на краях опухоли и может быть различен с некрозом ее розоватого или красноватого цвета, значительный блеск и общий внешний вид влажного. В противоположность этому, некротические ткани обычно наблюдается в центре опухоли и представляет в виде беловато-кремового цвета / массы с тусклым, сырный внешний вид. ²⁷
4. Перенесите выделенные сегменты в 6-см для культивирования клеток планшет, содержащий первичную культуральную среду, описанную в шаге 9.2.
5. Культуры клеток при стандартных условиях, как описано в разделе 1 (примечание) и 9.2. ^18,28 Проверьте культуру для клеточного выроста , вытекающий из кусочков ткани, ВГIch должны наблюдаться в течение нескольких дней. После того, как клетки достигают слияния, Trypsinize и распространять их в соответствии со стандартными методами культивирования клеток.
   Примечание: Первичная культура клеток может быть в дальнейшем использован для оценки роста и метастатических свойств клеток, полученных из контрольных и гипоксических опухолей, а также их молекулярных характеристик, как было описано выше. ¹⁸

Результаты

После инъекции ES клеток в икроножной мышцы, первичные опухоли могут расти до размера теленка 250 мм ³ (фиг.1, 2). Время, необходимое для опухолей, чтобы достичь этого объема, как правило, находится в диапазоне от 10 - 15 дней для TC71 до 20-25 дней для SK-ES1 ксенографтов...

Обсуждение

Наша модель предполагает сравнение метастаза в двух экспериментальных группах - контрольной группы, где опухоли разрешено развиваться в задней конечности с последующей ампутацией при достижении объема теленка 250 мм ^3, и гипоксия-облученной группе, в которой tumor- подшипник задней ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SK-ES1 Human Ewing sarcoma (ES) cells	ATCC
TC71 Human ES cells			Kindly provided from Dr. Toretsky
McCoy's 5A (modified) Medium	Gibco by Life Technologies	12330-031
RPMI-1640	ATCC	30-2001
PBS	Corning Cellgro	21-040-CV
FBS	Sigma-Aldrich	F2442-500mL
0.25% Trypsin-EDTA (1x)	Gibco by Life Technologies	25200-056
Penicillin-Streptomycin	Gibco by Life Technologies	15140-122
Fungizone® Antimycotic	Gibco by Life Technologies	15290-018
MycoZap™ Prophylactic	Lonza	VZA-2032
Collagen Type I Rat tail high concetration	BD Biosciences	354249
SCID/beige mice	Harlan or Charles River	250 (Charles River) or 18602F (Harlan)
1 ml Insulin syringes with permanently attached 28 G ½ needle	BD	329424
Saline (0.9% Sodium Chloride Injection, USP)	Hospira, INC	NDC 0409-7984-37
Digital calipers	World Precision Instruments, Inc	501601
Surgical Tools	Fine Science Tools
Rimadyl (Carprofen) Injectable	Zoetis
Hypoxyprobe-1 (Pimonidazole Hydrochloride solid)	HPI, Inc	HP-100mg
hypoxyprobe-2 (CCI-103F-250 mg)	HPI, Inc	CCI-103F-250mg
Povidone-iodine Swabstick	PDI	S41350
Sterile alcohol prep pad	Fisher HealthCare	22-363-750
LubriFresh P.M. (eye lubricant ointment)	Major Pharaceuticals	NDC 0904-5168-38
VWR Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier	VWR	56617-014
Oster Golden A5 Single Speed Vet Clipper with size 50 blade	Oster	078005-050-002 (clipper), 078919-006-005 (blade)
Nair Lotion with baby oil	Church & Dwight Co., Inc.
Silk 6-0	Surgical Specialties Corp	752B
Prolene (polypropylene) suture 6-0	Ethicon	8680G
Vicryl (Polyglactin 910) suture 4-0	Ethicon	J386H
Fisherbrand Applicators (Purified cotton)	Fisher Scientific	23-400-115
GelFoam Absorbable Dental Sponges - Size 4	Pfizer Pharmaceutical	9039605
Autoclip Wound Clip Applier	BD	427630
Stereo Microscope	Olympus	SZ61
Autoclip remover	BD	427637
Aound clip	BD	427631
MRI 7 Tesla	Bruker Corporation
Paravision 5.0 software	Bruker Corporation
CO2 Euthanasia system	VetEquip
25 G 5/8 Needle (for heart-puncture)	BD	305122
0.1 ml syringe (for heart-puncture)	Terumo	SS-01T
K3-EDTA Micro tube 1.3 ml	Sarstedt	41.1395.105
10% Neutral Buttered Formalin	Fisher Scientific	SF100-4