Получение CD4<sup&gt; +</sup&gt; Т-клеток для анализа GD3 и GD2 Ганглиозид Мембранная Expression микроскопией

Резюме

Описан стандартный протокол с использованием меченых антител для применения в микроскопии для определения экспрессии мембранного и локализации ганглиозидов в состоянии покоя , а также активированные человека наивных CD4 ⁺ Т - клеток. Также описаны в режиме реального времени эксперименты с использованием ПЦР <40000 клеток, которые не требуют дополнительных комплектов низкого входного РНК.

Аннотация

Описанные здесь способы для активации наивных CD4 ⁺ Т - клеток в суспензии и их соблюдение в покровные для конфокальной микроскопический анализ позволяют пространственную локализацию и визуализацию ганглиозидов , участвующих в активации CD4 ⁺ Т - клеток, что экспрессия комплемента профилирование эксперименты , такие как проточная цитометрия, вестерн блоттинга или ПЦР в реальном времени. Количественное выражение ганглиозидов через проточной цитометрии и их клеточной локализации с помощью микроскопии может быть получена при использовании анти-ганглиозидов антител с высоким сродством и специфичностью. Тем не менее, адекватная обработка клеток в суспензии включает обработку культуры пластин для содействия необходимой для соблюдения требуемой флуоресценции или конфокальной микроскопии приобретения. В этой работе мы опишем протокол для определения экспрессии ганглиозидов GD3 и GD2 и колокализацию с TCR во время активации наивных CD4 ⁺ Т - клеток. Кроме того, в режиме реального тЭксперименты IME ПЦР с использованием <40000 клеток описаны для определения GD3 и генов-синтазы GM2 / GD2, демонстрируя, что эксперименты генного анализа могут быть выполнены с низким числом клеток и без необходимости дополнительных комплектов низкого входного РНК.

Введение

CD4 ⁺ Т - клетки оркестровать иммунный ответ через свои эффекторные функции после активации антигенпрезентирующих клеток ^1. Изучение клеточных механизмов, которые модулируются при активации позволяет понимание основного процесса иммунной функции. Тем не менее, исследование наивных CD4 ⁺ Т - клеток может быть сложным , так как они представляют собой очень небольшую популяцию клеток в крови периферии ^2.

С помощью флуоресцентной микроскопии несколько сообщений изучали локализацию различных молекул , участвующих в активации CD4 ⁺ Т - клеток, в основном белки , связанные с плазматической мембраной ^3. Ганглиозиды являются сиаловой кислоты , содержащие гликосфинголипиды и , хотя они были широко изучены в нервных клетках , где они в изобилии, другие клетки , такие как клетки иммунной системы также выражают ганглиозиды биологически соответствующими функциями ^4,5. Ранее мы сообщали ТНАт при активации человека наивных CD4 ⁺ Т - клеток существует повышающая регуляция в α2,8 сиалилтрансфераза ST8Sia 1 (GD3 - синтазы) и синтазы GM2 / GD2, которые вызывают значительную поверхность neoexpression из GD2 и повышающая регуляция GD3 ганглиозида ^6. Дальнейшее изучение GD3, GD2 и других ганглиозидов в иммунных клетках необходимо дополнить на основе протеина частичный вид функции иммунной системы.

Как правило, изучение экспрессии ганглиозидной основывается на таких методов, как тонкослойная хроматография (ТСХ) ^7, но этот метод не позволяет пространственной локализации ганглиозидов на плазматической мембране или в субклеточных отсеков, ограничивая биологический анализ.

В этой работе мы опишем протокол для идентификации антител-опосредованной и локализации GD3 и GD2 ганглиозидов в человеческих наивных CD4 ⁺ Т - клеток и МКПК после анти-CD3 / активации анти-CD28. С помощью этого протокола это яТакже возможно анализировать ген и молекулярную экспрессию ганглиозидов в низком количестве клеток в суспензии, с приобретением высококачественных изображений ^6, принимая во внимание небольшой размер лимфоцитов (9 мкм).

протокол

Периферической крови у здоровых доноров-мужчин была получена с информированного согласия и одобрения комитета по биоэтике Centro де Investigación эн DINAMICA Celular- Автономного университета дель Estado-де-Морелос.

1. Выделение и активация человеческих Наивные CD4 ⁺ Т - клеток

1. Собирают 2 мл периферической крови, полученной от здоровых доноров путем информированного согласия и разбавляют 2 мл стерильной PBS-ЭДТА (1x забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS), 2 мМ ЭДТА, рН 7,4). Добавляют разбавленную кровь медленно поверх 3 мл раствора сахарозы с плотностью 1,077 , как было описано ранее ^8.
   Примечание: Дифференциальный миграция во время центрифугирования, вызванное различиями в плотности вызывает Эритроциты осаждаться полностью и слой менее плотных мононуклеаров сформирует выше. 2 мл периферической крови будет оказывать примерно 0,5 × 10 ⁶ наивных CD4 ⁺ Т - клеток после purificatiпо шагам.
2. Центрифуга 30 мин при 250 х г при 21 ° С (использовать ротор для круглых труб дно с фиксированным углом 30 мм), без перерыва, чтобы сформировать градиент мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК). После центрифугирования РВМС можно ясно наблюдать в виде белого кольца. Собирают МНПК с помощью пипетки и переносят в стерильную пробирку для промывки.
3. После трех промывок раствором PBS-ЭДТА при 250 мкг в течение 10 мин приступить к очистке наивных CD4 ⁺ Т - клеток. Сортировка методов или несколько видов комплектов очистки доступны для этой цели. Предпочтительно использовать> 1 х 10 ⁷ МНПК для очистки.
   1. Очищают наивных CD4 ⁺ Т - клетки путем негативной селекции с использованием магнитных шариков. Выполните негативный отбор с анти CD45RO, CD8, CD14, CD15, CD16, CD19, CD25, CD34, CD36, CD56, CD123, анти-TCRγ / б, анти-HLA-DR и CD235a (гликофорина А) антител. Оценить процент чистоты путем определения CD4 + CD45RA + клеток через Fнизкая цитометрии.
      Примечание: По желанию, перейти к инкубации РВМС в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ с плотностью 1 × 10 ⁶ клеток / мл в 10 мл дополненной среде для содействия присоединению моноцитов и продолжить очистку наивных CD4 ⁺ Т - клеток. Эффективное восстановление наивные CD4 ⁺ Т - клеток из периферической крови в значительной степени зависит от системы очистки.
4. Подготовка 24-луночные планшеты для культивирования клеток добавлением 250 мкл на лунку PBS с добавлением 5 мкг / мл анти-CD3 моноклональными антителами и инкубировать в течение по крайней мере 2 ч при 37 ° С.
   Примечание: можно использовать планшеты с 96 лунками , когда меньшее число из наивных CD4 ⁺ Т - клеток используются (например, 2 x10 ⁴ -1 × 10 ^5).
5. Удалить анти CD3 антитела разбавления из 24 скважины или 96-луночные планшеты и мыть тарелки в два раза с использованием стерильного 1x PBS.
6. Развести наивных CD4 ⁺ Т - клеток с> 95% чистоты (CD4 +CD45RA +) до плотности 1 × 10 ⁶ клеток / мл в продвинутой среде RPMI 1640 среде с 3% фетальной бычьей сыворотки (или среду RPMI с добавлением 10% сыворотки), 2 мМ глутамина и антибиотиками (1 ед / мл пенициллина, 1 мкг / мл стрептомицина).
   Примечание: Если локализация ганглиозидов требуется в МНПК, по тому же протоколу для разбавления и стимуляции, как описано ниже.
7. Добавьте 500 мкл клеточного разведения в анти-CD3 лунках, покрытых и непокрытых скважин (контрольные клетки) в 24-луночного планшета. В качестве альтернативы, добавить 100 мкл клеточного разведения в лунки 96-луночного планшета.
8. Выполните условия стимуляции наивных CD4 ⁺ Т - клеток в анти - CD3 лунках , покрытых добавлением 1 мкг / мл анти CD28 антитела.
9. Держите отдыхавших CD4 ⁺ Т - клеток в качестве контроля в непокрытые лунки без добавления анти - CD28 антител. Выдержите в состоянии покоя и активированный CD4 ⁺ Т - клеток при 0 до 72 ч при стандартных условиях 37 ° СС и 5% СО _2.
10. Для проверки адекватной активации оценить с помощью проточной цитометрии экспрессии CD69 ранней активации маркера (16 ч после активации) или CD25 , поздно маркер активации (48 часа после активации) в состоянии покоя и активированные наивные CD4 ⁺ Т - клетки инкубировали при 37 ° C и 5% СО ₂ в отсутствие или в присутствии анти CD3 / CD28 - антителами ^9,10.

2. Приверженность отдыхавших и активированные Наивные CD4 ⁺ Т - клеток

1. Стерилизовать 12 мм круглые покровные автоклавированием и воздействия ультрафиолетового света в течение по крайней мере 15 мин.
2. Место покровные в стерильной 24-луночный культуральный пластин.
   Примечание: Для культур с менее 1 × 10 ⁵ клеток предпочтительно использовать Боковую камеры с адаптированными небольших скважин для предотвращения рассеивания клеток в покровное.
3. Coat покровные (или слайд-камера) с 200 мкл поли-L-лизина (молекулярная масса 150-300 кД) 0,1% (вес / объем) раствора и инкубировать в течение 5 мин при гтемпература ООМ (RT), удалите и сухой в течение по крайней мере 1 час при комнатной температуре.
4. Тщательно перемешать и собирать отдыхавших и активированные наивные CD4 ⁺ Т - клеток из 24-луночные планшеты. Граф клеток и при необходимости регулировать свежей дополненной среде для передачи 1 х 10 ⁵ клеток к поли-L-лизином покровные с покрытием. Инкубируйте клетки в течение как минимум 6 часов при температуре 37 ^° С и 5% CO _2.

3. Сбор и фиксация покоящихся и Активированный Наивные CD4 ⁺ Т - клеток

1. Осторожно удалите среду из культивированного отдыха и активированных наивных CD4 ⁺ Т - клеток.
2. Добавить 500 мкл RT стерильного PBS медленно.
   Примечание: Осторожное добавление и удаление растворов из скважин препятствует отделению клеток от покровного.
3. Откажитесь от PBS и добавить еще 500 мкл PBS, чтобы полностью удалить культуральной среды.
4. Закрепить клетки путем добавления 500 мкл фильтруется 4% параформальдегида (ФИЛТРРацион удаляет микрочастицы, которые могут препятствовать микроскопический анализ) и инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре (предпочтительно) или в течение ночи при 4 ° С.
   Внимание: параформальдегид является токсичным и летучим соединением. Известно, что человеческий канцероген. Соблюдайте осторожность при обращении с соответствующим протоколом безопасности.
5. Удалите закрепитель и мыть по крайней мере, дважды PBS при комнатной температуре.
6. Переход к следующему шагу или поддерживать лунок планшета с 500 мкл PBS при 4 ° С в течение нескольких дней, пока окрашивания.
   Примечание: Стерильность во время этого процесса помогает избежать роста микроорганизмов.

4. Окрашивание, Монтаж и визуализация с помощью конфокальной микроскопии

1. Удалите PBS из лунок. Добавьте 500 мкл буфера для холодной блокировки (1X PBS, 0,5% стандартный сорт бычьего сывороточного альбумина, 1% фетальной бычьей сыворотки, рН 7,4). Инкубировать в течение 20 мин на льду.
2. Осторожно удалите блокирующий буфер и добавить первичные антитела (анти ганглиозидов GD3 клон R24, GD2 клон 14G2a),РЕ-конъюгированными анти CD25 и АРС-конъюгированные анти ТКС и изотипы управления разведенного в блокирующем буфере до 2,5 мкг / мл.
3. Выдержите 2 ч на льду или в течение ночи при 4 ° C.
   Примечание: Медленное орбитальное перемешивание является предпочтительным.
4. Удалите антитела осторожно и медленно добавьте 500 мкл PBS. Повторите дважды.
5. Добавить вторичные антитела (FITC конъюгированными антителами против IgG3 для R24 анти GD3, Alexa Fluor 488-конъюгированные или Alexa Fluor 647-конъюгированные анти IgG2a для 14G2a анти GD2), разведенного в блокирующем буфере до 0,1 мкг / мл.
6. Выдержите в течение 1 часа на льду в темноте без встряхивания.
7. Вымойте три раза в PBS, как описано в 4.4). Хранить лунки с достаточным количеством PBS, чтобы избежать обезвоживания проб.
8. Добавить Hoechst 333258 пятно разбавленный в PBS до 0,1 мкг / мл.
9. Выдержите 15 мин при комнатной температуре и удалить. Промыть три раза в PBS.
10. Поместите слайды на бумажное полотенце и добавить 20 мкл раствора монтажного (50% глицерина в PBS) или коммерческого монтажа раствораs, чтобы избежать выцветания и закалки от образцов.
11. Осторожно поднимите покровное с мелкими пинцетом и поместить его на монтажный раствор. Убедитесь, что сторона покровное где прикрепляются клетки находится в контакте с раствором. Уплотнение покровные с лаком для ногтей и анализируют с помощью флуоресценции или конфокальной микроскопии.

5. Выделение РНК

1. Готовят анти CD3 антитела (5 мкг / мл) с покрытием 96-луночные планшеты. Выдержите 4 х 10 ⁴ наивных CD4 ⁺ Т - клеток / лунку в 100 мкл дополненной культуральной среды с анти CD28 антителом (1 мкг / мл) , чтобы завершить стимул. Инкубировать при 37 ° С и 5% СО ₂ в течение от 0 до 72 ч.
2. После того, как различные промежутки времени после активации поместить клетки в микроцентрифужных трубки.
3. Добавьте 500 мкл PBS и центрифугировать при 250 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре.
4. Удалить супернатант и добавьте 1 мл реагента тризола.
5. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре и хранить пробу при -8076 ° С в течение по меньшей мере 24 ч. Продолжить с выделением РНК при необходимости.
   Примечание: Выход из образца при -80 ° С в течение по меньшей мере 24 ч улучшает выход РНК. Кроме того, использование ручных перчаток имеет важное значение для предотвращения деградации РНК с помощью РНКазы.
6. Размораживание образца путем инкубации при температуре 37 ° С в течение 2 мин на водяной бане.
7. Добавить 200 мкл хлороформа и энергично встряхивают вручную в течение 30 сек (чтобы избежать агрессивного смешения РНК путем встряхивания). Инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
8. Центрифуга 15 мин при 12000 х г при 4 ° С.
9. Восстановление водной фазы в новую пробирку микроцентрифужных.
10. Добавьте 500 мкл изопропанола и Переверните пробирку три раза.
11. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре и центрифугируют в течение 10 мин при 12000 х г при температуре 4 ° С.
12. Удалите супернатант путем инверсии.
13. Добавляют 1 мл охлажденного льдом 75% этанола и центрифугировать 10 мин при 12000 х г при температуре 4 ° С.
14. Полностью отбросить супернатант и высушить осадок РНК, оставив крышку трубки открытой.
    Нее: На данный момент Таблетку не ясно виден. Все равно продолжайте.
15. Ресуспендируют осадок в 20 мкл воды класса молекулярного. Вычислить концентрации и чистоты нуклеиновых кислот путем измерения 260 нм и 280 нм, используя оптическую плотность NanoDrop.
16. тщательно Переходим к синтезу кДНК с использованием любого обычного обратного набора транскриптазы и после постав-протокола.
    Примечание: Приблизительно 0,5-2 мкг РНК получают из 4 - х 10 ⁴ наивных CD4 ⁺ Т - клеток. кДНК может быть синтезирован из 100 нг РНК и использовали в ПЦР в реальном времени реакции без необходимости низкой РНК входных наборов.

Результаты

Протокол , описанный в этой рукописи оказывает хорошее качество культивируют и приклеенный отдыхавших и активированные человека наивных CD4 ⁺ Т - клеток (рис 1). Активированные CD4 ⁺ Т - клетки обнаруживают характерную пролиферативный профиль (Фиг?...

Обсуждение

Описанный протокол может быть использован для локализации ганглиозидов или белков в суспензии клеток CD4 ⁺ Т - клеток или других клеток иммунной системы (например, PMBCs, рисунок 5) , начиная с небольшого числа клеток. Из-за небольшого размера Т-клеток и не-адгезивных свой?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	12633-012	Suplemented with 3% FBS
mouse anti human CD3 antibody	eBioscience	16-0037-81	OKT3 clone
mouse anti human CD28 antibody	ebioscience	16-0288-81	CD28.6 clone
mouse anti human GD3  antibody	Abcam	ab11779	R24 clone
mouse anti human GD2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-53831	14G2a clone
FITC-conjugated anti-mouse IgG3 antibody	Abcam	ab97259
Alexa Fluor 488 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21131
IgG2a antibody
Alexa Fluor 647 conjugated antimouse	Thermo Fisher Scieni¡tific	A-21241
IgG2a antibody
Hoechst 333258	Sigma-Aldrich	861405
Ficoll Paque-Plus	GE	17-1440-02
Trizol Reagent	Invitrogen	15596-026
Naive CD4+ T Cell Isolation Kit II, human	MACS Miltenyi Biotec	130-094-131
BD FACSAria II	BD Biosciences		Sorting
Nunc Lab-tek chamber slide system	Sigma-Aldrich	C7182
Olympus FV 1000 Laser Confocal Microscope (Olympus)	Olympus		Upright BX61WI and IX81
Forward sequence primer GD3 synthase	5´-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GD3 synthase	5´-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3´		Ref. 7
Forward sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-CAACACAGCAGACACAGTCC-3´		Ref. 7
Reverse sequence primer GM2/GD2 synthase	5´-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3´		Ref. 7