Индукция ускоренного атеросклероза у мышей: модель "Wire-Injury"

Резюме

Это исследование описывает инвазивную процедуру для индукции ускоренного атеросклероза у мышей. По сравнению с другими методами, использующими электрические или крио-индуцированные травмы, механически-индуцированной травмы имитирует состояние человека restenosis после реваскуляризации терапии и идеально подходит для изучения молекулярных механизмов участие.

Аннотация

Атеросклероз является пролиферативным фибро-воспалительным заболеванием, развивающимся в артериальной стенке, вызывая дефицит кровотока или недостаток кровотока. Кроме того, при разрыве дефектной сосудистой стенки атеросклероз вызывает окклюзионное образование тромба, которое является основной причиной инфаркта миокарда или инсульта и наиболее частой причиной смерти. Несмотря на достижения в области сердечно-сосудистой системы, многие вопросы остаются без ответа, и дополнительные фундаментальные исследования необходимы для улучшения нашего понимания молекулярных механизмов во время атеросклероза и его последствий. Из-за ограниченных клинических исследований, существует необходимость в репрезентативных животных моделей воссоздания атеросклеротических условий, таких как образование неоинтимы после имплантации стента, воздушный шар ангиопластики, или эндартерэктомии. Так как мышь представляет много преимуществ и является наиболее часто используемой моделью для изучения молекулярных процессов, текущее исследование предлагает инвазивную процедуру эндотелиальной денуляции, также известную как модель травмы проволоки, которая является репрезентативной человеческого состояния формирования неоинтимы в артериях после процедур реваскуляризации.

Введение

Атеросклероз является основной патологией, лежащей в основе сердечно-сосудистых событий, таких как инфаркт миокарда или инсульт. Основными механизмами, запускающих острые сердечно-сосудистые синдромы, являются разрыв бляшек, поверхностная эрозия и образование тромбов. Есть несколько клинических ситуаций, связанных с развитием бляшки: родной атеросклеротический налет, рестеноз после эндартерэктомии, и рестеноз после ангиопластики воздушного шара с / без стентовной имплантации¹. После артериальной травмы, подавление воспалительных процессов^2,3 и восстановление эндотелиального отсека необходимы для предотвращения дальнейших осложнений¹. Клинические исследования ограничиваются образцами тканей и крови из-за этических соображений, затрат и отсутствия знаний в базовых механизмах. По этим причинам необходимо изучить молекулярные механизмы в животных моделях^4-6,которые могут воссоздать клинические условия. Наша модель ускоренного образования неоинтимы в контексте атеросклероза является результатом многолетнего опыта в реализации этих моделей у мелких животных^7-11. Модель мыши является наиболее привлекательной моделью для исследований, из-за его простоты обработки, способность иметь большие группы животных из-за низких затрат, связанных с покупкой и уходом за животными, а также наличие различных трансгенных и нокаут штаммов.

Основным недостатком мыши модели является небольшой размер основных артерий, подверженных атеросклеротической болезни (сонный артерии, аорты, и бедренной артерии), которая требует квалифицированных хирургических знаний и навыков для управления сосудами и инвазивно вызвать атеросклеротические бляшки. Поэтому модель ускоренного формирования неоинтимы, в контексте рестеноза после эндартерэктомии или имплантации стента, предложенная в настоящем документе, представлена пошаговым руководством и предложениями по облегчению введения для заинтересованного персонала. Другим недостатком является то, что денудация производится на нормальной артериальной стенке, и, следовательно, образование нео-интимы будет умеренным по сравнению с клинической ситуацией. Высокий уровень холестерина плазмы, достигнутый в аполипопротеине E нокаутом(Apoe^-/-) мышей, питаемых с высоким содержанием жира-диета создает надлежащее провоспалительные среды, необходимые для формирования нео-интима.

Операция проводится под стереомикроскопом. Сонной артерии подвергается средний разрез в брюшной цервикальной области. Анатомические структуры поверх и окружающих сонной артерии минимально манипулируются, чтобы уменьшить послеоперационное воспаление. Обнажается бифуркация сонной артерии. Чтобы вызвать ускоренное образование неоинтимы, внутренние и внешние сонные артерии готовятся к прекращению кровотока и последующей общей денуляции сонной артерии. В заключение, метод может быть изучен персоналом с минимальным опытом в операциях на животных.

протокол

Эксперименты, представленные в настоящем документе, проводятся в соответствии с немецким законодательством и европейскими руководящими принципами по уходу за животными. Эти животные разводят в животном учреждении Института лабораторных наук о животных, Университетская больница Ахен, Германия, под наблюдением профессора Р. Толбы и д-ра А. Теубнера (сотрудник по защите животных).

1. Уход за животными

1. Держите мышей в специализированном отделении помощи, обеспечивая надлежащий доступ к пище и специализированному ветеринарному контролю и лечению. Если животные были перемещены или приобретены у третьих лиц, пожалуйста, убедитесь, что один недельный период проживания, прежде чем пройти процедуру.

2. Гиперлипидемия Побуждение

1. Кормите 6 - 8 недель, 18 - 20 г, самку (по желанию) ApoE^-/- мышей с атерогенной диетой (21% жира, 0,15% холестерина, 19,5% казеина, WT/WT) за неделю до хирургической процедуры и продолжайте диету до тех пор, пока не будет проведен анализ атеросплотетических бляшек.

3. Хирургическая подготовка

1. Анестезировать мышей с помощью интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг кетамина по весу тела и 10 мг/кг ксилазина по весу тела. Подтвердите правильное обезболивания перед операцией из-за отсутствия рефлексов и движения усов. Поместите небольшое количество стерильной мази глаза в глаз, чтобы свести к минимуму сушку.
2. Обеспечить поддержание стерильных условий, чтобы избежать инфекций во время операции с помощью стерильных материалов и инструментов.
3. Бритье мышей в области брюшной шеи. Дезинфицировать кожу бетадином перед разрезом. Сделайте 1 см разрез кожи в средней области области шеи, на вершине трахеи.
4. Разделите два жировых тела, чтобы обеспечить надлежащий вид на область трахеи. Используйте втягивающие для удержания мышечного слоя и подвергать сонной артерии. При наличии, выполните тупое вскрытие тонкого мышечного слоя, покрывающего сонную артерию.
5. Используйте острые изогнутые щипцы, чтобы отделить сонную артерию от блуждающего нерва и яремной вены. Таким образом, должна быть видна область бифуркации с внутренней и внешней сонной артерией. Используйте 0,9% NaCl, чтобы избежать сухости тканей во время хирургической процедуры.

4. Травма провода

1. Поместите 7 см длиной 0/5 шелкового шва под сонной артерии, проксимальной к аортальной арке. Сделайте открытый цикл, готовый к закрытию в любое время.
2. Поместите два шелковых шва 0/7 (каждый длиной 1,5 см) вокруг внешней сонной артерии: одна петля близка к точке бифуркации и одна петля как можно дистальной. Подготовьте их как открытый цикл, готовый к закрытию в любое время.
3. Поместите один шелковый шов длиной 0/7 (1,5 см) под внутреннюю сонную артерию. Подготовьте его как открытый цикл, готовый к закрытию в любое время.
4. Расположите стол мыши с головой мыши к оператору, чтобы обеспечить правильное позиционирование для вставки направляющей проволоки во время денаделяции(рисунок 1A).
5. Под микроскопическим взглядом, остановить кровоток через общую сонную артерию, удерживая и потянув концы 0/5 шелкового шва с гемостат щипцами.
6. Сразу же после общей сонной артерии лигатуры, закрыть шовные петли, размещенные на внутренней сонной артерии и дистальной шов на внешней сонной артерии плотно (Рисунок 1B).
7. Выполните небольшой разрез (артериотомия, половина диаметра сосуда) дистальной к внешней сонной артерии, между двумя петлями, используя небольшие ножницы(рисунок 1С). Если разрез слишком большой, пожалуйста, следуйте инструкциям по устранению неполадок (см. Обсуждение).
8. Используйте коммерчески полированные провода руководства или используйте в доме специализированного персонала для полировки проводов направляющего. Дезинфицировать 14-дюймовый полированный гибкий направляющий провод с алкоголем и увлажнить его в капельке 0,9% NaCl для обеспечения надлежащего скольжения в сосуд.
9. Вставьте направляющий провод в общую сонную артерию через поперечную артериотомию внешней сонной артерии(рисунок 1D). Получить эндотелиальной денаделяции путем прохождения направляющей проволоки вдоль судна при повороте. Повторите эту процедуру три раза. Поддерживайте ту же амплитуду вращательного движения в каждой мыши, чтобы увеличить воспроизводимость.
10. Закройте проксимальную петлю на внешней сонной артерии плотно. Восстановление кровотока в сонной артерии путем разрезания шва вокруг общей артерии и шва вокруг внутренней сонной артерии.

5. Шов и восстановление

1. Удалите втягивающие и верните мышечный слой и два жировых тела в физиологическое положение.
2. Закройте кожу тремя разделенными швами 0/6, если необходимы эхокардиографические измерения. Если визуализация не требуется, используйте металлические зажимы, чтобы закрыть кожу.
3. Положите мышь вниз на левую сторону под инфракрасным светом, пока она не проснется. Не оставляйте животное без присмотра и не оставляют в компании других животных до полного выздоровления.
4. Для будущей идентификации отметьте мышь с помощью локальной системы. Спросите сотрудника по защите животных из местного учреждения.

6. Анализ атеросклеротической бляшки

1. Анестезировать мышей в конце времени, используя интраперитонеальной инъекции 100 мг/кг кетамина по весу тела и 10 мг/кг ксилазина по весу тела. Подтвердите правильное обезболительство отсутствием рефлексов и движения усов.
2. Выполните exsanguination ретро-орбитальной или сердечной прокола и собирать кровь для дальнейшего анализа².
3. Дезинфицировать кожу бетадином. Откройте грудную полость и удалите право ушной клетки. Perfuse фосфат буферизированный раствор через левый желудочек, чтобы удалить оставшуюся кровь из сосуда, а затем пронизыть 4% PFA, чтобы исправить ткани.
4. Если фиксация не требуется, высаживать сонную артерию сразу после мытья^2,4,11. Выполняйте стандартные протоколы с анализом интереса: встраивание парафина, криосекция, мРНК или анализ белка и т.д.
5. Для морфометрических измерений, тщательно высаживать сонную артерию, включая бифуркацию, с минимальными манипуляциями, как проксимальной к аортальной арке с помощью изогнутых щипцов и маленьких ножниц.
6. Встраивать сонную артерию в парафиновый блок с помощью стандартных протоколов встраивания. Для выполнения поперечного сечения, поместите сонную артерию вертикально на бифуркации. Вырезать 5 мкм толщиной серийных секций, начиная с бифуркации и собирать их все на покрытием гистологических слайдов (Рисунок 2A).
7. Пятно каждый^10-й раздел с помощью окрашивания Movat, чтобы подчеркнуть^{laminas 2,4,11}. После сбора микроскопических фотографий всех сосудов (с использованием цели 10X), измерьте просвет, а также внутреннюю и внешнюю ламину для каждого раздела, используя специально разработанное программное обеспечение^2,4,11, как показано на рисунке 2B. Рассчитайте интимный рост и средства массовой информации судов.
8. Анализ гладких мышечных клеток и макрофагов содержание, или эндотелиального восстановления в серийных разделах, используя обычные иммунохистологические окрашивания² (Рисунок 2C).

Результаты

Процедура индукции атеросклеротических бляшек занимает 15 - 20 мин и показывает минимальный уровень смертности, в основном из-за кровотечения, возникающего во время процедуры. После операции мыши восстанавливаются после анестезии в течение 20 - 25 мин. Никаких физических нарушений, таких как паралич, или нарушение кормления не наблюдалось после операции.

Травма провода вызывает де-эндотелиализацию, имитируя сосудистые поражения после денуляции воздушного шара или стент-имплантации. Сразу после травмы оголенная сосудистая стенка будет покрыта слоем тромбоцитов, что является посредником и способствует спайке моноцитов^12. Активированные гладкие мышечные клетки из средств массовой информации будут размножаться и мигрировать в интимные пространства, образуя неоинтиму. Другие прародители для гладких мышечных клеток будут мигрировать из крови (по оценкам, 40%) и способствовать росту неоинтимы. Формирование бляшек закончится после полной повторной эндотелиализации, как правило, через 4 недели после проволоки травмы.

Образование неоинтимы можно оценить с помощью окрашивания Моват. Размер налета рассчитывается для каждого слайда с помощью программного обеспечения, как показано на рисунке 2B. Общий размер зубного налета (левая соная артерия) может варьироваться от 70 000 до 100 000 мкм2, в то время как размер сосуда управления (правая сорото-артерия) может варьироваться от 7000 до 8000 мк2. Эти значения во многом зависят от хирурга. Поэтому мы настоятельно рекомендуем использовать одного и того же хирурга во время экспериментов для того же исследования.

Разработанная бляшка напоминает стентный рестенноз, который преимущественно состоит из размножающихся и мигрирующих гладких мышечных клеток из средств массовой информации. Клеточный состав, определяемый иммунологическими процедурами окрашивания, показывает, что содержание гладких мышечных клеток составляет примерно 30 - 40%, в то время как макрофаги встречаются в 15 - 25% от неоинтимы поврежденного сосуда. Повторное эндотелиализация может быть измерена после окрашивания эндотелиального маркера и рассчитывается как процент окружности, окрашенных по всей окружности просвета. Обычно повторное эндотелиализация достигает 80 - 90% после 3 недель, и должно быть почти завершено после 4 недель(рисунок 2C). Чтобы отслеживать рост бляшек во время его разработки, тот же анализ может быть повторен для каждого времени после проволоки травмы, в зависимости от интереса и предмета изучены (см. таблицу 1).

Рисунок 1. Схематическое представление оперативной процедуры. (A) Позиционирование таблицы операций по отношению к оператору во время процедуры проволоки травмы(B) Расширенный вид общей сонной артерии и ее ветвей, как это появляется под микроскопом на 10X увеличение(C) Размер разреза во внешней сонной артерии под микроскопом на 10X увеличение(D) Измаическое представление проволоки травмы процедуры с использованием 14-дюймовый проводной направляющей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2. Анализ реденоза. (A) Схематическое представление анализа бляшек в общей сонной артерии, через 4 недели после индукции проволоки(B) Неоинтима формирования 4 недели после проволоки травмы и схематическое представление основных параметров, используемых для анализа. Intima (зеленая зона) является разница между просвет (красный) и ламина интерна (зеленая линия). Медиа (желтая область) — это разница между ламиной эктерной (желтая линия) и интерной (зеленая линия). Масштабная планка 100 мкм(C) Репрезентативные изображения окрашивания основных типов клеток, участвующих в формировании неоинтимы. Гладкие мышечные клетки (гладкий мышечный актин -красный, шкала бар 100 мкм), макрофаги (Mac 2- зеленый, шкала бар 100 мкм) и эндотелиальные клетки (CD31- красный, стрелки, шкала бар 50 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Время	Тромбус	Табличка (м2)	Макрофагов (% от таблички)	Гладкие мышечные клетки (% от таблички)	Ре-эндотелиализация (% окружность просвета)
1 день	Настоящее время	0	0	0	0
1 неделя	-	Зтт; 30 000	No 10	Зтт; 50	Зтт; 50
2 недели	-	Зтт; 50 000	No 10	Зтт; 50	50;
3 недели	-	Зттт; 70 000	15-25	30-40	80-90
4 недели	-	70 000 – 100 000	15-25	30-40	Полный

Таблица 1. Развитие таблички, зависящее от времени.

Модели	Животных	Преимущества	Неуправляемые
Вызванный диетой родной атеросклероз	Маленький	имитирует патологию атеросклероза простота обработки без хирургического вмешательства нет стресса для животных низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов	низкая репродукция высокая дисперсия увеличение числа животных требуется увеличенное время ожидания
	Большой	имитирует патологию атеросклероза простота обработки без хирургического вмешательства нет стресса для животных	низкая репродукция высокая дисперсия увеличение числа животных требуется
Расширение воздушного шара	Маленький	имитирует ретеноз после ангиопластики воздушного шара низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов	небольшой размер основных артерий требует квалифицированных хирургических знаний воздушные шары очень дорогие денаделяция производится на нормальной артериальной стене наличие соответствующего оборудования риски осложнений, как кровотечение или паралич
	Большой	имитирует ретеноз после ангиопластики воздушного шара простота обработки использование устройств для людей	денаделяция производится на нормальной артериальной стене
Травма провода	Маленький	имитирует ретеноз после ангиопластики воздушного шара простота обработки минимальный уровень смертности низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов без физических нарушений	небольшой размер основных артерий требует менее квалифицированных хирургических знаний денаделяция производится на нормальной артериальной стене наличие соответствующего оборудования
Имплантация стента	Маленький	имитирует рестеноз и тромбоз после имплантации стента низкие затраты, связанные с покупкой и уходом за животными наличие различных трансгенных и нокаутирующих штаммов	небольшой размер основных артерий требует квалифицированных хирургических знаний небольшие стенты не доступны денаделяция производится на нормальной артериальной стене повышенной смертности наличие соответствующего оборудования риски осложнений, как кровотечение или паралич
	Большой	имитирует ретеноз и тромбоз после имплантации стента простота обработки использование устройств для людей	денаделяция производится на нормальной артериальной стене

Таблица 2. Преимущества и недостатки существующих моделей артериальной травмы.

Обсуждение

В этом документе мы предоставляем полезные советы для выполнения процедуры травмы провода даже персоналом с минимальным опытом в операциях на животных. Есть два критических шага в выполнении этой процедуры: разрез внешней сонной артерии и вставки провода. Разрез во внешней сонной артерии должен быть выполнен как можно дальше от бифуркации, для того, чтобы обеспечить достаточно оставшегося материала(Рисунок 1C). Разрез не должен быть слишком большим, из-за риска разрезания всего сосуда. Вторым важным шагом является высокий риск кровотечения во время артериотомии и вставки направляющей проволоки, если кровоток не эффективно прекращено. Кроме того, эндотелиальное денудирование может не иметь место или разрыв артерий возможен, если направляющий провод не будет должным образом введен в сосуде просвета. Чтобы избежать этого, поверхность направляющей проволоки должна быть тщательно отполирована перед операцией.

Для оптимизации протокола положение операционного стола с мышью-головой к хирургу обеспечивает лучшее представление, доступность и контроль для правильной манипуляции проводом. Кроме того, чтобы увеличить воспроизводимость, используйте тот же провод руководства во всех исследованиях. В виду того что размер провода не изменяет, важно рассматривать и исключить все возможные разницы между мышами путем использование такого же пола, времени и веса для всех мышей включенных в изучение. После этого, Эванс-Голубое окрашивание поможет хирургу определить эффективность денуды. Наличие соответствующего оборудования является необходимым условием успеха процедуры. 10X стереомикроскоп имеет важное значение для выполнения этой процедуры. Надлежащая подготовка направляющего провода (например, его полировка) имеет решающее значение. Поэтому мы настоятельно рекомендуем, чтобы подготовка проводов направляющей была выполнена специализированным техническим персоналом там, где это возможно.

В этом протоколе есть много шагов по устранению неполадок. При резвлении внешней сонной артерии вблизи бифуркации, тщательно привязать externa, вблизи бифуркации, так что никаких кровотечений не происходит. Во время резки внешняя соная артерия не видна. Поэтому рассмотрим бифуркацию на уровне шелкового шва. Собирайте секции, когда шелковый шов исчезает. Если разрез во внешней сонной артерии слишком велик и сосуд разрывается, убедитесь, что приток крови в сонную коммуну и внутреннюю сонную артерию эффективно прерывается и попытаться найти отверстие сосуда с помощью щипцов. После введения направляющей проволоки и выполнения денадерации, свяжите сосуд вблизи бифуркации. Во время резки, начинают собирать, когда шелк из шва начинает исчезать. Если артериальный разрыв происходит во время денадерации с помощью направляющей проволоки, проверьте под микроскопом, правильно ли отполирована направляющей проволоки.

Несмотря на сходство модели проволоки травмы клинических ситуаций, многие группы сосредоточены на родной атеросклероз у мышей, или они выбирают инвазивные индукции атеросклероза, такие как воздушный шар ангиопластики у крыс или кроликов, из-за отсутствия квалифицированного персонала, который может выполнять небольшие операции животных. Несмотря на преимущества использования кроликов/крыс, например нет необходимости в миниатюрном оборудовании, ни модели крыс, ни модели кроликов не предлагают различных штаммов нокаута, с точки зрения изучения молекулярных механизмов, участвующих в росте неоинтимы и в стентом тромбозе.

Существующие модели для изучения стентного рестеноза у мышей трудны, требуют высоких хирургических навыков, и имеют высокий риск осложнений, таких как кровотечение или паралич. Например, механическая травма или стент-имплантация в грудную аорту через бедренную артерию сопровождается высоким уровнем смертности (35%) из-за паралича задней ноги или кровотечения^13-15. Мы также описываем имплантацию стента в сонную артерию мыши^16. Процедура аналогична; однако, обработка тканей для анализа является сложной и не доступна для всех лабораторий¹⁶. Сонной артерии непосредственно доступны, не только для операционных процедур, но и для существующих методов визуализации, таких как ультразвуковое изображение. Другие индукции травмы в сонных артериях у мышей может быть сделано с помощью электрических устройств¹⁷. Этот метод прост в выполнении и обеспечивает высокую воспроизводимость. Тем не менее, он вызывает травмы во всех слоях судна, который не идентичен механической травмы. Применение воздушных шаров имеет преимущества, например, корректировка диаметра сосуда в соответствии с клинической практикой и оказывает сильное влияние на патологический исход. Несмотря на то, что мыши шары доступны, они очень дорогие и, следовательно, не широко используется. Вместо этого, проволока-травма является установленным методом, имитирующим стент стеноза.

Денудация выполняется на обычной артериальной стенке, хотя и с атеросклеротическим фоном. Таким образом, образование неоинтимы будет умеренным по сравнению с клинической ситуацией. Большое количество доклинических моделей свидетельствует о том, что ни одна из моделей не соответствует всем критериям, необходимым для раскрытия всей клеточной и молекулярной механизмов, ведущих к патофизиологии у людей (см. таблицу 2).

После выполнения процедуры травмы провода, другой биологический и молекулярный анализ может быть выполнен для выявления клеток, белков, мРНК, микроРНК, генов или других биомаркеров, которые могут быть использованы в качестве терапевтических целей для разработки новых стратегий лечения атеросклероза, и, в частности, для формирования неонитимы после сосудистой травмы. При наличии, рост бляшки можно контролировать с помощью высокочастотного ультразвука или других методов визуализации высокого разрешения. Кроме того, освоение этого метода даст оператору возможность адаптировать протокол к другим инвазивным моделям атероссклероза, таким как размещение воротников, частичная перевязка или даже имплантация стента.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereomicroscope	Olympus	SZ/X9	-
Forceps	FST, Germany	91197-00	standard tip curved 0,17 mm
Hemostat forceps	FST, Germany	13007-12	curved
Scissors	FST, Germany	91460-11	Straight
Vannas scissor	Aesculap, Germany	OC 498 R	-
Retractors	FST, Germany	18200-10	2.5 mm wide
Retractors	FST, Germany	18200-11	5 mm wide
Ketamine 10%	CEVA, Germany	-	-
Xylazine 2%	Medistar, Germany	-	-
Bepanthene eye and nose cream	Bayer, Germany	-	-
Silicon tube	IFK Isofluor, Germany	custom-made  product	diameter 500 µm,
section thickness 100 µm,
polytetrafluorethylene catheter
PROLENE Suture 6/0	ETHICON	8707H	polypropylene monofilament suture, unresorbable, needle CC-1, 13 mm, 3/8 Circle
7/0 Silk	Seraflex	IC 1005171Z	-
Michel Suture Clips	FST, Germany	12040-01	-
Clip Applying Forcep	FST, Germany	12018-12	-
14”Wire for Catheter	Abbot	1000462H	Use 10 cm from stiff part and equalize the ends
Mice	Charles River	Apolipoprotein E -/- mice with C57/Bl6 background	-