Быстрое приобретение 3D-изображений с помощью высокого разрешения Эпископическое микроскопии

Резюме

We describe a detailed protocol using high-resolution episcopic microscopy to acquire three-dimensional (3D) images of mouse embryos. This improved protocol utilizes a modified tissue preparation method to enhance penetration of the fluorescent dye, thereby permitting morphometric analysis of both small and large-sized specimens.

Аннотация

High-resolution episcopic microscopic (HREM) technology enables rapid acquisition of high-resolution digital volumetric and three-dimensional (3D) morphometric data. Here, we describe the detailed protocol to image the entire mouse embryo. The protocol consists of four major sections: sample preparation, embedding, image acquisition and finally, 3D visualization. The technology requires specimens to be stained with a fluorescent dye, which can be problematic for large or dense specimens. To overcome this limitation, we have improved the existing protocol to enhance tissue penetration of the dye by pretreating the specimen with a solution containing urea and sodium dodecyl sulfate. The protocol uses only routine laboratory equipment and reagents for easy adaptation in standard laboratory settings. We show that the resulting high-resolution 3D images faithfully recapitulate the detailed morphologic features of the internal organs of mouse embryos, thereby permitting morphometric analyses. Together, we present a detailed and improved protocol using standard laboratory equipment to acquire high-resolution 3D images of small and large sized specimens.

Введение

The advent of 3D imaging technologies has opened the possibility of systemic analysis of detailed morphological features during fetal development. A variety of 3D imaging modalities is now available include micro-magnetic resonance imaging (micro-MRI), micro computed tomography, high frequency ultrasound, optical coherence tomography, optical project tomography and episcopic microscopy^1-4. Each modality has its own unique features in resolution, contrast, speed, cost, in utero capability and availability.

Episcopic fluorescence image capture (EFIC) and high-resolution episcopic microscopy (HREM) are episcopic microscopy imaging methods⁴. Here, high-resolution serial images are captured continuously from the block face instead of tissue sections. The resulting images faithfully reflect detailed morphological features with minimal or no tissue distortion. The acquired volumetric data is readily converted to high-resolution 3-D images suitable for accurate morphometric analysis. Because of relative low cost and high resolution, HREM and EPIC have become the superior alternatives for systemic assessment of mouse models of human birth defects^2,4-8.

Both EFIC and HREM methods require specimens to be embedded in the suitable medium. EFIC detects autofluorescence emitted from the embedded tissue. Because of this, it is limited to specimens emitting high levels of autofluorescence but not those with relatively weak autofluorescence such as early stage embryos⁹. To overcome the dependency of autofluorescence, specimens are stained with a fluorescent dye such as eosin for HREM imaging. The choices of dyes and staining methods also make HREM more compatible to detect molecular signals in the context of tissue architecture and morphology^4,10.

In this article, we present an improved HREM protocol suitable for whole body assessment of the late stage mouse embryos. To facilitate staining, we include a pretreatment step to increase tissue penetration, thereby enabling HREM imaging of older mouse embryos.

протокол

Все случаи использования животных утверждаются по уходу и использованию комитета Institutional животного происхождения в Бостонской детской больнице.

1. Подготовка образцов

1. Временный спаривание
   1. Поместите C57BL6 дикого типа самца и самку вместе в одной клетке.
   2. Проверьте для формирования матовую пробки рано утром следующего дня. Спаривание плагин (он же, вагинального или совокупление плагин) представляет собой закаленный желеобразные отложения , которое блокирует вход во влагалище.
   3. Установите дату пробку как день эмбрионального 0,5 (e0.5).
2. Выделение эмбрионов мыши
   1. Эвтаназии беременных самок СО ₂ удушья.
   2. Помещенный мышей навзничь на впитывающей подушечки и распылить брюшную область с 70% -ным этанолом.
   3. Подтяжка кожи и сделать первоначальный 5 мм надрез на хвостовом брюшной области с использованием хирургических ножниц. Вырезать и удалить кожи живота, чтобы полностью раскрыть внутренние органы
   4. Вырезать вблизи ваGina, чтобы удалить всю матку.
   5. Обрежьте между имплантацией участков вдоль рога матки. Каждый сегмент или зародыш должен иметь только один эмбрион внутри.
   6. Хранить сегменты матки в 1X ледяным фосфатно-буферным раствором (PBS).
3. Эмбрион рассечение
   1. Поместите каждую Conceptus в отдельное блюдо с ледяным PBS под стереоскоп.
   2. Удалить матки ткани, плаценту, а затем последовательно плодные оболочки с использованием тонких препаровальный пинцет.
   3. Передача расчлененный эмбриона в 50 мл пробирку с 1x ледяной PBS с помощью большой пипетки передачи. Избегайте собирание эмбриона непосредственно с пинцетом, чтобы свести к минимуму повреждение тканей.
4. фиксация
   1. Закрепить расчлененный эмбрионов в 10% нейтральном забуференном растворе формалина при температуре 4 ° С в течение более 24 ч, по меньшей мере, 10 объемов образцов фиксирующих.
5. предварительная обработка
   1. Подготовить Клиринговый Решение: 4М мочевина, 10% глицерина, 4% додецилсульфат натрия (SDS) в бидистиллированной воде.
   2. Заменить закрепитель с Расчетной Solution.
   3. Осторожно повернуть образец на качалке при комнатной температуре в течение 1 - 2 недель. Обмен Клиринговый Solution один раз на второй и третий день. Образец медленно становится ясным и прозрачным.
   4. Заменить Клиринговый решение с 10% -ным формалином и оставить на качалке в течение 2-х дней.
6. дегидратация
   1. Вымойте предварительно обработанных образцов с 1x PBS 3 раза в течение 5 минут каждый.
   2. Дегидрировать образцов в серии этанола возрастающей при комнатной температуре на пологом качалке. Для E15.5 эмбрионов, используют серию восходящий этанол в том числе 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% и 100% этанола, 2 ч каждый шаг. Для более старых эмбрионов, время инкубации должна быть увеличена.
7. Окрашивание
   1. Подготовка окрашиванием Решение: добавить 0.1375 г эозина Y динатриевой соли и 0,0275 грамм акридинового оранжевого геми (хлорид цинка) соли к 50 мл 100% этанола. Смесь перемешивают в течение 2 часов. Фильтр с фильтровальной бумагой. Хранить при комнатной температуре и исключить воздействие света, покрывая с алюминиевой фольгой.
   2. Перенос образца в окрашивании раствор в течение 1 ч.
   3. Заменить свежим Окрашивание раствором и пятно в течение ночи.
8. инфильтрация
   1. Готовят инфильтрацией решение: объединить 100 мл раствора А JB-4 комплекта вложения, 1,25 г катализатора С, 0,275 г эозина Y динатриевой соли и 0,055 г акридинового оранжевого геми (хлорид цинка) соли. Движение, чтобы смешать (200 оборотов в минуту) в ведре со льдом в течение 2 ч, а затем фильтруют с помощью фильтровальной бумаги.
   2. Храните инфильтрации решение при 4 ° С и избегать света, покрывая с алюминиевой фольгой.
   3. Перенос эмбрионов инфильтрации Решение: окрашиванием раствором (1: 1), и инкубировать в течение не менее 3 ч на качалке при 4 ° С.
   4. Перенос эмбрионов инфильтрации раствора и инкубировать в течение 3 чг на качалку в холодном помещении.
   5. Заменить инфильтрации решение один раз в день, и оставить в холодном помещении на пологом качалке в течение еще трех дней.

2. Вложение

1. Держите Решение B и инфильтрации решение на льду.
2. Сделать Встраивание Solution (1:25 раствора В и инфильтрации раствора) непосредственно перед вложением.
3. Orient образец в вложению формы, а затем залить холодной Встраивание раствора в вложению формы аккуратно. Переориентирование с булавкой, если это необходимо.
4. Используйте булавку, чтобы изучить вопрос о затвердевает вложении решение. Выталкивайте блок образца и обрежьте ее в случае необходимости.
5. Переориентировать блок образца с использованием отдельной формы для получения перекрестной ориентации.
6. Поместите держатель блока в верхней части пресс-формы вложения. Аккуратно влить Встраивание решение в пресс-форму до тех пор, форма и держатель блока не погружена Встраивание Solution.
7. Храните образец в контейнере вторичного и оставить егона льду в течение 3 - 4 часа в вытяжном шкафу.
8. Хранить Затвердевший образцов в 4 ° С.
9. Отслаиваться вложение плесени. Поместите блок под стереомикроскопа с косом освещении, чтобы проверить положение образца в блоке. На блоке лица, Марк линии сетки вокруг образца.
10. Обрезка блок, чтобы удалить количество доступа встраивания материала с использованием отмеченных линий сетки в качестве ссылки.

3. Получение изображения

1. Зажим образца блока к микротома и получить свежую поверхность разреза. Установить толщину секции (например, e9.5-10.5, 1,5 мкм; e11.5-12.5, 2,0 мкм; e13.5-15.5, 2,5 мкм; E16.5-старшего, 3 мкм). Держите образец / блок в исходном положении микротом.
2. Установите стерео микроскоп масштабирования по горизонтали, обращенную блок поверхности образца.
3. Включите компьютер и микроскоп, и запустить программное обеспечение захвата изображений.
4. Визуализируйте и фокусировки оптики на блок-лицав режиме "живой" вид программного обеспечения визуализации.
5. Align микроскоп и микротом, если это необходимо, чтобы блок-лицо находится в центре видоискателя.
6. Отрегулируйте масштаб так, чтобы весь блок-лицо в видоискателе.
7. Выберите зеленый флуоресцентный белок (GFP) фильтр (возбуждение 470 ± 20 нм, дихроичный 495 нм, эмиссия 525 ± 25 нм) и переориентировать в случае необходимости.
8. Измерьте и установите время экспозиции вручную (например, 80 - 400 мини - сек).
9. Приобретать изображения блок-лица после каждого свежего вырезать и сохранить изображения автоматически, если это возможно.
10. Запись важных параметров, включая разрешение, толщина секции и масштабирования.
11. После окончания всего образца, экспорта и конвертировать все файлы изображений в формате JPEG, если это необходимо.
12. Переверните все исходные изображения с помощью программного обеспечения для обработки изображений, а также настроить яркость и контрастность.
13. Сохранить все обработанные изображения в отдельной папке.

4. 3DВизуализация

1. Загрузите все обработанные изображения в 3D-визуализации программного обеспечения, следуя инструкциям.
2. Входное разрешение и толщина секции , чтобы преобразовать все изображения в объемных данных (т.е. воксельная размер) и сохранить 3D - файл.
3. Совместите все изображения, используя автоматический режим. Настройте отдельные изображения вручную, если это необходимо.
4. Сохраните выровненный изображение на новое имя файла.
5. Анализ морфометрических особенностей образца с использованием программного обеспечения визуализации 3D.

Результаты

Мы сообщали высокого качества ЭМВР изображения эмбрионов мыши между E9.5 и E13.5 ^8. Качество изображения конца поставил эмбрионов, однако, в значительной степени нарушена из-за проникновения ограниченного тканевого эозином флуоресцентного красителя. Для повышения ...

Обсуждение

Здесь мы представляем модифицированный протокол с использованием рутинного лабораторного оборудования для получения серийных ЭМВР изображения, которые совместимы для быстрой 3D визуализации и анализа морфометрического сложных структур. Поскольку изображения с высоким разрешением ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	The Jackson Laboratory	C57BL6
Ethyl Alcohol	Pharmco-Aaper	111000200	200 Proof, Absolute, ACS/USP/Kosher Grade
Formalin	Sigma	HT501128-4L
Urea	Sigma	U5128	Clearing Solution
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	Clearing Solution
Sodium Dodecyl Sulfate	Invitrogen	15525-017	Clearing Solution
Eosin Y Disodium Salt	Fisher scientific	BP241925	Infiltration Solution
Acridine Orange hemi (zinc chloride) salt	Sigma	A6014	Infiltration Solution
Whatman paper	GE	3030-153
JB-4 Embedding Kit - Solution A	Polysciences, Inc.	0226A-800	Infiltration Solution
JB-4 Embedding Kit - Solution B	Polysciences, Inc.	0226B-30	Embedding Solution
JB-4 Embedding Kit - Catalyst	Polysciences, Inc.	02618-12	Infiltration Solution
Embedding Molds	Polysciences, Inc.	23185-1	16 x 8 mm
Peel-A-Way Sharp Embedding Molds	Polysciences, Inc.	18986-1	22 mm x 22 mm square, truncated to 12 mm x 12 mm
JB-4 Plastic Block Holders	Polysciences, Inc.	15899
Disposable Graduated Transfer Pipes	VWR	414004-014
Petrl Dish	VWR	25384-088	Embryo dissection
Forceps Inox Tip	ROBOZ	RS-5015	Embryo dissection
Graefe Tissue Forcep	ROBOZ	RS-5153	Embryo dissection
Delicate Operating Scissor	ROBOZ	RS-6700	Embryo dissection
14 ml Polypropylene Round-Bottom Tubes	Falcon	352059
50 ml Polypropylene Conical Tubes	Falcon	352098
Ice Bucket	Magic Touch Iceware International Corp.	R19-343
100 ml (3.4 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-766
330 ml (11.2 oz.) Antistatic Polystyrene Weigh Boats	VWR	89106-770
Sodium Chloride	MP Biomedicals	102892	PBS Solution
Potassium Chloride	Sigma	P0662	PBS Solution
Potassium phosphate monobasic	Sigma	P5405	PBS Solution
Sodium phosphate dibasic heptahydrate	Sigma-Aldrich	S9390	PBS Solution
Digital Camera	Hamamatsu Photonics	C11440-10C
Microtome	Leica	RM2265
Illuminator	Carl Zeiss	HXP 200C
Fluorescence Stereo Zoom Microscope	Carl Zeiss	Axio Zoom.V16
Stereo Microscope	Olympus	SZX16
Fiber Optic Light Source	Leica	KL 1500 LCD
Disposable Microtome Blade	VWR	95057-832
Single Edge Dispenser	Personna	62-0330-0000
ZEN	Carl Zeiss	pro 2012
Photoshop	Adobe	CS6 v13.0
Amira 3D Software	Visage Imaging	5.4
Computer	Dell T7600, 2x900GB SAS hard drive and 64 GB DDR3 RDIMM memory
Rocking Platform Shakers	VWR	40000-304
Standard Hot Plate Stirrer	VWR	12365-382
Analytical Balance	Mettler Toledo	AB54-S