Флуоресцентным на основе анализа фосфолипида Scramblase деятельности

Резюме

We describe a fluorescence-based assay to measure phospholipid scrambling in large unilamellar liposomes reconstituted with opsin.

Аннотация

Scramblases транслокации фосфолипидов поперек мембраны бислой двунаправленным в АТФ-независимым способом. Первый scramblase быть идентифицированы и проверены биохимически был Opsin, апопротеина фоторецептора родопсина. Родопсин является G-белком рецептор локализован в стержень фоторецепторов дисковые мембраны сетчатки, где он отвечает за восприятие света. Scramblase деятельность родопсина не зависит от его лиганда 11- цис - -retinal, т.е. апопротеинового опсина также активен как scramblase. Хотя конститутивный и регулируется фосфолипид скремблирования играют важную роль в клеточной физиологии, лишь несколько фосфолипидов scramblases были определены до сих пор, кроме опсином. Здесь мы опишем флуоресцентного анализа на основе из scramblase активности Opsin в. Opsin восстанавливали в большие однослойные липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, фосфатидилглицерина и следовые количества флуоресцентного НБД-меченых ПК (1-рalmitoyl-2- {6- [7-нитро-2-1,3-benzoxadiazole-4-ил) амино] гексаноил} - зп глицеро-3-фосфохолин). Scramblase активность определяют путем измерения степени, в которой молекулы НБД-PC, расположенные во внутреннем листке везикулы способны получить доступ к наружной листовку, где их флуоресценции химически устранен с помощью восстанавливающего агента, который не может пересекать мембрану. Методы, описанные нами находит широкое применение и могут быть использованы для идентификации и характеристики scramblase деятельности других мембранных белков.

Введение

Фоторецепторов родопсин, прототипическим G-белком рецептор (рассмотрен, например , в ссылке ^1), является первым фосфолипид scramblase быть идентифицированы и биохимически проверено ^2,3. Scramblases являются фосфолипидов транспортеров , которые увеличивают внутренне медленную скорость transbilayer фосфолипидов движения физиологически соответствующих уровней в двунаправленной, АТФ-независимым способом ^4-6. Примерами их действий могут быть найдены в эндоплазматический ретикулум и бактериальной цитоплазматической мембраны , где конститутивным скремблирования необходим для мембранного гомеостаза и роста, а также для различных путей гликозилирования ^5. Регулируемый фосфолипид скремблирование необходимо подвергать фосфатидилсерина (PS) на поверхности апоптотических клеток , где он действует как "съесть-меня" -сигнала для макрофагов ⁷ и обеспечивает поверхность прокоагулянтную на активированных тромбоцитах , чтобы катализировать образование фактора белкаы необходимы для свертывания крови. В фоторецепторов дисковых мембран, карабкаясь активность родопсина была предложено , чтобы противодействовать фосфолипидов дисбаланс между двумя мембранами листков бислоя , который генерируется АТФ-зависимый, однонаправленного липида флиппазы abca4 ^{4,8,9 10-12.}

Несмотря на Физиологическое значение scramblases, их идентичность остаются неясными до родопсина не сообщалось как scramblase в фоторецепторных дисков ^2, были идентифицированы членами семейства белков TMEM16 , как Са ²⁺ -зависимые scramblases , необходимые для облучения PS в плазматической мембране (обзор в ссылке ^13), и бактериальный белок FtsW был предложен как липид II scramblase требуется для синтеза пептидогликана ^14. Эти открытия были основаны на восстановлении очищенных белков в липосомы и демонстрации scramblase активности в результате протеолипосом с использованием методологии describред здесь. Другие потенциальные scramblases ^15-21 - эти белки MurJ и Amj замешанные в пептидогликана биосинтеза, WzxE и родственные белки участвуют в скремблирования O-антиген предшественников, ФЗПНМ белков необходимо для транслоцироваться аминоацилирована фосфатидилглицерин через цитоплазматическую мембрану бактериальной, и члены семьи Xkr8 , которые были предложены выставить PS на поверхности апоптотических клеток - остаются для тестирования биохимически. Это подчеркивает важность надежного анализа, чтобы определить и охарактеризовать scramblase активность.

Здесь мы описываем воссоздание очищенного опсином, апопротеина фоторецептора родопсина, в большие однослойные везикулы (БУВ), и последующий анализ scramblase активности в результате протеолипосом с использованием флуоресцентного анализа на основе. Есть несколько хорошо описанных протоколов, доступных в литературе для гетерологичной экспрессии и очистки опсином, поэтому мы не будемописать его в этом протоколе; мы используем протоколов , описанных в Горен и др. ³ , который дает ФЛАГ-меченый, термостабильный опсина при температуре около 100 нг / мкл в 0,1% (вес / объем) dodecylmaltoside (ДДМ).

Разбавление достигается путем обработки БУВ с достаточным моющим средством таким образом, что они набухают, но не растворяются. В этих условиях, мембранный белок - поставляется в виде белково-детергентных мицелл - интегрирует в липосомы и стать восстанавливали в липосомальной мембраны при удалении моющего средства, в результате чего протеолипосомах. Для того, чтобы восстановить опсином (полученный в виде очищенного белка в 0,1% (вес / об) DDM), БУВ получают из смеси РОРС (1-пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин) и POPG (1- пальмитоил-2-oleoyl- зп глицеро-3- [фосфо-рац- (1-глицерин)]) и насыщали DDM перед добавлением опсином и NBD-PC. Моющее средство удаляют путем обработки образца с полистирольных шариков.

деваха = "jove_content"> Принцип , лежащий в основе флуоресцентного анализа на основе показана на рисунке 1В. БУВ симметрично разведен с помощью микроскопического количества NBD-PC или другого НБД-меченого флуоресцентной фосфолипидного репортера (Рис . 1А) При добавлении дитионита, мембраносвязанным impermeant дианион, молекулы НБД-ПК в наружном листке БУВ оказываются нефлуоресцирующего как нитро-группой NBD сводится к нефлуоресцентном амино-группы. Поскольку ни молекулы НБД-PC, ни дитионит способны проходить через мембрану, на временной шкале эксперимента (<10 мин), это приводит к уменьшению на 50 флуоресцентного сигнала%. Тем не менее, если липосомы разведен с помощью scramblase, молекулы НБД-ПК во внутреннем листке может быстро вскарабкаться к внешней стороне, где они уменьшаются. Это приводит к полной потере флуоресценции в идеальном случае (рис 1C).

эс / ftp_upload / 54635 / 54635fig1.jpg "/>
. Рисунок 1: Схематическое изображение анализа scramblase активности Анализ используется люминесцентная NBD-меченых репортер липида; НБД-ПК показан (А). Большие однослойные везикулы восстанавливали микроскопического количества NBD-PC. Разбавление производит симметричные везикул, с НБД-PC распределенной равномерно во внешних и внутренних листков. Дитионит (S ₂ O ₄ ^2-) химически уменьшает нитро-группу NBD к нефлуоресцентном амино-группы. Лечение безбелковых липосом с дитионита (B, вверху) приводит к снижению на 50% от флуоресценции , так как только молекулы НБД-ПК в наружной листовке снижаются: дитионит отрицательно заряженными и не могут пересекать мембрану , чтобы вступать в реакцию с молекулами НБД-PC во внутреннем листке. Дитионит лечение Opsin содержащих протеолипосом (B, внизу), т.е. scramblase-активных протеолипосомы, приводит к 100% потере еluorescence, как опсином облегчает перемещение НБД-PC между внутренним и наружным листком. (С) показывает идеализированные флуоресценции следы , полученные на лечении небелковых липосом и Opsin содержащих Протеолипосомы с дитионита. Скорость потери флуоресцентной одинакова в обоих случаях, указывающих, что химическое восстановление NBD дитионитом является ограничивающим скорость, и что скремблирования происходит со скоростью, равной или большей, чем скорость химической реакции. Следы , полученные от фактического эксперимента показаны на рисунке 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Методы , описанные нами могут быть использованы для восстановления и пробирного другие очищенные белки, а также их смеси мембранных белков , полученных, например, путем экстракции микросом с помощью моющих средств ^22.

протокол

1. Получение липосом, и протеолипосомах

1. липосом Формирование
   1. С помощью стеклянного шприца, добавьте 1,435 мкл POPC (25 мг / мл, в хлороформе) и 160 мкл POPG (25 мг / мл, в хлороформе), в круглодонную колбу, чтобы получить 52,5 мкмоль липидов в мольном соотношении РОРС: POPG = 9: 1.
   2. Сухие липиды в течение 30 мин с помощью роторного испарителя при скорости вращения 145 оборотов в минуту (без воды ванны не требуется для этого объема растворителя), а затем перенести колбу на вакуумном эксикаторе в течение по меньшей мере 3 ч или в течение ночи при комнатной температуре (RT).
   3. Увлажняют высушенную липидную пленку с 10 мл 50 мМ HEPES рН 7,4, 100 мМ NaCl (далее упоминаемый в качестве буфера А) путем осторожно взбалтывая колбу до получения однородной, мутная результаты подвески;
      Примечание: Концентрация липида на данном этапе, как ожидается, будет 5,25 мМ, как без потерь не должно иметь место до сих пор.
   4. Разрушать ультразвуком суспензию в водяной бане в течение 10 мин при комнатной температуре с частотой OF 40 кГц. Решение будет выглядеть несколько яснее.
   5. С помощью экструдера, Суспензию пропускали 10 раз через мембрану с размером пор 400 в нм, за которым следует второй цикл экструзии с 4 проходит через мембрану с размером пор 200 нм.
      Примечание: Средний диаметр полученных БУВ составляет ~ 175 нм. При необходимости, размер и однородность БУВ можно проверить с помощью динамического рассеяния света в соответствии с инструкциями изготовителя.
   6. Количественная фосфолипидов концентрацию LUV суспензии, как описано в разделе 1.2).
      Примечание: Из-за потерь во время экструзии, концентрация, как правило, около 3,6 мМ.
   7. Хранить БУВ при температуре 4 ° С в течение приблизительно 2 недель, если не использовать сразу.
2. фосфолипидов Количественное
   Примечание: Для определения фосфолипидной концентрации LUV суспензии, используемой для восстановления, а также, что из протеолипосомах, которые в конечном счете сгенерированных аликвоту образца Тематические ссылкиИДКТК окисления хлорной кислотой. Эта процедура разрушает фосфолипиды выпустить неорганического фосфата , который затем определяют количественно с помощью колориметрического анализа по сравнению со стандартами ^23.
   1. Готовят 40 мМ исходного раствора фосфата натрия (Na ₂ HPO ₄₎ в деионизованной дистиллированной воде.
   2. Развести маточного раствора деионизированной дистиллированной водой, чтобы получить 4 мМ и 0,4 мМ рабочие растворы, которые будут служить в качестве калибровочных стандартов.
   3. Использование рабочих растворов следует подготовить стандарты в 13 х 100 мм ² стеклянные трубки в диапазоне от 0 до 80 нмоль фосфата натрия в конечном объеме 50 мкл.
   4. Взять по 10 мкл каждого из LUV и proteoliposome проб должны быть определены количественно и разбавляют 40 мкл DDH ₂ O в 13 х 100 мм ² стеклянные трубки.
      Примечание: По мере того как концентрация липидов в БУВ и протеолипосомах находится в диапазоне 2,5-5 мкм, 10 мкл образца должен содержать 25-50 нмоль липидного фосфора.
   5. Добавьте 300 мкл хлорной кислоты к каждому из стандартов и образцов и высокой температуре в течение 1 ч при 145 ° С в нагревательном блоке. Поместите шарики на трубы, чтобы предотвратить испарение.
   6. Пусть трубы охлаждают до комнатной температуры и добавляют 1 мл DDH ₂ O.
   7. Добавьте 400 мкл каждого из свежеприготовленного 12 г / л молибдата аммония и 50 г / л аскорбата натрия и вихревые перемешать.
   8. Тепло в течение 10 мин при 100 ° C с шариками в верхней части пробирки. Удалить труб из нагревательного блока и дайте им остыть до комнатной температуры.
   9. Измеряют поглощение образцов против заготовки (стандартного образца, содержащего 0 нмоль фосфата натрия) с помощью спектрометра при длине волны 797 нм.
   10. Определить содержание фосфатов образцов по отношению к стандартной кривой калибровки.
3. Воссоздание Opsin
   Примечание: Необходимо, чтобы определить оптимальные условия припухлость восстановления, поскольку они зависят от природы моющего средства, а такжев качестве липидной композиции и концентрации БУВ. Как БУВ изменяют свои свойства рассеяния света на отечность процесс можно контролировать путем измерения оптической плотности (рисунок 2), рассмотренный Риго и Леви ²⁴ и Geertsma и др. ^25.
   1. Пипетка 800 мкл БУВ (из раздела 1.1; а восстановление липидного после экструзии составляет 70%, ожидаемая концентрация БУВ составляет 3,6 мМ фосфолипидов) в пробирке 2 мл.
   2. Добавить 5,3 мкл буфера А и 34,7 мкл 10% (вес / объем) ДДМ, растворенного в буфере А.
   3. Выдержите в течение 3 ч при комнатной температуре с конечным над уровнем конца перемешивания.
   4. В то же время подготовить полистирольные шарики:
      1. Используйте 400 мг шариков на образец и взвесить их в стеклянном стакане.
      2. Промыть их дважды с метанолом, три раза водой и один раз буфером A. Для каждого шага использования промывной 5 мл жидкости и медленно перемешивать в течение 10 мин.
         Примечание: Рекомендуется подготовить полистиролшарики для нескольких образцов одновременно, например, весят в 6 г гранул и промывают 75 мл жидкости. Избыточные шарики можно хранить в холодильнике в течение нескольких дней.
   5. В течение последних 30 мин везикул дестабилизацию просушить НБД-меченного фосфолипида в шнековом-колпачок стеклянной трубки ( 'восстановление стеклянная трубка'): на одну пробу, 9,5 мкл НБД-PC (1 мг / мл в хлороформе, получа 0,4 моль% от общего количества фосфолипидов) сушат под струей азота в стеклянной трубке, а затем растворяли в 45 мкл 0,1% (вес / об) DDM в буфере А.
   6. После 3 ч везикул дестабилизацию добавить растворенный-НБД-меченного фосфолипида РГМ-растворимый белок и буфер А так, чтобы конечный объем 1 мл содержит 0,36% (вес / объем), то есть, 7 мМ, ДДМ.
      1. Таким образом, чтобы генерировать небелковых липосом (используемые в качестве контрольного образца) добавляют 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 60 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А; для протеолипосом добавить, для экзаменаPLE, 40 мкл белка (от типичного исходного раствора ~ 110 нг / мкл) в 0,1% DDM, 45 мкл НБД-PC (растворенного в 0,1% DDM), 20 мкл 0,1% DDM и 55 мкл буфера А ,
         Примечание: Порядок добавления должны быть в списке.
   7. Перемешивают образец еще в течение конца ч в течение конца при комнатной температуре.
   8. Добавляют 80 мг приготовленных гранул полистирола и инкубирование образца с конечным над уровнем конца перемешивания в течение 1 ч при комнатной температуре.
   9. Затем добавить еще 160 мг гранул полистирола и инкубировать с концом поверх конца перемешивание еще в течение 2 ч при комнатной температуре.
   10. Переносят образец (оставляя затраченные полистирольные шарики позади) к стеклянному с завинчивающейся крышкой пробирку, содержащую 160 мг свежего гранул полистирола и перемешать в течение ночи при температуре 4 ° С.
       Примечание: Самый простой способ переноса образца и избежать поглощая бусинок использовать пипетку Пастера, который нажимается на нижней части стеклянной трубки с небольшим положительным давлением. После того, как кончик пипетки твердо нанижней части трубы, затем образец может быть легко снята без помех со стороны бортов.
   11. На следующее утро, перенести образец в пробирке без переноса бусы и место на льду в рамках подготовки к пробе scramblase активности.

2. Scramblase Анализ активности

Примечание: Интенсивность флуоресценции липосом или протеолипосомах разбавлены буфером А контролируется с течением времени при добавлении дитионита в флуоресцентном спектрометре. Для получения стабильной начальную интенсивность флуоресценции регистрируется в течение по крайней мере 50 секунд (или до тех пор, стабильный сигнал не будет достигнуто) перед добавлением дитионита к образцу непрерывно перемешивают и затем следует по крайней мере, 500 сек после добавления дитионит.

1. Добавьте 1950 мкл буфера А на пластиковую кювету, содержащую мини-бар перемешайте.
2. Добавляют 50 мкл приготовленной Proteo (липосом), и пусть образец уравновешиваться в флуоресцентном спектрометр при постоянном перемешивании в течение нескольких секунд.
3. В то же время приготовить раствор 1 М дитионита в 0,5 М небуферизованном Трис (например, для двух образцов отвешивают 20 мг дитионита в пробирке и растворяют в 114 мкл охлажденного на льду 0,5 М Трис непосредственно перед использованием и хранить на льду в течение следующего образец).
   Примечание: дитионит раствор должен быть подготовлен свеже и не должно быть использовано более чем через 20 мин после приготовления; если много измерений должны быть сделаны, аликвоты дитионита могут быть взвешены заранее и растворяют непосредственно перед использованием.
4. Запустите мониторинг флуоресценции (возбуждение 470 нм, эмиссия 530 нм, ширина щели 0,5 нм).
5. Добавьте 40 мкл 1 М раствора дитионита в кювету 50 сек после начала флуоресценцию съемки (с использованием перегородку в крышке камеры кювета если это возможно) и продолжают регистрировать флуоресценцию в течение еще 400-600 сек.
6. Анализ данных, как описано в разделе 3.

3.Анализ данных

1. Кинетика Scrambling
   1. Охарактеризуйте флуоресценции след каждого образца , полученного с помощью анализа scramblase активности путем определения начального флюоресценции, F _I, перед добавлением дитионита, а конечная точка флюоресценции, F, достигается после того, как > 400 сек. F _I определяется для каждого образца как среднее значение флуоресценции , за период 30 сек перед добавлением дитионита.
   2. Определить данные конечной точки , соответствующие степени восстановления флуоресценции, R = 100 • F / F _я. Мы используем термины R _L для безбелковых липосом и R _P для Opsin содержащих протеолипосом.
2. Определение молекулярной массой Функционально Scramblase восстановленного
   1. Преобразование данных по уменьшению флуоресценции в соответствии со следующим уравнением:
      р (≥1 scramblase) = (R _P - R _L) / (R _макс - R _L) (уравнение 1)
      ЗАМЕТКА: Где R _макс является максимальное сокращение, которое получается , когда достаточное количество белка восстанавливали таким образом, что все пузырьки в образце обладают , по меньшей мере , одну функциональную scramblase, и р есть вероятность того, что конкретный везикул в реконструированном образце 'scramblase-активный », то есть он обладает , по меньшей мере , одной функциональной scramblase. Значение R _L , как правило , 45% , тогда как ³ R _Макс , как правило , 82,5% ^3, вместо ожидаемого 100% (R _макс может быть определено экспериментально для опсином протеолипосомах с ППР> 1 мг / ммоль). Как R _макс <100% предполагается , что субпопуляции везикул является невосприимчивой к восстановления. Для R _макс = 82,5%, доля везикул , что не может принять белок 0,35.
   2. Опишите связь между р (≥1 scramblase) и ППР (мг белка / ммоль фосфолипидов) по статистике Пуассона следующим образом:
      р (≥1 scramblase) = 1 - е -m = 1 - ехр (-PPR / а) (уравнение 2)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если м = количество scramblases на пузырьке, а = моно-экспоненциальной подгонки постоянной в единицах мг белка / ммоль фосфолипидов.
   3. Поскольку доля везикул не способствует карабкаться даже при высокой PPR (обсуждение см), изменить уравнение к:
      р (≥1 scramblase) = 1 - ехр (-PPR * / α) (уравнение 3)
      Примечание: Там , где ППР = ППР / (1- е), где F является огнеупорный популяция везикул или, в данном случае, ППР = ППР / 0,65 (Уравнение 4).
      Примечание: Подгонка константа α определяется путем подгонки график р (≥1 scramblase) по сравнению с PPR * с моно-показательной функции. Если опсина (молекулярная масса 41,7 кДа) функционально реконструируют в пузырьках 175 нм диаметра (каждый пузырек имеет 280,000 фосфолипиды ²⁶⁾ в качестве мономера, а = 0,187 мг ммоль ^-1. Если опсина димеризуется до восстановления ³ с получением scramblase-активных везикул, то α= 0,37 мг ммоль ^-1. Если PPR PPR , а не * должны были быть использованы для анализа, то соответствующие значения альфа будет 0,122 и 0,244 мг ммоль ^-1. Эти предсказанные значения для а предположим, что все молекулы Opsin функционально компетентны. Если только часть молекул компетентен карабкаться липиды, то соответствующие значения а будет больше.

Результаты

Описано воссоздание опсином в БУВ охарактеризовать его scramblase активности с использованием флуоресцентного анализа на основе. Анализируются результаты поместить нижний предел скорости опсина-опосредованной фосфолипида скремблирования и для определения олигомерно?...

Обсуждение

Анализ scramblase активности позволил нам изначально определить , что опсина обладает фосфолипидов scramblase активностью ^2. Анализ также позволил нам охарактеризовать scramblase активность Opsin путем тестирования специфичности (мы использовали различные НБД-меченых репортер липидов , таких к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	850457C	POPC
1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-rac-(1-glycerol) (sodium salt)	Avanti Polar Lipids	840457C	POPG
1-palmitoyl-2-{6-[7-nitro-2-1,3-benzoxadiazol-4-yl)amino]hexanoyl}-sn-glycero-3-phosphocholine	Avanti Polar Lipids	810130C	NBD-PC
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid	VWR Scientific	EM-5330	HEPES
NaCl	Sigma	S7653-1KG	NaCl
Dodecyl-β-D-maltoside	Anatrace	D310 5 GM	DDM
Fluorimeter cuvettes	sigma	C0918-100EA	cuvettes
Spectrofluorometer	Photon Technology International, Inc.	fluorimeter
Sodium hydrosulfite technical grade, 85%	Sigma	157953-5G	dithionite
GraphPad Prism 5 software			Prism
Tris Base	VWR	JTX171-3	Tris
LIPEX 10 ml extruder	Northern Lipids, Inc.		Extruder
Whatman, Drain disc, PE, 25 mm	Sigma	28156-243	Disc support
Whatman Nuclepore Track-Etched Membranes, 0.4 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110607	400 nm membrane
Whatman Nucleopore Track-Etched Membranes, 0.2 µm, 25 mm diameter	Sigma	WHA110606	200 nm membrane
sodium phosphate	Sigma	S3264-500G
VWR Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass, 13 x 100 mm	VWR Scientific	47729-572	glass tubes
Perchloric acid	Sigma	30755-500ML
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma	A-7302	ammonium molybdate
(+)-Sodium L-ascorbate	Sigma	A7631-25G	sodium ascorbate
Bio-Beads SM2 adsorbents	Bio Rad	1523920	polystyrene beads
2.0 ml Microtubes clear	VWR Scientific	10011-742	Reconstitution tubes
Reconstitution glass tube	VWR Scientific	53283-800	Reconstitution glass tubes
Zetasizer	Malvern		DLS