JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Here, we present methodology to generate and administer compound of interest-loaded poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microspheres to intact mouse islets in culture with subsequent immunofluorescence analysis of β-cell proliferation. This method is suitable for determining the efficacy of candidate β-cell mitogens.

Аннотация

Развитие биоматериалов значительно увеличило потенциал для целенаправленной доставки лекарственных средств к различным тканей и клеток типов, в том числе и панкреатических бета-клеток. Кроме того, биоматериала частицы, гидрогели и каркасы также предоставляют уникальную возможность для введения устойчивой, контролируемой доставки лекарственного средства к бета-клеток в культуре и в пересаженных тканей моделей. Эти технологии позволяют изучение факторов пролиферации кандидат β-клеток с использованием интактные островки и поступательно соответствующую систему. Кроме того, определение эффективности и целесообразности факторов кандидатов для стимуляции пролиферации β-клеток в системе культуры имеет решающее значение , прежде чем двигаться вперед , чтобы модели в естественных условиях. Здесь мы опишем метод совместного культивирования неповрежденные островки мыши с биоразлагаемого соединения , представляющего интерес (ИСП) -loaded поли (молочной-гликолевой кислоты) (PLGA) микросферы с целью оценки влияния устойчивого высвобождения на месте O вF митогенных факторов на пролиферацию β-клеток. Этот метод подробно описывает, как генерировать микросферы PLGA, содержащих нужный груз с использованием коммерчески доступных реагентов. В то время как описанный метод использует рекомбинантный фактор человеческого роста соединительной ткани (rhCTGF) в качестве примера, легко может быть использовано широкое разнообразие ИСП. Кроме того, этот метод использует 96-луночные планшеты для минимизации количества реагентов, необходимых для оценки пролиферации β-клеток. Этот протокол может быть легко адаптирован для использования альтернативных биоматериалов и другие характеристики эндокринные клетки, такие как выживаемость клеток и статуса дифференцировки.

Введение

Панкреатические бета-клетки являются единственными инсулин-продуцирующие клетки в организме и имеют решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы в крови. В то время как здоровые люди не имеют достаточную массу β-клеток и функционируют надлежащим образом регулировать содержание глюкозы в крови, больных сахарным диабетом характеризуются недостаточной массы β-клеток и / или функции 1,2. Было высказано предположение , что индуцирование пролиферации β-клеток в конечном итоге может увеличить массу β-клеток и восстановление гомеостаза глюкозы у пациентов с диабетом 3. Тем не менее, оценка и проверка потенциальных пролиферативных соединений β-клеток в неповрежденных островках необходимо, прежде чем эффективные методы лечения могут быть разработаны. Трансплантация трупных человеческих островков Into людей с диабетом восстанавливает гомеостаз глюкозы в крови в течение некоторого времени, но наличие и успех этой экспериментальной процедуры затрудняется нехваткой людских островками доступных для трансплантации и смерти -клеток в островках на кормеПересадка эр 4. Даже с открытием факторов , которые стимулируют размножение инсулин-продуцирующие клетки, основной проблемой до сих пор существует в реализации этих факторов на соответствующих сайтах в естественных условиях. Одна из стратегий для длительной местной доставки β-клеточных пролиферативных соединений является поли (молочной-со-гликолевой) кислоты (PLGA). PLGA имеет историю использования в FDA одобрило продукцию для доставки лекарств из - за его высокой безопасности, биоразлагаемости и кинетики с длительным высвобождением 5. В частности, PLGA , представляет собой сополимер лактида и гликолида , который деградирует с помощью гидролиза с водой либо в естественных условиях или в культуре в молочную кислоту и гликолевую кислоту, которые в природе метаболитов в организме. Инкапсулированное лекарственное соединение может выделяться в окружающую среду путем диффузии как и / или механизмов высвобождения деградации под контролем. Инкапсуляция ИСП обеспечивает защиту от ферментативного разложения, повышение биодоступности реагента по сравнению с unencapsulaTed ИСП 5. Мы предполагаем , что PLGA Микросферы могут быть использованы для введения соединений - кандидатов к интактным островками в культуре, и в конечном счете в естественных условиях. Тестирование эффективности PLGA для введения β-клеточные митогены к островки ех естественных условиях имеет решающее значение , прежде чем протоколы трансплантации исследуются.

В настоящее время не существует метод для измерения пролиферации β-клеток у живых животных. Эксперименты по оценке эффективности потенциальных соединений пролиферативных в естественных условиях , следовательно , требуют введения этих соединений в живых животных, с последующим рассечением и переработке поджелудочных желез для иммунноокрашивания. Такие протоколы являются дорогостоящими и трудоемкими и требуют соединения для вводить системно, без каких-либо гарантий того, что они будут достигать островки. С другой стороны, несколько иммортализованные β-клеточные линии доступны для изучения инсулин-продуцирующих клеток в культуре, но эти клеточные линии не имеют архитектуру островковых и экологичет найдено в живых организмах 6. Иммортализованные β-клеточные линии также характеризуются как имеющие гораздо более высокую степень репликации , чем эндогенных бета-клеток в живом организме , таким образом , затрудняя анализ соединений , которые индуцируют пролиферацию. В данном исследовании мы опишем протокол, который использует интактные островки, выделенные из взрослых мышей. В отличие от β-клеточных линий, неповрежденные островки сохраняют нормальную архитектуру островок. Точно так же, в отличие от экспериментов , проведенных в естественных условиях, которые применяют пролиферативные соединений непосредственно к культивируемым интактные островки значительно уменьшает количество реагентов , которые необходимы для точного измерения пролиферации β-клеток.

Настоящее исследование использует PLGA для администрирования ИСП, в данном примере, рекомбинантный Connective тканевого фактора роста человека (rhCTGF). Описанный здесь метод дает значительное преимущество перед введением сырого соединения к культивируемым островками, поскольку оно позволяет для непрерывного высвобождения соединения в гоэлектронные средства массовой информации. Следует отметить, что этот анализ может быть модифицирован для введения широкого спектра белков и антител, которые представляют интерес для неповрежденных островках. Воздействие на других эндокринных типов клеток, в том числе альфа-клеток, также могут быть проанализированы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры были утверждены и выполнены в соответствии с Institutional Animal Care и использование комитета Вандербильта.

1. Маркировка ИСП с флуорофором (Необязательно)

  1. Выберите флуоресцентный краситель , который будет вступать в реакцию с свободного первичного амина (например, на белок), такие как сложные эфиры или производные сукцинимидиловых флуоресцеина, чтобы визуализировать микросферы груз. Растворите 8х молярный избыток (по отношению к числу молей ИСП) флуорофора в 200 мкл диметилсульфоксида (ДМСО).
  2. Ресуспендируют 50 мг ИСП до конечного объема 800 мкл в растворе носителя (конечной концентрации 62,5 нг / мкл). Решение транспортного средства будет варьироваться в зависимости от источника ИСП.
    Примечание: Типичное транспортное средство решения включают в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS) или ДМСО.
  3. Добавьте все решения Флуорофор / ДМСО с шага 1.1 и ресуспендируют ИСП. Вихревые в течение ночи при температуре 4 ° С. В качестве альтернативы, вихревые реакционную смесь при комнатной температуре(КТ) в течение 4 часов.
  4. После реакции мечения, удалить избыток флуорофор с использованием колонки обессоливания.
    1. Слить буфер хранения из колонки обессоливания и промыть 16 мл деионизированной воды. Выбросьте все поток через.
    2. Добавьте флуоресцентно меченого ИСП в колонну обессоливания. Элюировать 1,2 мл деионизированной воды и собирают поток через.
    3. Повторите шаг элюирование еще четыре раза, каждый раз добавляя 1,2 мл деионизированной воды и сбора потока через в качестве отдельного образца.
    4. Заморозить все собранные потока через образцы при -80 ° С и лиофилизации в соответствии с инструкциями изготовителя в течение 24 часов.

2. ИСП загруженным Микросфера Подготовка с помощью воды Вода в масле-в-Emulsion Solvent Испарение Метод

  1. Добавляют 1 мг флуоресцентно меченого ИСП к 100 мкл деионизованной воды с образованием первой водной фазы (W1).
  2. Растворите 65 мг поли (молочной-со-гликолевой ACId) (50:50 лактид: гликолид, молекулярная масса 54000 - 69000) в 750 мкл дихлорметана в микроцентрифужных трубки. Ultrasonicate в течение 10 - 30 секунд (при 160 Вт) для полного растворения PLGA. Это образует масляную фазу (O).
  3. Добавьте все фазы W1, полученной на этапе 2.1 в фазу O в каплям образом. Эмульсию с использованием ручного гомогенизатора при 20000 оборотах в минуту в течение 30 сек с образованием фазы W1 / O.
  4. Добавьте все фазы W1 / O в каплям образом до 15 мл 1% (вес / объем) водного раствора поливинилового спирта (ПВС) раствор (ПВС) и эмульгирования с использованием ручного гомогенизатора при 20000 оборотах в минуту в течение 30 сек ,
  5. Перенести все эмульсии, полученной на этапе 2.4 до 200 мл круглодонную колбу, и с учетом 635 мм ртутного столба вакуума с использованием роторного испарителя в течение 1 часа, чтобы удалить растворитель, и генерировать водную фазу.
  6. Аликвотные 1 мл водной фазы, полученной на этапе 2,5 до четырнадцати микропробирок. Центрифугирование водного раствора в микроцентрифужных пробирках при 7500XG в течение 8 мин.
    Примечание: На этом этапе микросферы присутствуют в оставшемся водном растворе и концентрируют до нижней части трубки микроцентрифужных.
  7. Тщательно удалить 900 мкл водного раствора, поступающего из микропробирок с помощью микропипетки, пипетирования с тем, чтобы не мешать микросферы на нижней части трубки микроцентрифужных.
    1. Промыть микросферы избытка PVA добавлением 1 мл деионизованной воды в каждую пробирку микроцентрифужных. Центрифуга при 7500 х г в течение 8 мин, и снова тщательно удалить 900 мкл водного раствора, поступающего из микропробирок с помощью микропипетки, пипетирования с тем, чтобы не мешать микросферы на нижней части трубки микроцентрифужных.
      Примечание: Оставшиеся 100 мкл водного раствора содержит сгенерированные микросферы.
  8. Замораживание водного раствора микросферы, генерируемой на этапе 2.7 при -80 ° С.
  9. Лиофилизации микросферы с использованием лиофилизатор в соответствии с производителемИнструкции и хранят при -20 ° C.
    Примечание: Измерить эффективность нагружения ИСП путем полного растворения PLGA микросферы и определения концентрации белка по сравнению со стандартной кривой свободного белка 7.
  10. В качестве отрицательного контроля, сформировать партию "пустой" микросферы (далее именуемые контрольными микросферами).
    Примечание: Генерирование контрольных микросферах идентичен генерации гидрофильных ИСП--ных микросфер, без ИСП дополнение к 800 мкл раствора носителя на стадии 1.2. Частицы управления Match в массовой концентрации PLGA по отношению к ИСП--ных микросфер PLGA для β-клеток митогеном анализа.

3. Подготовка Островок медиакультуры и предварительного анализа средств массовой информации

  1. Приготовьте 200 мл среды для культивирования интактные островки мыши: RPMI 1640, дополненной 11 мМ глюкозы, 10% лошадиной сыворотки, 100 ед / мл пенициллина G и 100 мкг / мл стрептомицина (далее какпусть питательные среды).
    Примечание 1: В отличие от эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), лошадиной сыворотки не хватает плацентарного лактогена, индуктор пролиферации β-клеток, который путает анализ в анализе пролиферации.
    Примечание 2: Поскольку микросферы PLGA не стерилизовать перед употреблением, добавление антибиотиков к культуральной среде имеет решающее значение, чтобы избежать микробиологического загрязнения.
  2. Удалить 25 мл островковой культуральной среды с электронным дозаторов и поместите в 50 мл коническую трубку. Дополнение 25 мл островковых культуральной среды в 50-мл коническую трубку с конечной концентрации 0,2 мМ EGTA, чтобы генерировать заранее среде для анализа.
    Примечание: Добавление EGTA слегка ослабнет контакты клетка-клетка в островках, не изменяя островок архитектуры. Это помогает обеспечить ИСП может достигать внутренние клетки островка и помогает предотвратить некроз центрального островка.

4. Культивирование Малонарушенных островки Mouse

  1. Изолировать интактные островки из предварительно выбранного штамма, пола, Agе, и генотип мышей следующиерутины коллагеназы пищеварения поджелудочной железы 8,9. Бассейн вместе с островками как образцов.
  2. Аликвоты 40 островки в одну лунку 96-луночного планшета для культуры ткани в 200 мкл культуральной среды островка. Визуально Островки размера матч на лунку (точная оценка островковой эквивалентности (IEQ) между образцами не требуется). Заполните пустые лунки, непосредственно примыкающих к скважинам с островками с 200 мкл стерильной водой для получения буфера испарения. Культура островки в средствах массовой информации в течение ночи при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха и 5% CO 2.

5. Повторное приостановление ИСП-нагруженных и управления PLGA Микросферы

  1. После ночного восстановления островковых клеток поджелудочной железы, ресуспендируют микросферы путем добавления предварительно среде для анализа в одну аликвоту лиофилизированных ИСП-нагруженных PLGA микросферы, так что конечная концентрация ИСП в микроцентрифужных трубки составляет 10 нг / мкл (количество ИСП, присутствующего в данном количестве генерируемые MICROSpheres была определена на шаге 2.9). Разрушать ультразвуком ресуспензированной ИСП-нагруженные микросфер в водяной бане со льдом в течение 10 мин при 160 Вт с 10 с длинными импульсами при температуре 4 ° С.
  2. управления Ресуспендируют PLGA Микросферы добавлением такого же объема предварительно среде для анализа в равной массе лиофилизированный управления PLGA микросферы. Разрушать ультразвуком ресуспендировали контрольные микросферы PLGA на водно-ледяной бане в течение 10 мин при 160 Вт с 10 с длинными импульсами при температуре 4 ° С.
  3. Визуально подтверждают микросферы диспергируют с помощью пипетки 2 мкл ресуспендировали микросферы между двумя покровные стекла. Визуализируйте микросферы с использованием объектива 40X на эпифлуоресцентной или светлопольному микроскопом.
  4. Если значительное агрегацию микросфер по-прежнему видна, гомогенат в бане с ледяной водой в течение еще 10 мин при 160 Вт с 10 с длинными импульсами при 4 ° С и повторной визуализации ресуспендировали микросферами.

6. Лечение островки с ИСП-нагруженных или управления PLGA Микросферы

  1. Для каждой лунки, чтобы лечить с помощью ИСП--ных микросфер, готовят среде для анализа путем разбавления 10 нг / мкл ресуспензированной ИСП микросферы с предварительно среде для анализа до конечного объема 100 мкл и заранее определенной конечной концентрации.
    Примечание: Оптимальная конечная концентрация белка будет варьироваться для каждого ИСП, используемой для этого анализа. В идеале, диапазон конечных концентраций тестируются.
  2. Для каждой лунки, которые будут использоваться в качестве контроля, готовят контрольный среде для анализа путем разбавления ресуспензированной управления PLGA микросферы, генерируемой на этапе 5.2 с таким же объемом разбавления, используемой для разбавления ИСП-микросферами, загруженными на этапе 6.1.
    Примечание: Островки, обработанные для анализа управления СМИ будет служить в качестве отрицательного контроля, чтобы дать возможность обнаружения какого-либо эффекта пустые микросферы могут иметь на экспериментальных результатах.
  3. Тщательно удалите 100 мкл островок культуральной среды из каждой лунки с помощью микропипетки таким образом, чтобы не островки не вытесняют из лунок. Осторожно добавьте 100 мкмл анализа средств массовой информации или 100 мкл аналитического контроля СМИ в каждую лунку.
  4. Выдержите островки при 37 ° С в атмосфере 95% воздуха и 5% CO 2 в течение трех дней.

7. Диспергирование интактных островки на предметные стекла микроскопа

  1. Через три дня, используйте микропипетки тщательно удалить и выбросить анализа средств массовой информации из всех лунок, чтобы не выбивать островки. Осторожно добавьте 200 мкл PBS с островками, чтобы вымыть их в среде для анализа. Осторожно снимите и выбросьте PBS с микропипетки и осторожно вымыть островки снова с дополнительным 200 мкл PBS.
  2. Удаляют PBS с микропипетки и добавить 100 мкл 0,025% трипсина, 2 мМ раствора ЭДТА. Инкубируют при комнатной температуре в течение 3 мин. Пипеткой островки в трипсин-ЭДТА раствором вверх и вниз каждые 2 мин до тех пор, пока островки визуально подтверждено, диспергируют в отдельные клетки (обратите внимание, что некоторые небольшие скопления клеток все еще могут присутствовать) с помощью светового микроскопа. Перенести весь объем каждой скважины индивидуальнойLY в labeled- микропробирок.
  3. Добавить 400 мкл культуральной среды островковых каждому микроцентрифужных трубки, чтобы остановить трипсина-опосредованной клеточной диссоциации.
  4. Центрифуга образцов в течение 5 мин при 100 мкг при 4 ° С, чтобы осадить клетки островка на дно микропробирок.
  5. Осторожно удалите супернатант с помощью микропипетки и ресуспендируют осадок в 200 мкл свежей культуральной среды островок.
  6. Использование цито-центрифуга, Центрифуга диссоциированных островки при 140 мкг в течение 3 мин на заряженных микроскопа.
  7. Воздушные сухие слайды при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем нарисовать прямоугольник вокруг диссоциированных островками с гидрофобным маркером.
  8. Закрепить клетки с 75 мкл 4% параформальдегида (PFA) при комнатной температуре в течение 10 мин. Удалить 4% PFA и осторожно промыть клетки в 75 мкл PBS в два раза. После промывки проницаемыми клеток с 75 мкл 0,2% Тритон Х-100 в PBS в течение 10 мин. Затем промыть клетки с 75 мкл PBS.
    Внимание: ПФА, как известно, вызывает аллергических реакций, канцерогенным и токсичным.

    9. 8. Иммунофлуоресценции Этикетировочное диссоциированного островки для инсулина и пролиферации клеток Маркер, Ki67

    1. Приготовьте влажную камеру, помещая два мокрых бумажных полотенец в нижней части емкости предметного стекла микроскопа коробки 100 слайдов.
    2. Место скользит вниз (плоские клетки лицевой стороной вверх) во влажной камере. Подготовка образцов для маркировки с помощью аспирационных PBS с предыдущей стадии промывки с использованием микропипетки и добавлением 75 мкл блокирующего раствора (5% Нормальный Осел сыворотка (НСР) в PBS) для каждого слайда, чтобы блокировать неспецифическое связывание антител к образцам. Инкубируйте слайды в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре.
    3. Аккуратно аспирата блокирующего раствора с помощью микропипетки и добавить 75 мкл раствора первичного антитела, содержащего свинки анти-инсулин и кролика с анти-Ki67 антитела, разбавленный 1 мкг / мл в 5% НСР в PBS. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 часа.
      Примечание: Альтернативные маркеры пролиферации клеток, включают ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и phosphohistone H3 (PH3),
    4. Аккуратно аспирата раствор первичного антитела с помощью микропипетки и промыть клетки с 75 мкл PBS. Отберите PBS с использованием микропипетки и прополоскать клеткам еще два раза, каждый раз по 75 мкл PBS. Инкубируйте каждого образца 75 мкл анти-морской свинки Cy5 вторичного антитела и анти-кроличьим Су3 вторичного антитела, разбавленного до концентрации 2 мкг / мл в блокирующем растворе в течение 1 часа при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте вторичные антитела, меченные же или спектрально перекрывающихся флуорофора, который уже используется для обозначения микросферы.
    5. раствора вторичного антитела Аспирировать с использованием микропипетки и инкубировать в 75 мкл 300 нМ DAPI в PBS в течение 3 мин при комнатной температуре. Отберите DAPI, используя микропипетку и промыть в деионизированной воде в течение 5 мин.
    6. Аккуратно аспирата воду из образцов с использованием микропипетки. Пятно капли (примерно 100 мкл) быстрой сушки монтажного раствора, содержащего antifade реагент на покровного стекла. Обратить сторону микроскопа образца вниз, оNto монтажного раствора. Аккуратно нажмите покровное против скольжения с использованием наконечника пипетки, чтобы удалить пузырьки и вытрите лишнюю жидкость с помощью мягкой ткани для чистки. Разрешить покровные высохнуть в течение ночи при комнатной температуре.

    9. Получение изображения и анализ

    1. Используйте эпифлуоресцентной микроскоп с подключенной камеры для получения изображения. Для каждого флуорофора, определить оптимальное время экспозиции (обычно 20 мс для DAPI, 40 - 80 мс для инсулина и 250 мс для Ki67). Убедитесь, что параметры захвата изображений одинаковы для всех образцов.
    2. Для каждого образца вручную подсчитывать 3000 инсулин-позитивных клеток и тех, сосчитать, сколько также Ki67-положительными. Только рассчитывать инсулин-позитивных клеток, которые имеют четко определенную и четко видимое ядро. Рассчитывают процент пролиферирующих -клеток для каждого образца путем деления числа Ki67-положительных / инсулин-позитивных клеток на общее количество инсулина-положительных клеток и умножением на 100.
    3. После того, как гetermining процент пролиферирующих бета-клеток для каждого образца, определить, есть ли статистически значимая разница в пролиферации β-клеток существует между контролем и экспериментальных образцов на основе анализа результатов с односторонним ANOVA с использованием коммерчески доступного статистического программного обеспечения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Рисунок 1 представляет собой визуальное представление микросферах , полученных с использованием вышеуказанного протокола. Протокол, описанный здесь, дает rhCTGF--ных микросфер различного размера. Самая большая часть микросфер будет находиться в диапазоне от 1 ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Исследование пролиферации β-клеток в культуре, как правило, мешает несколько трудностей. Во-первых, иммортализованные β-клеточные линии характеризуются более высокими степенями пролиферации, чем то, что находится в эндогенных бета-клеток в живых островками. Кроме того, эти линии иммор...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

The authors would like to thank Bethany Carboneau (Vanderbilt University) for critical reading of this manuscript. We also thank Anastasia Coldren (Vanderbilt University Medical Center Islet Procurement and Analysis Core) for islet isolations, and Dr. Alvin C. Powers (Vanderbilt University Medical Center) and Dr. David Jacobson (Vanderbilt University) for use of their centrifuge and tissue culture facility. This research involved use of the Islet Procurement and Analysis Core of the Vanderbilt Diabetes Research and Training Center supported by NIH grant DK20593. This work was supported by an American Heart Association Postdoctoral Fellowship (14POST20380262) to R.C.P., and grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2011-592), and Department of Veterans Affairs (1BX00090-01A1) to M.A.G.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Oregon Green 488 Carboxylic Acid, Succinimidyl Ester, 6-isomerThermoFisher ScientificO6149For labeling COI with fluorophore
DMSO Dimethyl SulfoxideFisher BioReagentsBP231-1For dissolving fluorophore in step 1
Disposable PD-10 Desalting ColumnsGE Healthcare17-0851-01Desalting column used in step 1
Resomer RG 505, Poly(D,L-lactide-co-glycolide), ester terminated, molecular weight 54,000 - 69,000Sigma-Aldrich739960Used in generation of microspheres in step 2
Poly(vinyl alcohol) molecular weight 89,000 - 98,000Sigma-Aldrich341584Used in generation of microspheres in step 2
RPMI 1640Thermo Scientific11879-020For culturing islets
Dextrose AnhydrousFisher BioReagents200-075-1Supplement for islet media
Penicillin-StreptomycinSigma-AldrichP4333Antibiotics for islet media
Normal horse serumJackson ImmunoResearch008-000-121Supplement for islet media
96-well tissue culture plateCorning3603For culturing islets
Ethylene glyco-bis(2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acidSigma-AldrichE4378Supplement for pre-assay islet media
Cytospin 4 CytocentrifugeThermo ScientificA78300003For spinning cells onto microscope slides
EZ Single CytofunnelThermo ScientificA78710020For spinning cells onto microscope slides
Ethylenediaminetetraacetic acidFisher BioReagentsBP118-500Used in dissociating islets
paraformaldehydeSigma-AldrichP6148For fixing cells
Triton  X-100Fisher BioReagentsBP151For permeabilizing cells
Normal donkey serumJackson ImmunoResearch017-000-121Blocking reagents for immunofluorescence
Anti-Ki67 antibodyabcamab15580For Ki67 immunofluorescence
Polyclonal Guinea Pig Anti-InsulinDakoA0564For insulin immunofluorescence
Cy3 AffiniPure Donkey Anti-RabbitJackson ImmunoResearch711-165-152For Ki67 immunofluorescence
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Guinea PigJackson ImmunoResearch706-175-148For insulin immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)ThermoFisher ScientificD1306For nuclei visualization in immunofluorescence
Aqua-MountLerner Laboratories13800Fast drying mounting media
FreeZone -105 °C 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry SystemLabconco7382020For lyophilization of microspheres

Ссылки

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Levy, J., Atkinson, A. B., Bell, P. M., McCance, D. R., Hadden, D. R. Beta-cell deterioration determines the onset and rate of progression of secondary dietary failure in type 2 diabetes mellitus: the 10-year follow-up of the Belfast Diet Study. Diabet Med. 15 (4), 290-296 (1998).
  3. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85 (4), 1255-1270 (2005).
  4. McCall, M., Shapiro, A. M. Update on islet transplantation. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), 007823(2012).
  5. Danhier, F., et al. PLGA-based nanoparticles: an overview of biomedical applications. J Control Release. 161 (2), 505-522 (2012).
  6. Skelin, M., Rupnik, M., Cencic, A. Pancreatic beta cell lines and their applications in diabetes mellitus research. ALTEX. 27 (2), 105-113 (2010).
  7. Rui, J., et al. Controlled release of vascular endothelial growth factor using poly-lactic-co-glycolic acid microspheres: in vitro characterization and application in polycaprolactone fumarate nerve conduits. Acta Biomater. 8 (2), 511-518 (2012).
  8. Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16 (1), 35-39 (1967).
  9. Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. J Vis Exp. (7), e255(2007).
  10. Mukherjee, B., Santra, K., Pattnaik, G., Ghosh, S. Preparation, characterization and in-vitro evaluation of sustained release protein-loaded nanoparticles based on biodegradable polymers. Int J Nanomedicine. 3 (4), 487-496 (2008).
  11. Riley, K. G., et al. Connective tissue growth factor modulates adult beta-cell maturity and proliferation to promote beta-cell regeneration in mice. Diabetes. 64 (4), 1284-1298 (2015).
  12. Mosser, R. E., Gannon, M. An assay for small scale screening of candidate beta cell proliferative factors using intact islets. Biotechniques. 55 (6), 310-312 (2013).
  13. Carvell, M. J., Marsh, P. J., Persaud, S. J., Jones, P. M. E-cadherin interactions regulate beta-cell proliferation in islet-like structures. Cell Physiol Biochem. 20 (5), 617-626 (2007).
  14. Wakae-Takada, N., Xuan, S., Watanabe, K., Meda, P., Leibel, R. L. Molecular basis for the regulation of islet beta cell mass in mice: the role of E-cadherin. Diabetologia. 56 (4), 856-866 (2013).
  15. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  16. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  17. Daoud, J., Rosenberg, L., Tabrizian, M. Pancreatic islet culture and preservation strategies: advances, challenges, and future outlook. Cell Transplant. 19 (12), 1523-1535 (2010).
  18. Carter, J. D., Dula, S. B., Corbin, K. L., Wu, R., Nunemaker, C. S. A practical guide to rodent islet isolation and assessment. Biol Proced Online. 11, 3-31 (2009).
  19. Xu, Q., He, C., Xiao, C., Chen, X. Reactive Oxygen Species (ROS) Responsive Polymers for Biomedical Applications. Macromol Biosci. 16 (5), 635-646 (2016).
  20. Makadia, H. K., Siegel, S. J. Poly Lactic-co-Glycolic Acid (PLGA) as Biodegradable Controlled Drug Delivery Carrier. Polymers (Basel). 3 (3), 1377-1397 (2011).
  21. Cui, F., Shi, K., Zhang, L., Tao, A., Kawashima, Y. Biodegradable nanoparticles loaded with insulin-phospholipid complex for oral delivery: preparation, in vitro characterization and in vivo evaluation. J Control Release. 114 (2), 242-250 (2006).
  22. Kavanaugh, T. E., Werfel, T. A., Cho, H., Hasty, K. A., Duvall, C. L. Particle-based technologies for osteoarthritis detection and therapy. Drug Deliv Transl Res. , (2015).
  23. Joshi, R. V., Nelson, C. E., Poole, K. M., Skala, M. C., Duvall, C. L. Dual pH- and temperature-responsive microparticles for protein delivery to ischemic tissues. Acta Biomater. 9 (5), 6526-6534 (2013).
  24. Poole, K. M., et al. ROS-responsive microspheres for on demand antioxidant therapy in a model of diabetic peripheral arterial disease. Biomaterials. 41, 166-175 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

117

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены