Визуальное стромул Частота с флуоресцентной микроскопией

Резюме

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Аннотация

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Введение

Chloroplasts are dynamic organelles in plant cells responsible for photosynthesis and a host of other metabolic processes. Signaling pathways from the chloroplast also exert significant influence on plant physiology and development, coordinating plant responses to environmental stress, pathogens, and even leaf shape^1-6. Recently, biologists have gained interest in a poorly understood aspect of chloroplast structure: stromules, very thin stroma-filled tubules that extend from the surface of the chloroplast⁷.

The biological functions of stromules remain unknown, although stromule frequency is known to vary in response to environmental stimuli^7-9, and stromules may be capable of transmitting signaling molecules between organelles⁶. All types of plastids (not only the green, photosynthetic chloroplasts, but also clear leucoplasts, starch-filled amyloplasts, and pigmented chromoplasts, to name a few types of plastids) make stromules, and stromules are found in all land plant species that have been examined to date. Stromules can extend and retract dynamically, appearing or disappearing within seconds, or they can remain relatively stationary for long times. One of the major hurdles facing stromule biologists is that stromules are often studied using dramatically different methods, tissues, and species, making comparisons across the stromule biology literature difficult. Going forward, standard practices and thorough descriptions of the experimental systems used to study stromules will be critical to discovering the function of these ubiquitous features of chloroplast morphology.

Here we describe methods for visualizing stromule formation in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana leaves. In the mesophyll, chloroplasts are densely packed into large, three-dimensional cells, which makes it difficult to accurately and rapidly visualize stromules by confocal microscopy. By contrast, epidermal cells are relatively flat, contain fewer chloroplasts, and are at the surface of the leaf, allowing for easy and rapid visualization of stromules. N. benthamiana is an ideal model system for these experiments because, unlike many plant species, all cells in the epidermis of N. benthamiana make chloroplasts¹⁰. In the epidermis of most plants, including Arabidopsis thaliana, only the stomatal guard cells have chloroplasts, while other epidermal cells have "leucoplasts", plastids that are clear, relatively amorphous, and nonphotosynthetic^9,11,12. Thus, whereas a single field of view of an A. thaliana epidermis might show only a handful of chloroplasts in a pair of guard cells, a field of view of an N. benthamiana epidermis will include dozens or even hundreds of chloroplasts. All of the methods described here, however, can be modified to investigate other questions in stromule biology; for example, we have used the same approach to study leucoplast stromules of A. thaliana⁹.

протокол

Примечание: Для этого протокола, мы сосредоточились на опробование стромул частоту в эпидермисе N. benthamiana листья. Несколько устойчивых трансгенных линий были сформированы , которые могут быть использованы для этой цели, в том числе 35S _PRO: FNRtp: EGFP , ¹³ и NRIP1: Cerulean ^6. Обе эти линии показывают устойчивую экспрессию флуорофоров в хлоропласт строме листьев, выращенных в широком диапазоне условий. В качестве альтернативы, хлоропластов таргетингом флуорофоры могут быть выражены в скоротечно N. benthamiana с использованием Agrobacterium преобразований ^13. Это меньше , чем идеал трансгенных линий, так как Agrobacterium инфильтрацию вызывают некоторые базальные защитных реакций в N. benthamiana и взаимодействия с Agrobacterium может изменять частоту стромул в листе ^14, потенциально усложняя интерпретацию результатов. И, наконец, визуализировать стромул образование в пробирке,Хлоропласты могут быть извлечены из любых видов растений, с использованием либо генетически кодируемых флуорофоры или флуоресцентный краситель, как описано в разделе 5 ниже. ^9,15

Примечание:. Подробные методы выращивания растений были описаны ранее ¹⁶ Вкратце, растут N. benthamiana растения в 4 -х "горшочки , наполненные какой - либо профессиональной почвенную смесь , которая обеспечивает хороший дренаж. Покрыть рассаду с прозрачным пластиковым куполом в течение первых 10-14 дней , чтобы обеспечить влажную среду для прорастания. Добавление любого стандартного смеси удобрений в соответствии с инструкциями производителя по 14- дневного возраста растения. выращивать растения под белым светом, используя ~ 100 мкмоль фотонов м ^-2 сек ^-1 интенсивность света. Водные растения регулярно.

1. Подготовка образцов листьев для визуализации

Примечание: динамика стромул страдают от ранив ^8, поэтому препарат ткани следует проводить непосредственно перед визуализируя стромулс помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. В идеале, выборка должна быть визуализированы с 15 мин после снятия с завода.

1. Вырезать небольшой участок листа с помощью очень острым лезвием бритвы. Всегда используйте один и тот же участок листа для консистенции, и быть уверенным, чтобы визуализировать ту же поверхность (адаксиальная или абаксиальный) во всех экспериментах.
2. Сразу же после отрезания секции листа, погрузить раздел листьев в 5 мл безыгольного шприца, наполненного водой, удалить воздух из шприца, и применять вакуум путем покрытия шприца отверстие пальцем и потянув поршень.
   1. Отпустите поршень осторожно, чтобы не повредить участок листа. Повторите это два или три раза, или пока большая часть воздуха не был удален, и лист, как представляется, темно-зеленый.
      Примечание: Этот шаг удаляет воздух в листе, которые могут помешать точной визуализации стромул.
3. Добавить каплю воды на предметное стекло и поместите раздел лист на этой капли. Затем добавьте еще один ДрОп воды в верхней части листа, и место покровное стекло над листом. Если есть какие-то пузырьки воздуха, слегка постучите покровное, пока они не будут удалены. Ползун теперь готов к микроскопии, а также должны быть визуализированы немедленно.

2. Визуализация стромул с конфокальной флуоресцентной микроскопии

1. С проходящем свете, фокус на поле зрения вблизи центра участка листа (от клеток, поврежденных лезвие бритвы). Используйте объектив 20X, так что многие хлоропласты могут быть визуализированы одновременно. Сохранение изображения с пропускаемого света таким образом, чтобы типы клеток можно отличить позже, если это необходимо.
2. Включите источник освещения для лазера с соответствующими возбуждения и эмиссии фильтров для использования флуорофор. Например, возбуждают GFP с 488 нм лазером и собирать выбросы между 500 нм и 525 нм.
   1. Использование ПО микроскопа, выберите канал GFP и нажмите, чтобы отрегулировать обскуры диафрагму 1 Aiчень блок. Выберите лазерное сканирование, чтобы начать визуализировать образец, а затем нажмите на канал GFP для регулировки интенсивности лазерного излучения и усиления детектора, чтобы минимизировать мощность лазера в то же время четко визуализировать стромул. После того, как эти параметры были определены, держать их как можно более последовательными во всех экспериментах.
3. Приготовьте г -stack эксперимент , который будет собирать серию изображений через эпидермы листьев в поле зрения.
   1. Для г -stack, включают в себя все эпидермальные хлоропластов в поле зрения , чтобы избежать смещения (например, если хлоропласты вблизи поверхности листа имеют больше стромул при условиях испытания).
   2. Возьмите изображения на максимальный интервал возможно , что будет включать в себя все стромул но сводят к минимуму время , необходимое для г -stack. Например, если 1 Эри единица эквивалентна секции конфокальной в фокусе, который глубоко 2 мкм, принимая изображение каждые 2 мкм, вероятно, идеальным.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лист epidermis является неровная поверхность, таким образом, общая глубина г -stack будет варьироваться в зависимости от образца; В большинстве Z -stacks потребует 10-20 изображений, но может включать в себя больше.
   3. Отрегулируйте скорость сканирования и разрешение изображения по мере необходимости , чтобы убедиться , что г -stack собирают быстро (обычно в течение 5-10 мин, если это возможно). Сохраните г -stack для последующего анализа.

3. Обработка изображения

1. Определить стромул частоту с помощью любого программного обеспечения для анализа изображений. Для этого протокола, мы рекомендуем использовать ImageJ, который публично доступен из Национальных институтов здравоохранения (http://imagej.nih.gov/ij/~~HEAD=pobj) или популярной модернизации ImageJ, Фиджи (http://fiji.sc /Фиджи).
2. Слияние г -stack в одно изображение с использованием максимальной проекции интенсивности в программном обеспечении.
3. Определить и вручную пересчитать все хлоропласты в изображении.
4. Для каждого хлоропластов, визуально определить, действительно ли один или несколько стромулрассматриваются простирается от хлоропластов в объединенном Z -stack изображения. Для примера смотрите рисунок 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку биологические функции стромул не известны, любой тонкий, стромы заполненный, трубчатое продолжение от хлоропластов можно считать "стромул", независимо от их длины. Как правило, стромы заполненные расширение из хлоропласта является стромул , если оно меньше , чем примерно 1 мкм в диаметре вдоль большей части ее длины ^7. Убедитесь в том, что один человек анализирует все изображения для контроля за субъективных различий в определении того, является ли или нет хлоропласта в стромул. Второй исследователь должен самостоятельно проверить частоты стромул для дальнейшего снижения субъективных предубеждений.

4. Экспериментальный дизайн и отбор проб

Примечание: стромул частота сильно варьирует между листьями, но несколько сообщений предполагают, что есть небольшое изменение в стромул частоты в пределах Indiviдвойного листа ^9,17.

1. Вычислить частоту листьев стромул из одного поля зрения одного листа. Выбросите лист, и рассмотреть это независимый образец. Не рассматривать отдельные поля зрения с одного листа в качестве независимых выборок.
   Примечание: Там нет сильного консенсуса о том, как лучшие изменения в стромул мера активности, и до тех пор пока функция стромул не более четко определены, исследователи должны продолжать проявлять творческий подход в количественной оценки динамики стромул. Для сравнения по литературе, однако, использовать общие стандарты отчетности должны быть использованы в дополнение к более творческих подходов. Как минимум, всегда сообщать частоту хлоропластах, которые имеют один или более стромул.
2. Определить частоту хлоропластов, которые имеют стромул в поле зрения. Используйте ImageJ для идентификации всех хлоропластов в поле зрения. Затем для каждого хлоропластов, определяют хлоропластов сформировал ли по крайней мере один стромул. Частота стромул Доклад как PercentaGE хлоропластов с стромул.
   Примечание: Некоторые исследователи преобразовать процент, например, с помощью преобразования арксинуса, прежде чем сообщать частоты стромул; в то время как это вариант для статистического анализа, арксинус стромул частоты не является интуитивно понятным значение, и не нужно сообщать в основном тексте или фигур исследования.
   1. В качестве альтернативного подхода, подсчитать общее количество стромул, и разделить его на общее количество хлоропластов.
      Примечание: В большинстве случаев, это даст аналогичные результаты подойти 4.2; он может переоценить частоту стромул, однако, если один хлоропласт сформировал много стромул. В примере, показанном на основании репрезентативных результатов, например, несколько хлоропласты имеют два или более стромул, в результате чего число стромул в хлоропластах до 40/87 (по сравнению с частотой стромул от 33/87).
   2. В качестве альтернативы, определить длину стромул вместо стромул частоты. Длина может быть измеренав ImageJ путем отслеживания стромул с ручным инструментом линии.
      Примечание: Так как биологическая роль стромул остается неизвестным, не ясно, что стромул длина влияет на их функцию. Данные о существенных различий в стромул длины, если они наблюдаются, но также сообщают частоты стромул (как описано в разделе 4.2).
      Примечание: стромул частота может быть сильно варьирует среди различных листьев в тех же условиях роста. Поэтому, хотя определения частоты стромул может отнимать много времени, эксперименты должны быть тщательно разработаны, чтобы включать в себя большие размеры выборки. Использование наборов данных из нашей лаборатории, мы установили, что размер выборки, по меньшей мере, 16 растений для каждой обработки, как правило, достаточно мощным, чтобы определить, имеется ли статистически значимое различие по меньшей мере, 1,5-кратное изменение стромул частоты между двумя условиями (со стандартными α = 0,05 и β = 0,80).
3. Статистический анализ результатов.
   1. Для сравнения меняА.Н. стромул частоты двух обработок, используют т тест Уэлч (также известный как гетероскедастических т тест или тест т , предполагающей неравную дисперсию).
      Примечание: Этот тест не является столь мощным , как т тест обычном Стьюдента, а т тест Уэлша является предпочтительным , так как он не предполагает , что дисперсия в стромул распределения частот аналогично между обработками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку стромул частота является "доля", ее распределение выборки по прогнозам, будет биномиальное, а не нормальное, который теоретически мог бы перекоса статистический анализ, если размеры выборки очень малы или если стромул частота очень низкая (около 0%) или очень высокий (около 100%). В некоторых докладах использовали арксинус преобразования до того статистического анализа, который предназначен для преобразования биномиального распределения к нормальному распределению, и , таким образом , удовлетворяют требованиям стандартов т теста Стьюдента или ANOVA с. На практике, однако,rcsine преобразования имеют мало или вообще не оказывает влияния на статистическом анализе, и поэтому не рекомендуется. Вместо того, чтобы повторить эксперименты, чтобы увеличить размер выборки, что позволит повысить статистическую мощность и уменьшить количество ошибок в интерпретации данных.
   2. Независимо статистический подход используется, не забудьте тщательно сообщать стратегии выборки, размер выборки, статистический тест, р значение для каждого эксперимента.
      Примечание: Как и в других областях биологии, значение р меньше 0,05 можно считать «статистически значимым», хотя исследователи , безусловно , должны сообщить точное значение , полученное р. Если р чуть выше 0,05, как увеличение размера пробы с двумя или тремя экспериментами может помочь выяснить , является ли или нет воспроизводима и статистически значимое различие наблюдалось.

5. Извлечение интактные хлоропласты визуализировать стромул Dynamics

Примечание: Существует несколько методовбыли использованы для выделения хлоропластов из листьев, в том числе несколько иной протокол в недавнем исследовании стромул образования в пробирке ^15. Протокол подробно описаны ниже использует относительно простой метод , который не уступает биохимически чистых образцов хлоропластов, но вместо того, чтобы изолировать большое количество неповрежденных, здоровых хлоропластов ^9,18.

1. Подготовка холодного буфера для экстракции: 50 мМ Hepes - NaOH, 330 мМ сорбита, 2 мМ ЭДТА, 1,0 мМ MgCl _2, и 1,0 мМ MnCl _2. Доводят рН до 6,9 с помощью NaOH и HCl, и хранить в холодильнике перед использованием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, нет необходимости, используя холодные буферы и хранение проб на льду, когда это возможно даст более высокую долю интактных хлоропластов.
2. Готовят изолирующий буфер: 50 мМ Hepes NaOH, 330 мМ сорбита, 2 мМ ЭДТА, 1,0 мМ MnCl _2, 1,0 мМ MgCl _2, 10 мМ КСl, и 1,0 мМ NaCl. Доводят рН до 7,6 с NaOH и HCl и охладите перед использованием.
3. Если листья не являютсяэкспрессирующих генетически кодируемой стромы флуорофор, готовят карбоксифлуоресцеин диацетат раствор (CFDA): 50 мМ CFDA исходного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) (2,3 мг CFDA на 1,0 мл ДМСО).
   Примечание: точная концентрация не имеет решающего значения. Держите CFDA запас в темноте во все времена. Хранить небольшие аликвоты 50 мМ CFDA при -20 ° С.
4. Для того, чтобы выделить хлоропласты, удалить ~ 5-10 г листьев из нескольких растений и кратко промыть в холодной воде. Немедленно передать в 50 мл буфера для экстракции холодной. Измельчить листья с помощью блендера с несколькими короткими импульсами. Смесь фильтруют через два-три слоя марли, чтобы удалить твердые частицы листьев, делят распакованные хлоропласты в две 50 мл центрифужные пробирки и центрифуги в течение 1 мин при 750 х г.
5. Удалите супернатант и ресуспендируют зеленые хлоропласты в буфере изоляции 10 мл. Центрифуга снова в течение 1 мин при 750 мкг, отбросить супернатант и ресуспендирования хлоропласты в буфере изоляции довести конечный объем до 5 мл.
6. Передача 201, л хлоропластов на слайде, крышка с покровное и начать микроскопии.
   Примечание: хлоропласты из трансгенных растений, экспрессирующих пластид-мишенью флуоресцентные белки теперь готовы к визуализации с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии.
7. Пятно хлоропластов из растений, которые не выражающие пластид-мишенью флуоресцентные белки для визуализации стромул.
   1. Добавьте 5 мкл 50 мМ CFDA запаса до 5 мл хлоропластов суспендируют в буфере изоляции. Довести конечную концентрацию до 50 мкМ.
   2. Разрешить хлоропласты инкубировать в течение 5 мин, а затем передать небольшую аликвоту (~ 50 мкл) на слайд, накрыть покровным и начать микроскопии.
   3. Используйте FITC или GFP набор фильтров. Используйте объектив 20X, чтобы визуализировать много хлоропластов одновременно, или более высокую цель для визуализации одной изолированной хлоропласты.
      Примечание: CFDA будет флуоресцировать внутри стромы интактных хлоропластов.
   4. Если есть сильный фон флуоресценции, моют Chloroplasts снова в 10 мл буфера изоляции после 5-минутной инкубации с CFDA, центрифуге в течение 1 мин при 750 мкг, отбросить супернатант и ресуспендируют в 5 мл буфера изоляции.

Результаты

Этот протокол был использован для визуализации стромул частоту днем и ночью в семядолях молодых N. benthamiana рассады. Ломтики из z- стека были объединены в одно изображение (рисунок 1А). Для визуальных целей, что изображение было тогда ненасыщенный и пере?...

Обсуждение

При исследовании стромул, три важных фактора должны быть рассмотрены на протяжении: (I) манипуляции ткани растений должны быть сведены к абсолютному минимуму, (б) экспериментальная система должна быть последовательной, и (III) стратегии отбора проб должны быть тщательно спланированы, обе...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
NaOH	Fischer-Scientific	S320-1
Sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876
EDTA	Fischer-Biotech	BP121
MnCl2	Sigma-Aldrich	221279
MgCl2	Sigma-Aldrich	M0250
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
NaCl	Sigma-Aldrich	S9625
Laser Scanning Confocal Microscope	Carl Zeiss Inc	Model: LSM710
Carboxyfluorescein diacetate (CFDA)	Sigma-Aldrich	21879
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	EMD	MX1458-6
Waring blender	Waring	Model: 31BL92
Fiji	fiji.sc		Open-source software for analyzing biological images