Зика Вирус Система Инфекционный Культура клеток и<em&gt; In Vitro</em&gt; Профилактический эффект интерферонов

Резюме

Zika Virus (ZIKV), an emerging pathogen, is linked to fetal developmental abnormalities and microcephaly. The establishment of an effective infectious cell culture system is crucial for studies of ZIKV replication as well as vaccine and drug development. In this study, various virological assays pertaining to ZIKV are illustrated and discussed.

Аннотация

Зика Вирус (ZIKV) является новым патогеном, который связан с отклонениями в развитии плода, таких как микроцефалия, дефектами глаз, и ослабленный рост. ZIKV является РНК - вирусом из семейства Flaviviridae. ZIKV в основном передается комарами, но также может быть распространен материнской плода вертикальной передачи, а также сексуального контакта. На сегодняшний день не существует надежных лечения или вакцины варианты, доступные для защиты лиц, инфицированных вирусом. Развитие воспроизводимым, эффективного вируса Зика системы инфекционного культивирования клеток имеет решающее значение для изучения молекулярных механизмов репликации ZIKV, а также разработки лекарственных средств и вакцин. В связи с этим, протокол описания клеток на основе в пробирке Zika системы культуры млекопитающих от вирусов для вирусного роста производства и анализа сообщается здесь. Более подробная информация о формировании бляшек вирусом Зика на монослой клеток и анализа бляшек для измерения вирусного титра представлены. Кинетика репликации вирусного геномаи replicatory промежуточные двухцепочечной РНК генома определяются. Эта культура платформа была использована для экрана с библиотекой небольшого набора цитокинов, в результате идентификации интерферона-альфа (IFN-a), ИФН-β и IFN-γ в качестве сильнодействующих ингибиторов Зика вирусного роста. Таким образом, инфекционный Зика вирусная система в пробирке культура и различные вирусологические анализы показано в этом исследовании, у которого есть потенциал , чтобы большую пользу научному сообществу в выяснении дальнейшем механизмы вирусного патогенеза и эволюцию вирусной вирулентности. Противовирусные IFN-альфа может быть дополнительно оценена в качестве профилактического, постэкспозиционная профилактического и вариант лечения для Зика вирусных инфекций в группах высокого риска, в том числе инфицированных беременных женщин.

Введение

Зика Вирус (ZIKV) является важным патогеном человека , связанный с микроцефалия и бедными беременности исходы ^1,4. ZIKV принадлежит множеству соответствующих медицинской точки зрения флавивирусов, которые могут вызвать неврологические дефекты, такие как лихорадка денге, Западного Нила и вируса энцефалита Сент-Луис. Основной способ передачи вируса является москита вектора комар жёлтолихорадочный, и, кроме того, передача инфекции половым путем также сообщалось ^5,6. ZIKV стала одним из основных глобальной проблемой здравоохранения из-за расширения географического распределения вектора комара и его сильной корреляции с врожденными дефектами. ZIKV был впервые выделен в 1947 году из дозорного макаки - резуса в лесу Зика, Уганда и первый случай заболевания человека был зарегистрирован в 1952 году ^7,8. Лица, которые становятся зараженными ZIKV настоящего с умеренными симптомами, такими как лихорадка, сыпь, головная боль, конъюнктивит и мышцы / боли в суставах. Инфицированные беременные женщины могут передавать ZIKV для развивающегося плода ^1. ZIKV инфекция также связана с синдромом Гийена-Барре, периферического нерва аутоиммунной демиелинизации расстройства ^9.

Вирусный геном Зика состоит из положительном смысле, одноцепочечной молекулы РНК, которая составляет около 10,8 тысяч пар нуклеотидов в длину. Структура генома организована 5'NCR-C-PRM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-2K-NS4B-NS5-3'NCR с некодирующие областей (NCR), фланкирующих область белоккодирующей ^6. Один полипротеина (3419 аа) переводится именно со- и посттрансляционно расщепляется на 10 небольших пептидов. Оба 5'NCR и структуры стволовых петля 3'NCR РНК играют решающую роль в начале вирусного генома трансляции и репликации. Структурные компоненты генома состоят из капсида, мембран и белков оболочки. Неструктурные белки имеют решающее значение для репликации генома.

В настоящее время вирусные штаммы Zika сгруппированы в три основных генотипов: Западной Африки, Восточной Африки и Азии ^6,10-13. Было высказано предположение , что восточноафриканское родословная распространилась на Западной Африке и Азии, где впоследствии дальнейшее развитие ^12. Азиатский генотип несет ответственность за нынешние вспышки в Северной и Южной Америке. Вирус Зика может культивироваться в обоих комара и в клетках млекопитающих. Первичные фибробласты кожи, незрелые дендритные клетки, корковые нервные клетки - предшественники и клетки Vero чувствительны к Зика вирусной инфекции ^10,14,15. Интерфероны обоих типов I и II типа , как было показано , чтобы ограничить рост ZIKV в кожных фибробластов ^15. Целями данного исследования являются обеспечение поэтапного, подробный протокол для производства и опробования азиатских генотипа Zika вирусного штамма PRVABC59 в в системе культивирования клеток млекопитающих и продемонстрировать полезность этой инфекционной системы культуры в качестве платформы разработки лекарственных средств. Этот ресурс имеет потенциал, чтобы в значительной мере способствовать Zika вирусные и неврологическое научное сообщество дальнейшее выявление IТ.С. механизмы вирусного патогенеза и эволюции вирусной вирулентности.

протокол

Примечание: Схематическое контур потока работы представлен на рисунке 1.

1. Клетки

1. Использование Vero клеток для вирусного производства и анализа вирусного цикла репликации Зика.
2. Подготовка полной среды для роста, содержащей 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамина, пенициллин (100 ед / мл), стрептомицина (100 ед / мл), и 10 мМ HEPES.
3. Культура клеток Vero с указанной полной ростовой среде при температуре 37 ° С с 5% CO _2.

2. Зика Вирус Производство

1. Урожай клетки Vero при плотности 80% клеток с использованием 0,25% трипсина в Т-75 колбу и подсчета клеток.
   1. Аспирируйте носитель из культуральной колбы Т-75 и промойте клетки с 2 мл забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS).
   2. Добавляют 2 мл 0,25% трипсина и инкубировать колбы при 37 ° С в течение 5 мин.
   3. Добавить 8 мл сыворотки, содержащей среду для роста инактивирует трипсин. Пипеткой вверх и вниз к СусПЭНД клетки и переносят клетки в 15 мл пробирку.
   4. Удалить 10 мкл клеток и смешивают с равным количеством 0,4% трипанового синего. Загрузите подготовленную смесь счетной ячейки камеры горкой и получить жизнеспособную Цитоз с использованием автоматического счетчика клеток.
2. Семенной в общей сложности 7 миллионов клеток в объеме 30 мл в колбу Т-160.
3. На следующий день, подготовить соответствующую множественности заражения (от 0,01 до 0,1 МВД) Зика вируса инокулята в 10 мл бессывороточной культуральной среды на колбу.
4. Удалите отработанный материал из колбы Т-160, а затем добавить свежеприготовленный вирусный инокулят (10 мл).
5. Инкубацию засеянных колб в 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 4-6 ч. Спред прививочный, осторожно наклоняя колб боком на каждом час.
6. При завершении инкубации, заменить прививочный материал с теплой ростовой средой сывороткой (30 мл) для каждой колбы. Затем продолжить культивирование вируса в течение следующего 96 часов.
7. Проверьте прогрессирование вфекции путем наблюдения появления вирусных бляшек на монослое клеток с использованием фазового контраста микроскопа и получения изображений (рисунок 2) в случае необходимости в 40X и 200X увеличениях.

Рис . 2: Бляшки , образованные вирусом Зика на монослой клеток Vero поля изображения Яркие различных увеличениях показывают Zika вирусных бляшек на 48 HPI. Обратите внимание на наличие округлой клеток очагов на монослой. (Шкала бар = 50 мкм) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

8. Урожай надосадочной жидкости культуры клеток в момент времени 96 ч и центрифугируют надосадочной жидкости при 300 мкг в течение 10 мин при 4 ° С для удаления остатков клеток.
9. Осторожно удалите супернатант, не нарушая гранулированной мусора и т переносаO 15 мл пробирки. Ультрацентрифугирование при 24000 XG могут быть выполнены, чтобы сконцентрировать вирусные частицы (необязательные).
10. Хранить вирусные супернатантов культуры в нескольких аликвотах при -80 ° C.

3. Измерение Зика Вирус Титр бляшкой Пробирной

1. Семенной наивные клетки Vero на 1 × 10 ⁵ клеток на лунку в 2 мл объема с использованием 12-луночного планшета.
2. На следующий день, подготовить 10-кратных серийных разведений вируса супернатантов культуры, собранных из Т-160 колбы с использованием не содержащей сыворотки среде. Удалите истощенные среды из каждой лунки и добавляют 400 мкл приготовленного инокулюма на клетки Vero в трех экземплярах.
3. Инкубацию засеянных колб в 37 ° C с 5% CO ₂ в течение 4-6 ч. Распространение прививочный, осторожно наклоняя тарелку в сторону на каждом один час.
4. В конце инкубации, замените прививочный материал в присутствии сыворотки, дополненной сред (2 мл на лунку).
5. В 48 ч после инокуляции подсчета вирусной фокусы с использованием фазы CONTRAST микроскоп. Рассчитывают титр вируса в виде бляшкообразующих единиц (БОЕ) на мл. Смотрите рисунок 3 для анализа бляшек.
6. Фикс и окрашивают клетки в 4% формальдегида и 0,1% раствор кристаллическим фиолетовым, приготовленные в 20% этанола для четкой визуализации бляшек.

Анализ 4. Зика вирусного генома репликации

1. Семенной наивные клетки Vero на 1 × 10 ⁵ клеток на лунку в объемах 2 мл с использованием 12-луночного планшета. На следующий день готовят вирусный инокулята (MOI от 0,01 до 0,1; 400 мкл / лунку) низкого и высокого титра с использованием бессывороточной среды в трех экземплярах. Для макете инфекции, используйте бессывороточной среды (400 мкл / лунку) только.
2. Повторите шаги 3.2 до 3.4.
3. На 48 и 96 часов моменты времени, собрать образцы для РНК и иммуногистохимии (ICC).
   1. Для получения образцов заготовки РНК, удалите носитель, а затем добавить 400 мкл лизирующего раствора непосредственно в каждую лунку и собрать лизатов.
   2. Для ICC, удалите средства массовой информации и ткурица фиксации клеток путем добавления 1 мл метанола в каждую лунку и инкубируйте при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
   3. Из лизата клеток, изолируют тотальной РНК с использованием набора для выделения РНК в соответствии с инструкциями изготовителя. Количественная РНК с использованием спектрофотометра.
4. Выполните обратную транскрипцию двухступенчатую количественный ПЦР (RT-КПЦР) для определения содержания ZIKV генома от заготовленной РНК.
   1. Для обратного транскрибировать РНК, первый раз настраивали реакционной смеси 13 мкл, состоящей из 5 мкг выделенной РНК, 1 мкл дНТФ (10 мМ) и 1 мкл случайного гексамере (250 нг) в 0,2 мл пробирку. Инкубируйте пробирку при 65 ° С в течение 5 мин, а затем поместить его на льду в течение одной минуты. Затем добавляют 1 мкл обратной транскриптазы, 4 мкл 5х буфера для синтеза цепи, 1 мкл 0,1 М дитиотреитола и 1 мкл ингибитора РНКазы в реакционной смеси. Инкубируйте пробирку в течение еще 5 мин при 25 ° С, а затем 60 мин при 50 ° С и неактивноели реакции при нагревании до 70 ° С в течение 15 мин.
   2. Выполните КПЦР с использованием 1 мкл кДНК, полученной с 12,5 мкл 2x зеленого красителя супер смесь, содержащую ДНК-полимераза, и 1 мкл 10 мМ индивидуальных праймеров, специфичных для вируса Зика [Zika вируса пан-генотип праймеров (для: 5'-AARTACACATACCARAACAAAGTGGT-3 ' ; Rev: 5'-TCCRCTCCCYCTYTGGTCTTG-3 '), вирус Зика Азиатский генотип PRVABC59 штамм праймеров (5'-AAGTACACATACCAAAACAAAGTGGT-3'; Rev: 5'-TCCGCTCCCCCTTTGGTCTTG-3 ')], или вирус гепатита С (JFH RTQ F: 5 'CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R: 5'CCTATCAGGCAGTACCACA-3'), или клеточный ген GAPDH, ведение домашнего хозяйства (для: 5'-CCACCTTTGACGCTGGG-3 '; REV: 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACA-3') в объеме реакционной смеси 25 мкл.
   3. Выполните ПЦР с использованием условия запуска 95 ° C в течение 15 секунд и 60 ° C в течение 30 секунд (40 циклов) в режиме реального времени системы ПЦР.
   4. Используйте уровень экспрессии GAPDH на основе порогового цикла значение (Ct) для нормализации ZIKA измерения вирусного генома. Вычислить значение дельта Ct (& Delta ; CТ) из генома Зика сравнению с этим GAPDH и получить значение 2 ^{& Delta} ; ^CТ. Затем рассчитать кратное изменение, беря отношение нормированных содержание генома Zika между инфицированных и неинфицированных клеток в указанные моменты времени. Рисунок 4 для репликации результатов ZIKV генома.
5. Выполнение ICC с использованием метанола фиксированных клеток.
   1. Промыть фиксированные клетки три раза 1x PBS и блок с ICC блокирующим буфером (3% сыворотки козы, 3% БСА, 0,1% тритона-Х 100 в PBS).
   2. Используйте мышиное моноклональное анти-дсРНК антитела J2 (1 мкг / мл) в разведении 1: 100 в блокирующем буфере и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С.
   3. Промывают клетки с 1х PBS и добавляют козий вторичное антитело анти-мышь IgG-594 (1 мкг / мл) при 1: 1000 разбавление в блокирующем буфере и инкубируют в течение одного часа при комнатной температуре.
   4. Вымойте клеток с 1x PBS и красителем для ядер с использованием Hoechst красителя инаблюдать клеток с использованием флуоресцентного микроскопа при 100 - кратном увеличении (рисунок 4).

5. Скрининг цитокин библиотеки против Зика вирусной инфекции

1. Семенной наивных клеток Vero в количестве 1 × 10 ⁵ клеток на лунку с использованием 12-луночного планшета. После того, как клетки прикреплены (6 ч после высева), добавьте каждого цитокина в указанных концентрациях в биологических дублей (2 мл объема / лунку). Включите транспортное средство (PBS) в одиночку контроль.
2. В 12 ч после обработки, выполняют Zika вирусной инфекции (MOI 0,1 в 400 мкл на лунку). Включите отрицательные скважины контроль без инфекции (макете).
3. В течение 4 часов после инфицирования, замените вирусный прививочный материал с цитокинами лечение сред (2 мл). Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение дополнительного 44 ч.
4. В 48 ч после инфекции, вирусные подсчет бляшек с помощью фазово - контрастного микроскопа и получить репрезентативные изображения инфицированных клеток при 40 - кратном увеличении (рисунок 5).

Результаты

Вирусный штамм Зика (PRVABC59; GenBank инвентарный номер KU501215) азиатского генотипа использовали в данном исследовании ^12. Веро клетки на 80% сплошности были использованы для исследования De Novo Zika вирусной инфекции. Для вирусного производства и последующего вирусолог?...

Обсуждение

Здесь, обтекаемый протокол для культивирования вируса Зика в пробирке представлена. Критические шаги в том числе, определение оптимальных конечных точек для расширения вирусной культуры, измерения титра, и количественной оценки репликации генома были предоставлены. Вирус Зика я...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma Life Science	D5796
HEPES	Life Technologies	15630080
Glutamax	Life Technologies	35050061
2.5% Trypsin, 10x [-] Phenol Red	Corning	25-054-C1
Trypan Blue Stain 0.4%	Life Technologies	T10282
Countess – Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	C10227
Countess-cell counting  chamber slides	ThermoFisher Scientific	C10283
Rneasy Mini Kit	Qiagen	74104
Nanodrop 2000	Thermo Scientific	Nanodrop 2000
mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2	English & Scientific Consulting Kft.	10010200
Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594	Life Technologies	A11020
SUPERSCRIPT III RT	Life Technologies	18080085
SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX	Life Technologies	11744500
QuantStudio12K Flex Real-Time PCR System	Thermo Fischer	4471088
RNase-Free DNase	Promega	M6101
Vero Cell Line	ATCC	CCL-81
Zika viral strain PRVABC59	Centers for Disease Control and Prevention (CDC)
IL-6	Peprotech	200-06
IL-1 alpha	Peprotech	200-01A
TNF-alpha	Peprotech	300-01A
Interferon alpha A	R & D Systems	11100-1
Interferon beta	Peprotech	300-02BC
Interferon gamma	Peprotech	300-02
Centrifuge 5415R	Eppendorf	5415R
Centrifuge 5810R	Eppendorf	5810R
Nikon Eclipse Ti Immunofluorescence Microscope with Nikon Intenselight C-HGFI	Nikon	Visit Nikon for Request