Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

Резюме

This work describes an advanced workflow for the accurate and fast determination of NK (Natural Killer) cell count and NK cell cytotoxicity in human blood samples.

Аннотация

клеточная цитотоксичность NK является широко используемым показателем для определения влияния внешнего вмешательства на функцию NK-клеток. Тем не менее, точность и воспроизводимость результатов этого анализа можно считать нестабильным, либо из-за ошибок пользователя или из-за чувствительности клеток NK к экспериментальному манипулированию. Для устранения этих проблем был создан рабочий процесс, который сводит их к минимуму и представлена ​​здесь. Чтобы проиллюстрировать это, мы получили образцы крови, в различные моменты времени, из бегунов (n = 4), которые были представлены в интенсивный бой упражнений. Во-первых, NK-клетки одновременно идентифицируют и выделяют через CD56 мечения и магнитной сортировки на основе, непосредственно из цельной крови и от всего лишь один миллилитр. Отсортированные клетки NK удалены из любых реагентов или укупорки антител. Они могут быть подсчитаны с целью установления точного подсчета клеток NK на миллилитр крови. Во-вторых, отсортированной клетки NK (эффекторы клетки или E) могут быть смешаны с 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine Хлорнокислый (DIO) помечено клетки К562 (клетки-мишени или Т) на тест-оптимальным 1: 5 T: отношение E, и анализировали с использованием изображений проточные цитометр, который позволяет для визуализации каждого события и устранение любых ложных срабатываний или ложных негативов (такие как дублеты или эффекторных клеток). Этот рабочий процесс может быть завершен в течение примерно 4 ч, и позволяет очень стабильные результаты даже при работе с человеческими образцами. При наличии, исследовательские группы могут испытать несколько экспериментальных вмешательств у больных людей, и сравнить измерения в нескольких точках времени без ущерба для целостности данных.

Введение

Естественные клетки-киллеры являются существенным элементом врожденной иммунной системы. В то время как они очень регулируются, они обладают способностью распознавать и элиминировать аномальных клеток через клетки к клетке контакта и без предварительной активации ^1. Таким образом, они образуют быструю линию защиты против инфекций. Физические упражнения, особенно интенсивно, как было показано, скоротечно угнетают иммунную систему ^{2, 3, 4, 5.} NK - клетки, особенно подвержены этому эффекту ^{4, 6, 7,} эффективно создание окна повышенной чувствительности к болезни. Таким образом, изучение мер до, во время или после интенсивной физической нагрузки с целью снижения его влияния на функцию NK-клеток представляет особый интерес для благосостояния спортсменов пост-соревнований.

Тем не менее, изучение таких вмешательств осложняется многими факторами: 1) NK - клетки разреженным ^8, при температуре около 1% числа белых клеток крови отсека; 2) NK-клетки очень чувствительны к стрессу и полагаться на постоянного воздействия на физиологические условия, чтобы оставаться жизнеспособными и стабильными во время экспериментов; и 3) стандартные анализы для определения цитотоксичности клеток NK, такие как Ficoll градиенты ⁹ и выпуск ¹⁰ анализов, являются ненадежными и непоследовательными. Присущая изменчивость человеческих образцов только усугубляют эти проблемы. Свежие образцы человека, собранные в ходе вмешательств достаточно регламентирована и сложно получить, по крайней мере, по сравнению с образцами, животных или иммортализованные клеточные линии. Это уменьшает возможность повторить эксперименты или добавить участников исследования когорты достичь значительных статистических пороговых значений. В совокупности эти вопросы подтверждают необходимость обтекаемый протокол, позволяющий FOг и с высокой пропускной способностью и анализ высоконадежный НК клеток литической активности в человеческих образцах.

Мы создали рабочий процесс, который сокращает время, необходимое для идентификации, выделения и испытания NK-клетки из цельной крови человека при сведении к минимуму воздействия внешних факторов. Метод оптимизирует использование двух инструментов, магнитной основе сортировщика клеток и потока изображений цитометр, и анализ конкретных, оптимизированные T: отношение E, чтобы позволить обнаружение уменьшается или увеличивается клеточной цитотоксичности NK.

протокол

Примечание: Все процедуры сбора крови были проведены в соответствии с руководящими принципами, установленными Аппалачи государственного университета совет Review (ASU) Институциональная (IRB).

1. Весь забор крови

1. Есть сертифицированный Phlebotomist забор крови в соответствии с рекомендациями Всемирной организации здравоохранения.
2. Нарисуйте кровь в один 4 мл пробирку для сбора крови , содержащей ди-Калий этилендиаминтетрауксусной кислоты (K ₂ ЭДТА). Переверните пробирку для сбора крови в соответствии с инструкциями изготовителя. Держите пробирку для сбора крови при комнатной температуре на настольном коромысла до разделения.

2. Получение DIO-меченых клеток-мишеней

1. Grow К562 в комплекте Исков Модифицированная Дульбекко Медиа (IMDM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина стрептомицин в течение нескольких недель до анализа, чтобы обеспечить здоровье клеток. Отрегулируйте Концентратиона клеток до 3 х 10 ⁵ клеток / мл в день путем заполнения ячейки подсчета и последующее прохождение клеток. Выполните полное изменение среды каждые 2 до 3 дней.
2. В день анализа, выполнять подсчет клеток с использованием 1: 1 гемоцитометра.
   1. Удалить 10 мкл из К562 колбу и помещают в 1,5 мл трубки.
   2. Добавьте 10 мкл трипанового синего красителя в той же 1,5 мл трубки для коэффициент разбавления 1: 1.
   3. Осторожно Флик трубки перемешать К562 и трипанового синего красителя.
   4. Разрешить К562 клеток-трипанового синего красителя для инкубирования в течение 1 мин при комнатной температуре.
   5. Удалить 15 мкл окрашенных клеток К562 из трубки.
   6. Пипетка на гемоцитометра для подсчета клеток.
   7. Количество клеток в четырех угловых квадратов, а также средний квадрат в общей сложности пяти квадратов.
   8. Подсчитайте число клеток с помощью уравнения:
      Всего клеток / мл = Общее количество подсчитанных клеток X (коэффициент разбавления / кол-во квадратов) X 10000 / мл
3. Клетки - мишени К562 Ресуспендируют в конечной плотности 1 х 10 ⁶ клеток / мл в не содержащей сыворотки IMDM культуральной среды.
4. Для неокрашенных - мишеней К562, добавляют 10 мл клеток - мишеней K562 в один 15 мл трубки при плотности 1 х 10 ⁶ клеток / мл в течение в общей сложности 10 х 10 ⁶ клеток К562. Поместите в 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ до готовности к использованию.
5. Для клеток - мишеней DiO витражное К562, добавьте 10 мл K562 цели клеток к одному 15 мл трубки при плотности 1 × 10 ⁶ клеток / мл в общей сложности 10 × 10 ⁶ клеток К562.
   1. Добавить 1 мкл Диу клеток мечения раствора на мл клеточной суспензии в 15 мл пробирку, предназначенную для окрашивания DiO и мягко вихрем. Например, добавить 10 мкл раствора DiO клеток , меченных до 10 х 10 ⁶ клеток К562 / мл при объеме 1 х 10 ⁶ клеток / мл.
   2. Решение Инкубировать К562-DiO в течение 20 мин при температуре 37 ° С с 5% CO ₂ в 15 мл пробирку.
6. следитьИнг инкубации, добавляют 3 мл воды комнатной температуры фосфатно-буферном солевом растворе (PBS) в растворе К562-DiO, содержащей 15 мл пробирку.
7. Центрифуга в течение 10 мин при 135 х г при комнатной температуре.
8. Осторожно удалите супернатант, не нарушая осадок клеток с 1000 мкл объема регулируемой пипетки.
9. Добавляют 10 мл свежей IMDM к осадку клеток, содержащих 15 мл пробирку.
10. Аккуратно вихревой трубки для ресуспендирования клеток.
11. Повторите шаги 2.7 до 2.10 еще два раза.
12. Хранить клетки в 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ до готовности к использованию.
    Примечание: Ячейки могут быть сохранены в инкубаторе в течение до 24 ч, но предпочтительно использовать их в тот же день.

3. Получение контроля

1. Передача следующих на отдельные и надлежащим образом маркированных 1,5 мл пробирки:
   1. Добавить 500 мкл свежей IMDM, содержащей ресуспендировали DIO-меченый К562 в "Двойной" Позитивный меченым 1,5 мл трубки,
   2. Добавить 500 мкл свежей IMDM, содержащей ресуспендировали DIO-меченых клеток К562 в "только DiO" маркированы 1,5 мл трубки.
   3. Добавить 500 мкл свежей IMDM, содержащей ресуспендировали немаркированные К562 в "Пропидиум йодида (PI) только" маркированы 1,5 мл трубки.
2. Поместите дважды положительных и PI только трубы в водяной бане 55 ° С в течение 5 мин.
3. После того, как 5 мин прошло, удалите трубки и вытрите с 70% -ным этанолом.
4. Добавляют 10 л PI к двойной положительной и PI только 1,5 мл пробирки.
5. Поместите все три элемента управления К562 клетки-мишени в термостате при температуре 37 ° С в течение 30 мин.
6. После 30 мин инкубации истечет, центрифужные все три элемента управления клетки-мишени К562 в течение 2 мин при 163 х г.
7. Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
8. Ресуспендируют каждый элемент управления с 20 мкл свежей IMDM среды для культивирования клеток, и оставить в 37 ° C инкубаторе с 5% CO ₂ в течение по крайней мере ,30 мин для оптимального сигнала DiO.
   Примечание: Элементы управления теперь готов к запуску через поток обработки изображений цитометрии.

4. NK Cell Автоматизированный Разделение

1. Включите ячейки сепаратора и позволяют цикл запуска до завершения.
2. Убедитесь, что все жидкости бутылки истолкования зеленые и что бутылка отходов пуст.
3. Получить температуру 15 мл стойку трубки номера.
   Примечание: Выбор основан на объемах выборки. Например, при объеме менее 3 мл используют стойку пробирку объемом 15 мл и объемом более 3 мл используют Штатив для пробирок на 50 мл.
4. образец этикетки трубки соответственно (повтор каждого образца / участника): Участник 1 образец цельной крови; Участник 1 Отрицательный фракцию; Участник 1 Положительная дробь.
5. Аккуратно пипеткой 1,5 мл цельной крови с шага 1.2 в "образец цельной крови" 15 мл трубки.
6. Поместите соответствующим образом меченый 15 мл "образец цельной крови" трубки с шага 4.5 и метили 15 мл "Негативный фракции" и"Положительная фракция" трубки с шага 4.4 в стойке трубки. Используйте thefollowing образец стойку Настройка: Row (R1) A: образец цельной крови, ряд (R2) B: Negative, непомеченная фракция, Row (R4) C: Положительный, магнитно-меченый фракции.
7. Вставьте разделитель рейку на Минисамплером для autolabeling.
8. Выберите "Реагент" в меню и выберите положение, в котором ампула будет помещен в стойку сепаратора.
9. Выберите "Read Реагент", чтобы активировать читателя 2D кода.
10. Поместите соответствующий флакон с реагентом перед кодом читателя 2D между 0,5-2,5 см от крышки считывателя кода.
    Примечание: Например, требуемый реагент для разделения NK клеток является CD56.
11. Удерживая флакон реагента под углом перед 2D считывателя кода для оптимального чтения.
12. Поместите флакон реагента в правильное положение сепаратора стойки.
13. Выделите нужные позиции на вкладке Разделение на экране.
14. В подменю обозначая, назначить а.е.tolabeling программа.
15. Присвоить разделение клеток CD56 Реагент микрогранулы в стойку позиции 1, 2, 3 и 4.
16. Выберите программу разделения "posselwb".
17. Выберите "Полоскание" программу стирки.
18. Вставьте объем образца в 1500 мкл в подменю "Volume" с помощью цифровой клавиатуры.
19. Выберите опцию "Enter" на клавиатуре.
20. Выберите "Выполнить", чтобы начать разделение клеток.
21. Выберите "OK", чтобы подтвердить, что достаточно буфер доступен для обработки всех образцов.

5. NK Cell Count После разделение клеток

1. Сразу же после разделения клеток с разделителем клеток, получить положительную фракцию. Оставить при комнатной температуре. Эта фракция содержит желаемый чистый популяции NK-клеток.
2. Для каждого отдельного образца, выполнить подсчет клеток с использованием гемоцитометра в соответствии с шагом 2.2.
   1. После расчетов, записи количества клеток.

6. цитотоксичности Приготовление образца

1. Подготовить и разметить 1,5 мл пробирки для каждого образца / участника соответственно.
2. Пипетка желаемое соотношение количества клеток NK и DIO-labled K562 клеток в каждую пробирку.
   Примечание: Например, желаемое соотношение клеток-мишеней K562 и эффекторных клеток NK 1: 5.
3. Центрифуга в течение 5 мин при 135 х г.
4. Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
5. Ресуспендируют NK-DiO меченый смесь К562 клеток в 500 мкл клеточных сред NK без интерлейкина-2 (ИЛ-2) и 2-меркаптоэтанол (2-ME) (неполной НК среды для культивирования клеток).
   Примечание: Неполный НК среды для культивирования клеток является минимальной необходимой среде Eagle с помощью бикарбоната натрия, без L-глутамина, рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов.
6. Добавьте 5 мкл PI в каждую пробирку.
7. Центрифуга в течение 2 мин при 163 х г.
8. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2 ч.
9. После 2 ч инкубации, centrifuGE в течение 2 мин при 163 х г.
10. Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
11. Ресуспендируют клеток в 25 мкл неполного NK среды для культивирования клеток.

7. Получение спонтанных ( "S") Образец

1. Пипеток 500 мкл DIO-меченых клеток К562 (концентрация 1 × 10 ⁶ клеток / мл) в 1,5 мл пробирку.
2. Добавьте 10 мкл PI в каждую пробирку.
3. Центрифуга трубки в течение 2 мин при 163 х г.
4. Инкубируйте клетки при 37 ° С в течение 2 ч.
5. После 2 ч инкубации, центрифуги в течение 2 мин при 163 х г.
6. Осторожно удалите супернатант, не нарушая клеточный осадок.
7. Ресуспендируют клеток в 25 мкл неполного альфа-Minimum Essential Medium (α-MEM) для культивирования клеток.

8. Сбор данных с изображениями проточный цитометр

1. Нажмите на зеленую кнопку внутри передней двери визуализации потока цитометр, чтобы включить прибор.
2. Включите альл компьютеры, связанные с изображениями проточном цитометре.
3. Запуск потока изображений цитометра программного обеспечения.
4. Нажмите кнопку "Ввод в эксплуатацию" для промывки системы и подготовить линию образца.
5. После того, как "Запуск" завершена, закрыть окно "калибровок".
6. Назначение каналов: на верхней стороне левой руки, нажмите на каждом канале, чтобы присвоить их.
7. На правой стороне, нажмите на кнопку график рассеяния для создания 4: Raw диаграммы рассеяния Max Pixel _MC_6 против Area_M06, RAW Макс Pixel _MC_2 против Area_M02, RAW Макс Pixel _MC_5 против Area_M05 и FieldArea_M01 против AspectRatio_M01.
8. Начало анализа образцов сначала с помощью регулятора "Двойной положительный результат ".
   1. Нажмите на кнопку "Load".
   2. Поместите 1,5 мл трубки с "Двойной Позитивный" образца из шагов 3,4 до 3,9 в загрузчиком образца.
   3. Выберите цель 40X на вкладке "увеличивающим".
   4. Включите 405 мВт и642 мВт лазеры.
   5. Включите "Светлое" канала.
   6. Нажмите на кнопку "Select Intensity".
   7. На основе "Двойной Позитивный" контрольного образца, определить желаемую интенсивность для 405 мВт лазер поэтому детектор не перегружена.
      Примечание: Например, оптимальная интенсивность для этого эксперимента была установлена ​​на уровне 11 мВт.
9. После того, как требуемая настройка достигается, сбор данных.
   1. На вкладке "Файл" Приобретение, введите в тексте пользовательского имени файла. Выберите папку для сохранения файла (ов) данных.
   2. Введите число ячеек, чтобы приобрести рядом с "Collect". Как правило, это число колеблется в пределах от 1000 до 10000.
   3. Нажмите на кнопку "Acquire".
      Примечание: После того, как желаемое количество клеток приобретается, файл данные автоматически сохраняются в ранее выбранной папке.
10. После завершения приобретения, загрузите следующий контрольный образец - DIO только контроль.
    1. Нажмите на кнопку "Load".
    2. Поместите 1,5 мл трубки с "только DiO" образца в погрузчиком образца.
    3. Оставьте цель 40X на вкладке "увеличивающим" выбран.
    4. Оставьте 405 мВт лазер включен.
    5. Выключите мВт лазер 642 и "Светлое" канал.
       Примечание: Теперь, когда требуемая настройка достигнута, данные могут быть получены.
    6. На вкладке "Файл" Приобретение, введите в тексте пользовательского имени файла и выберите папку для сохранения файла (ов) данных. Введите число ячеек, чтобы приобрести рядом с "Collect.". Как правило, это число равно 1000.
    7. Нажмите на кнопку "Acquire".
       Примечание: После того, как желаемое количество ячеек приобретает файл данные автоматически сохраняются в ранее выбранной папке.
11. Повторите шаг 8,10 для "только ПИ" контрольного образца. Экспериментальные образцы теперь готовы быть собраны.
12. Обращайтесь с remainiнг экспериментальных образцов, в том числе "Спонтанное Образцы 'S'" следующим образом:
    1. Оставьте цель 40X на вкладке "увеличивающим" выбран.
    2. Включите 405 мВт и 642 мВт лазеров.
    3. Включите "Светлое" канала.
    4. Нажмите на "Установить интенсивность."
    5. На вкладке "Файл" Приобретение, введите в тексте пользовательского имени файла и выберите папку для сохранения файла (ов) данных. Введите в тексте пользовательского имени файла.
    6. Введите число ячеек, чтобы приобрести рядом с "Collect".
    7. Нажмите на кнопку "Acquire".
       Примечание: После того, как желаемое количество ячеек приобретает файл данные автоматически сохраняются в ранее выбранной папке.
13. Повторите шаг 8,12 для всех экспериментальных образцов.
14. После того, как будут собраны все экспериментальные данные и файлы, нажмите кнопку "Завершение работы" для стерилизации системы.

9. ImaginАнализ проб г Поток Цитометр

1. Открыть поток изображений цитометра применения программного обеспечения для анализа.
2. Под "Файл", открыть экспериментальный файл .RIF.
3. Построить новую матрицу, используя .RIF файлы одного цвета (DIO-только контроль и PI-только контроль, созданный на этапах 8.10 и 8.11), выбрав "Создать новую матрицу" на вкладке компенсации в потоке изображений цитометра программного обеспечения.
   Примечание: Программа запросит выбора одного цвета файлов и объединить их, чтобы создать файл матрицы (.ctm расширение файла), который должен быть выбран, чтобы применить компенсацию канала.
4. Создание точечных участков с помощью функции «строительных блоков» программного обеспечения.
   1. Создание точка-сюжет (BrightFieldGradient_RMS против частоты) до ворот сфокусированные клетки. Вызов ворота "Фокус" (рисунок 1А).
   2. Использование "Фокус" ворота, создать точечный участок светлого поля Площадь против светлого поля Соотношение сторон к г ели Синглетное клетки. Вызовите ворота "Single" (рис 1B).
   3. С помощью "Single" ворота, создать точечный участок Intensity_MC_Ch02 против Intensity_MC_Ch5. Используйте этот участок , чтобы идентифицировать и ворота DIO-положительным только клетки (цели, живой) и PI-DiO дважды положительные клетки (мишени, мертвые) (Рисунок 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все участки описано в пунктах 9.4.1, 9.4.2 и 9.4.3 могут быть созданы с помощью функции «строительных блоков» программного обеспечения.
5. Нажмите на функцию статистики дот участка для доступа к номерам ячеек каждого ворот.
6. Вычислить процент мертвых мишеней в образце спонтанной и экспериментальных образцов по следующей формуле:
   % мертвые мишени в образце = (#dead мишени х 100) / (# живых целей + #dead цели)
7. Вычислить цитотоксичности, используя следующую формулу:
   % Цитотоксичности = [(Экспериментальная мертвых Спонтанное мертвых) / (100-Спонтанное мертвых)] x100

_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 ">
Рисунок 1: Типичные гистограммы, диаграммы рассеяния и изображения для анализа цитотоксической активности. Анализ (A) фокус ячейки. (B) одного анализа клеток. (C) целевого окрашивания клеток анализ. Все измерения производятся с использованием изображения, прикрепленную к каждому событию. Это могут быть доступны в программное обеспечение для анализа, просто нажав на события на графиках. (D) представитель образ события дублета, показывая апоптический клетки NK и цель живого K562. CH01, Светлое. CH02, DIO. CH05, PI. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Результаты

Определение подсчета NK клеток
Эффект тяжелого бега по учетным NK клеток в цельной крови измеряли, используя протокол упражнений , описанный на фиг.2. Образцы крови отбирали перед тренировкой, сразу после тренировки, 1,5 ч после физической нагрузки, и, наконец...

Обсуждение

Описанный в данном исследовании метод непосредственно измеряет удельную активность NK-клеток индивидуума в ответ на раздражители (в данном конкретном случае, продолжительные упражнения). Как правило, клетки NK изолированы от своей крови с использованием градиентов плотности или сорти?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
K-562 lymphoblasts	ATCC	CCL-243
Iscove's Modified Dulbecco's Media	ATCC	30-2005	High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered
Alpha Minimum Essential medium	ATCC	CRL-2407	Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate
Trypan Blue Solution 0.4%	Amresco	K940-100ML	Tissue culture grade
Propridium Iodide Staining Solution	BD Pharmingen	51-66211E
Vybranto DiO cell-labeling solution	Vybranto	V-22886
autoMACS Pro Separator	Miltenyi Biotec	130-092-545
autoMACS Running Buffer	Miltenyi Biotec	130-091-221
autoMACS Washing Buffer	Miltenyi Biotec	130-092-987
autoMACS Columns	Miltenyi Biotec	130-021-101
Whole Blood CD56 MicroBeads, human	Miltenyi Biotec	130-090-875
ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer	EMD Millipore
Speedbeads	Amnis Corporation	400030
0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer)	VWR	JT9416-1
Coulter Clenz	Beckman Coulter	8546929
70% Isopropanol (Debubbler)	EMD Millipore	1.3704
D-PBS (Sheath fluid)	EMD Millipore	BSS-1006-B (1X)	No calcium or magnesium
INSPIRE Software	EMD Millipore		Version Mark II, September 2013
Ideas Application Software	EMD Millipore		Version 6.1, July 2014