Жила интерпозиция Модель: A Подходит модель для изучения шунтирование проходимость

Резюме

This video demonstrates a model to study the development of myointimal hyperplasia after venous interposition surgery in rats.

Аннотация

Bypass grafting is an established treatment method for coronary artery disease. Graft patency continues to be the Achilles heel of saphenous vein grafts. Research models for bypass graft failure are essential for a better understanding of pathobiological and pathophysiological processes during graft patency loss. Large animal models, such as pigs or sheep, resemble human anatomical structures but require special facilities and equipment. This video describes a rat vein interposition model to investigate vein graft patency loss. Rats are inexpensive and easy to handle. Compared to mouse models, the convenient size of rats permits better operability and enables a sufficient amount of material to be obtained for further diverse analysis. In brief, the inferior epigastric vein of a donor rat is harvested and used to replace a segment of the femoral artery. Anastomosis is conducted via single stitches and sealed with fibrin glue. Graft patency can be monitored non-invasively using duplex sonography. Myointimal hyperplasia, which is the main cause for graft patency loss, develops progressively over time and can be calculated from histological cross sections.

Введение

заболевания коронарной артерии и их осложнения являются одной из основных причин смерти во всем мире. Современные терапевтические стратегии сосредоточены на восстановлении кровотока, либо путем растягивать суженного сосуда, либо путем создания байпас. Аортокоронарное шунтирование (АКШ) с использованием аутотрансплантатов вены была впервые описана в 1968 году и был усовершенствован на протяжении многих лет. Помимо реваскуляризация левой передней нисходящей коронарной артерии, подкожную вену кабелепроводы чаще всего используется ^1. Тем не менее, привитой проходимость остается ахиллесовой пятой подкожных венозных шунтов (SVG). Через год после операции, привитой проходимость составляет 85%, снизившись до 61% после того, как десять лет ^2,3. Отсчет патофизиологические механизмы и причины потери проходимости SVG поэтому является важной задачей.

Это видео демонстрирует вены модель интерпозиция крысы исследовать вены потери трансплантата. Общие цели этого метода, чтобы изучить основные pathobiologicalи -physiological процессы при прогрессирования заболевания и разработать подходящую модель для лекарственного средства или терапевтического тестирования вариант. Пересаживая поверхностной эпигастральной вены в артериальной системе, эта модель точно имитирует клиническую установку аортокоронарное шунтирование. Хирургическая травма, ишемия, и напряжение стенки являются важными триггерами патологических изменений сосудов и имитированы в описанной модели.

Различные модели и виды доступны для исследования вен трансплантата потери проходимость. Большие модели животных, таких как свиньи, овцы ^{4 5, 6} собак и обезьян ^7, напоминают человеческий сосуд и анатомических структур и , таким образом , позволяют комплексные терапевтические стратегии, такие как обводной стентирования или новых хирургических методов, которые будут проверены ^8. Тем не менее, специальный корпус, оборудование и персонал требуется. Кроме того, высокая стоимость и необходимость дополнительной анестезиолога во время операции препятствуют их широкому применению. Smвсе животные, включая крыс, просты в обращении, не требуют специального корпуса, и имеют управляемые расходы. По сравнению с моделями мыши ^9,10, модели крысы имеют преимущество лучшей работоспособностью и , следовательно , меньшую вариабельность в результатах. Крысы являются физиологически и генетически более похожи на людей , чем у мышей ^11,12. Кроме того, большинство мышей дикого типа только развивают ограниченную myointima ^13, которые делают модели мыши , склонных к ошибкам II типа. Гистологию главных жилок мыши, например нижней полой вене, только состоит из нескольких слоев клеток и делает ранней оценки трудной ^13. Еще одним недостатком является небольшое количество доступной для последующего анализа после восстановления трансплантата ткани.

Модель, описанная в этом видео является воспроизводимой, недорогой и легко выполнять, и она может быть установлена ​​быстро и надежно. Это особенно хорошо подходит для оценки дорогостоящих экспериментальных терапевтических агентов, таких как вирусные векторыдля генной терапии, в экономической моды.

протокол

Животные получали гуманного ухода в соответствии с Руководством по Принципам лабораторных животных, подготовленный Институтом лабораторных животных ресурсов и опубликованных Национальным институтом здравоохранения. Все протоколы животных были утверждены ответственным местным органом власти ( "АМТ für Gesundheit унд Verbraucherschutz, Hansestadt (Управление по здравоохранению и защите прав потребителей) Гамбург").

1. Уход за животными

1. Получить крыс Льюиса (LEW / CRL) крыс и ROSA / трансгенных крыс люциферазы-LEW весом 300-350 г из Института лабораторных животных.
2. Держите крыс в обычных условиях в вентилируемых шкафах и кормить их стандартной чау крысы и автоклавного воды вволю.
3. Выполните привитой трансплантация с помощью ROSA / люциферазы-LEW трансгенных крыс в качестве доноров, так и сингенных крыс LEW / CRL как получателей.

2. Подготовка доноров Rat

1. Используйте Inductионной камеры к анестезировать крысы с изофлуран (2,5-3%).
2. Поместите крысу на его спине и поддержания анестезии с лицевой маски, покрывающей рот и нос. Проверить наличие достаточной глубины анестезии, зажимая задние ноги и проверяя отсутствие рефлексов. Нанесите мазь ветеринара для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
3. Спред задние ноги и зафиксировать их положение с помощью липкой ленты.
4. Бритье паховой волос с триммером волос и дезинфицировать всю область с помощью повидон-йода с последующим 80% этанола. Повторите шаг дезинфекции два раза.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургический область, марля, и хирургические инструменты должны быть стерилизованы. Поддерживать стерильное поле в течение всей процедуры и износа одноразового использования, стерильные хирургические перчатки, маски и шапочки.
5. Под микроскопом выполняют вертикальный разрез вдоль линеа inguinalis. Используйте два пинцета, чтобы аккуратно отделить подкожные ткани и подвергать поверхностной эпигастральной вены от его OriGin на бедренную вену. Тщательно изолировать поверхностный эпигастрии вены от окружающих тканей.
6. Прекратить кровоток в поверхностных эпигастральной вены с использованием двух микро зажимов.
7. Урожай приблизительно от 0,5 до 1 см сегмент вены, осторожно поднимая изолированную вену с пинцетом и резки через сосуд с microscissors. Оставьте микро зажимы на пне судна, чтобы предотвратить потерю крови. Поместите удаленную часть вены на стерильную марлю. Аккуратно поместите 30 G иглу внутрь одного конца заготовленной вену и промойте сосуд с гепарином (50 ед / мл).
   Примечание: Ручка вены с осторожностью и во избежание повреждения во время подъема, резки и гиперемии. Убедитесь в том, чтобы очистить трансплантата с правильным количеством гепарина.
8. Держите сегмент сосуда в 1% лидокаина на льду до трансплантации в крысу реципиента, чтобы предотвратить спазм сосудов.
9. Эвтаназии доноров крыс путем увеличения анестезии до 5% изофлуран. Через 2-3 мин, оран живота вдоль белой линии, вырезать через диафрагму, и удалить сердце, чтобы остановить циркуляцию.

3. Подготовка крысы-реципиента

1. Обезболить и зафиксировать крысы-реципиента таким же образом, как донор крысы.
2. Бритье медиальной стороны ног с триммером волос и продезинфицировать три раза с использованием повидон-йода и 80% этанола.
3. Мониторинг глубины анестезии и убедитесь, что достаточно проверив отсутствие рефлексов при зажимая задние ноги.
4. Выполните медианный бедренной кости надрез от колена до паховой складки. Под микроскопом, используют 2 щипцов для отделения бедренной артерии от его окружения.
5. Используйте микро зажимы, чтобы остановить поток крови. Поместите проксимальный зажим первой, а затем дистальный зажим.
6. Вырежьте короткий отрезок зажатом бедренной артерии с microscissors и выбросьте его. Сократите оставшийся обрубок с артериальной microscissors, создавая зазор, который1-2 мм больше, чем вены трансплантата. Промойте артериальную культю с гепарином, используя иглу 30 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если адвентиции немного выступает за пределы культи сосуда, используйте пинцет, чтобы вытащить его слегка над концом сосуда и удалить часть.
7. Поместите заготовленную вену с шага 2.8 между артериальных пней и отрегулируйте длину таким образом, чтобы он соответствовал соответствующим образом в зазор. Обратите внимание на направление вены.
8. Выполните проксимального анастомоза первым использованием 10-0 проленовой швом. Проведение одиночных стежков в порядке , показанном (рис 1D). Начните с швом на каждой боковой стороне перед добавлением еще три наложения швов на брюшной стороне. Затем поместите три шва на спинной стороне сосуда для завершения анастомоза.
9. Соедините дистальных сосуды с трансплантатом, используя ту же технику, что и для проксимального анастомоза, описанной в пункте 3.8. Опять же, начните с швом на каждой боковой стороне, а затем поместить три наложения швов на вентральной ИДСе и спинной стороне.
10. Загрузка двух 1-мл шприцы с фибринового клея компонента 1 и 2. Осторожно поднимите трансплантат с пинцетом и падение приблизительно 100 мкл фибринового клея компонента 1 под трансплантат, а затем компонента 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что компоненты 1 и 2 применяются в соотношении 1: 1.
11. Поместите трансплантата обратно в его положение и уронить дополнительные 100 мкл компонентов 1 и 2 на верхней части трансплантата. Убедитесь, что клей охватывает как трансплантат и анастомоза с целью предотвращения анастомоза недостаточности и чрезмерного вздутие вены трансплантата.
12. Осторожно откройте дистальный зажим, после чего проксимальный.
13. Подтвердите успешную операцию по проверке для видимого импульса в пересаженной вены и дистальной артерии трансплантата.
14. Удалить излишки клея, который препятствует закрытие кожи. Используйте пинцет, чтобы поднять отвержденного клея и удалить излишки с microscissors. Закройте слои кожи с 5-0 PROLENE швами.
15. Вводят 4-5 мг / кг подкожно Carprofen, прежде чем разрешить крыса, чтобы проснуться. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Держать животное в одной клетке, пока она не будет полностью восстановлена.
16. Добавить метамизол в питьевой воде (50 мг Метамизол на 100 мл) в качестве обезболивающего для следующих 3-х дней и следить за животное в день.

4. Дуплекс сонография

Примечание: Используйте duxplex сонография для визуализации кровотока неинвазивно у крыс ^14.

1. Анестезировать крысу в индукционной камере (изофлурановым 2%). Поместите крысу на его спине и поддержания анестезии с лицевой маской, покрывающей нос.
2. Используйте машинки для стрижки волос и крем для удаления волос для удаления волос вокруг области бедра.
3. Применение ультразвука гель на бедро. Убедитесь, что нет воздушных пузырьков. Приобретать дуплексных изображений сонография с использованием MS 400 преобразователя (центральная частота: 30 MГц) с частотой кадров 230-400 кадров / сек.

5. Гистологическое

Примечание: Урожай и окрасить сосуд с окрашивании трихромом Массона для морфометрического анализа ^15.

1. Закрепить заготовленную сосуд в 4% параформальдегид в течение ночи и обезвоживают его в возрастающих концентрациях этанола. Вставить образец в парафин и разрезать его на 5 мкм ломтики толщиной с использованием микротома.
   Примечание: параформальдегид является токсичным и должны быть обработаны с особой тщательностью.
2. Deparaffinize слайды перед тем окрашивания их с трихромом окрашивания раствором. Обезвоживают слайды окрашивали, очистить их с помощью ксилола и смонтировать их в монтажной среде. После сушки слайды, просмотреть образцы с помощью микроскопа.

6. биолюминесценции томография (BLI)

ПРИМЕЧАНИЕ: Послеоперационный лоскут отслежены с течением времени в естественных условиях путем измерения биолюминесцентного сигнала ¹6.

1. Растворить 1 г D-люциферин калия соли в 22 мл PBS и вводят его внутрибрюшинно в крыс (375 мг / кг массы тела). Подождите 15 минут для люциферин циркулировать в животных.
2. Поместите крысу в режиме реального времени системы биолюминесцентная количественной оценки и получить доступ к сигнал биолюминесценции.

Результаты

Модель интерпозиция крысы вены подходит для изучения развития myointima гиперплазии и недостаточности вен трансплантата. Животные хорошо восстановиться после операции и показать превосходное физическое состояние после завершения его эксплуатации. На рисунке 1 показаны основны...

Обсуждение

Это видео демонстрирует вены модель интерпозиция крысы исследовать вены потери трансплантата и разрешить для исследования лежащих в основе патологических процессов и тестирования новых лекарств или терапевтических возможностей.

Обезболивание является одним из важн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat LEW/Crl	Charles River	Stock number 004
Rat LEW-Tg(Gt(ROSA)26Sor- 1 luc)11Jmsk	Institute of laboratory animals, Kyoto University, Japan	NBPR rat number 0299	http://www.anim.med.kyoto-u.ac.jp/NBR/
PFA 4%	Electron Microscopy Sciences	#157135S	20%
hair clipper	WAHL	8786-451A ARCO SE
Forene	AbbVie	PZN 10182054 Art.Nr.: B506	Isoflurane
microsurgical clamp	Fine Science Tools	18055-04	Micro-Serrefine - 4 mm
clamp applicator	Fine Science Tools	18056-14
hair removal creme	Rufin cosmetic	27618
Povidone-Iodine	Betadine Purdue Pharma	NDC:67618-152
10-0 Ethilon suture	Ethicon	2814G
5-0 prolene suture	Ethicon	EH7229H
Rimadyl	Pfizer	400684.00.00	Carprofen
Novaminsulfon	Ratiopharm	PZN 03530402	Metamizole
Heparin	Rotexmedica	PZN: 3862340	25.000 I.E./ ml
Xylocain 1%	AstraZeneca	PZN: 1137907	Lidocain
EVICEL	J&J Med.Ethicon Biosur	PZN 7349697 Art. Nr.:EVK01DE	fibrin glue
NaCl 0.9%	B.Braun	PZN 06063042 Art. Nr.: 3570160
Vevo 770 high-resolution in vivo micro-imaging system	VisualSonics		duplex sonography
Ecogel 100 ultrasound gel	Eco-med	30GB
D-Luciferin Firefly, potassium salt	Biosynth	L-8220
PBS pH 7.4	Gibco	10010023
Xenogen Ivis 200	Perkin Elmer		bioluminescence imaging
Weigerts iron hematoxylin Kit	Merck	1.15973.0002	Trichrome staining
Resorcine-Fuchsine Weigert	Waldeck	2.00E-30	Trichrome staining
Acid Fuchsin	Sigma-Aldrich	F8129-25G	Trichrome staining
Ponceau S solution	Serva Electrophoresis	33427	Trichrome staining
Azophloxin	Waldeck	1B-103	Trichrome staining
Molybdatophosphoric acid hydrate	Merck	1.00532.0100	Trichrome staining
Orange G	Waldeck	1B-221	Trichrome staining
Light Green SF	Waldeck	1B-211	Trichrome staining
Vitro-Clud	Langenbrinck	04-0001
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	537020
37% HCl	Sigma-Aldrich	H1758
Xylene	Th. Geyer	3410
Paraffin	Leica biosystems	REF 39602004
Ethanol absolute	Th. Geyer	2246
Ethanol 96%	Th. Geyer	2295
Ethanol 70%	Th. Geyer	2270
Slide Rack	Ted Pella	21057
Staining dish	Ted Pella	21075
Bepanthen Eye and Nose ointment	Bayer	1578675	Eye ointment