Цефоперазон обработанных мышей Модель Клинически значимых<em&gt; Clostridium несговорчивый</em&gt; Штамм R20291

Резюме

Этот протокол описывает модель мыши цефоперазона из Clostridium несговорчивый инфекции (CDI) с использованием клинически релевантных и генетически-послушное штамм, R20291. Акцент на клиническом мониторинге заболеваний, C. несговорчивый бактериального токсина, перечисление цитотоксичности и гистологических изменений по всему КДИ в мышиной модели подробно описаны в протоколе.

Аннотация

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and consequently poses an urgent threat to public health. Recurrence of a C. difficile infection (CDI) after successful treatment with antibiotics is high, occurring in 20-30% of patients, thus necessitating the discovery of novel therapeutics against this pathogen. Current animal models of CDI result in high mortality rates and thus do not approximate the chronic, insidious disease manifestations seen in humans with CDI. To evaluate therapeutics against C. difficile, a mouse model approximating human disease utilizing a clinically-relevant strain is needed. This protocol outlines the cefoperazone mouse model of CDI using a clinically-relevant and genetically-tractable strain, R20291. Techniques for clinical disease monitoring, C. difficile bacterial enumeration, toxin cytotoxicity, and histopathological changes throughout CDI in a mouse model are detailed in the protocol. Compared to other mouse models of CDI, this model is not uniformly lethal at the dose administered, allowing for the observation of a prolonged clinical course of infection concordant with the human disease. Therefore, this cefoperazone mouse model of CDI proves a valuable experimental platform to assess the effects of novel therapeutics on the amelioration of clinical disease and on the restoration of colonization resistance against C. difficile.

Введение

Clostridium несговорчивый является анаэробная, грамположительных, спорообразующие бациллы , которая вызывает опасные для жизни понос ^1. C. несговорчивый инфекция (КДИ) связано с повышением заболеваемости и смертности людей и результаты в более чем $ 4,8 млрд в расходы на здравоохранение в ^1-4 года. В 2013 году Центры по контролю и профилактике заболеваний к категории C. несговорчивый как неотложное антибактериальной риска возникновения резистентности, что свидетельствует о том , что она представляет собой насущную угрозу для здоровья населения ^1. В настоящее время лечение антибиотиками с ванкомицин и метронидазол считаются стандартом лечения КДИ ^5. К сожалению, рецидив КДИ после успешного лечения антибиотиками высока, происходит в 20 - 30% больных ^2,5-7. Таким образом, открытие новых терапевтических средств против этого возбудителя кишечно необходимо. Для оценки терапевтических средств против C. несговорчивый, животной модели , приближенной к болезни человека в переменномlinically релевантных штамм необходим.

Первоначально постулаты Коха были созданы для C. несговорчивый в 1977 году с использованием клиндамицина обработанной модели сирийский хомяк ^8. Эта модель до сих пор используется сегодня , чтобы исследовать влияние C. несговорчивый токсинов на патогенез ^9,10. Тем не менее, CDI в модели хомяка приводит к высокому уровню смертности и не приближают хронические коварные проявления болезни , которые можно увидеть у людей с КДИ ^10,11. На основе доступности и наличия реагента мышиных платформ в области исследований, модель мыши CDI актуальна.

В 2008 году , надежная мышиную модель КДИ была создана путем обработки мышей с коктейлем антибиотика в питьевой воде (канамицин, гентамицин, колистину, метронидазол и ванкомицин) в течение 3 дней с последующим внутрибрюшинного введения клиндамицина ^12. Это сделало мышей восприимчивы к КДИ и тяжелым колитом. зависетьмости от дозы вводимого посевного материала, ряд клинических признаков и летальности можно наблюдать с помощью этой модели. Начиная с этого времени, различные схемы лечения антибиотиками были исследованы , что изменяют мышиный кишечную флору, снижение колонизационной резистентности к точке , где C. несговорчивый могут колонизировать желудочно - кишечного тракта (обзор в Best и др. И Лоли & Young) ^13,14.

Совсем недавно, широкий спектр цефалоспоринов, цефоперазон, приведены в питьевой воде в течение 5 дней или 10 дней воспроизводимо делает мышей , восприимчивых к КДИ ^15. Поскольку введение цефалоспоринов третьего поколения ассоциируются с повышенным риском КДИ в организме человека, использование модели цефоперазон более точно отражает природные заболевания ^16. Цефоперазон мышей , обработанных восприимчивого к C.difficile , были поставлены под сомнение с обоими C.difficile , спор и вегетативных клеток из множества штаммов в пределах клиническойАктуальность и вирулентности ^17. Несмотря на некоторые из оригинальных исследований с использованием C. несговорчивый вегетативные клетки в качестве инфекционной формы, C. несговорчивый споры считаются основным способом передачи ^18.

В последнее десятилетие, C. несговорчивый R20291, A NAP1 / BI / 027 штамм, возник, вызывая эпидемии КДИ ^19,20. Мы попытались определить клиническое течение заболевания , когда цефоперазон обработанных мышей заражали с клинически значимой и генетически послушный C. несговорчивый штамма, R20291. Этот протокол детали клинического течения, в том числе потеря веса, бактериальной колонизации, токсин цитотоксичности и гистологических изменений в желудочно - кишечном тракте мышей , зараженных спорами С. несговорчивый R20291. В целом, эта модель мыши оказывается ценным экспериментальной площадкой для КДИ аппроксимирующих болезни человека. Эта модель мыши отличающаяся таким образом, может быть использована для оценки последствийиз новых терапевтических средств на улучшение клинического заболевания и по восстановлению колонизационной резистентности против C. несговорчивый.

протокол

Этическое заявление:
По уходу и использованию животных комитет Институциональный (IACUC) в Государственном Университете Северной Каролины колледжа ветеринарной медицины (NCSU) одобрил данное исследование. NCSU Уход за животными и использование политики применяет стандарты и руководящие принципы , изложенные в Законе об охране животных и Закон расширение исследований здоровья 1985. объектов животного лаборатории в NCSU придерживаться руководящих принципов , изложенных в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных. Статусы здоровья животных оценивали ежедневно, а умирающие животные были гуманно эвтаназии СО ₂ удушья с последующим вторичных мер. Квалифицированные техников животных или ветеринаром проводили животноводство в AAALAC аккредитованного объекта в ходе этого исследования.

1. Введение антибиотика цефоперазона в питьевой воде для достижения Восприимчивость к C. несговорчивый инфицированию и развитию заболевания

ПРИМЕЧАНИЯ: 5- 8-недельных мышей C57BL / 6 WT (самки и самцы)были закуплены и помещены в карантин за 1 неделю до начала применения антибиотиков воды. После карантина мышей были помещены с автоклавного пищи, постельное белье и воды. Изменения Кейдж проводились еженедельно сотрудниками лаборатории в ламинарный.

1. Приготовьте цефоперазон (0,5 мг / мл) в стерильной дистиллированной воде за 7 дней до целевой день вызова (рисунок 1).
2. Заполните автоклавного воды бутылки с водой цефоперазона (0,5 мг / мл) и поместить их в каждой клетке мыши.
   Примечание: свежеприготовленные цефоперазон вода должна быть сделана и менять каждые 2 дня в течение периода 5 дней, как обозначено в шагах 1.1 и 1.2. Правильная утилизация цефоперазона воды ниже институциональные рекомендации по гигиене окружающей среды и безопасности рекомендуется.
3. Через 5 дней на цефоперазон воду, заменить бутылки с водой автоклавированы бутылками стерильной дистиллированной водой. Дайте мышам эту питьевую воду в течение всего срока эксперимента.

2. Приготовление C.difficile , Spore инокулята и желудочный зонд из мышей

Примечание: Перед началом работы убедитесь, что следующие элементы помещаются в анаэробной камере в течение по крайней мере 24 часа: 1x фосфатно-солевой буфер (PBS, см Материалы), таурохолат циклосерин цефокситин фруктозы агар (TCCFA) пластины (см Материалы и дополнительный файл ), а также стерильный L-образный расширитель.

ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши , стимулированными C. спор несговорчивый должны быть размещены в виварии уровень биологической безопасности 2.

1. Получают C.difficile , спорами запас желательного штамма (в данном случае, R20291) , который был подготовлен ранее и хранили при 4 ° С в стерильной воде ^21,22. Определить перечень этого споровой запаса перед использованием.
2. На основе известной концентрации (спор / мл) споровой запаса, рассчитать желаемое разбавление , чтобы получить 10 ⁵ спор на 25 мкл. Убедитесь, что объем инокулята достаточен для инокуляции всемышей в эксперименте (25 мкл на мышь), чтобы выполнить перечисление посевного материала (примерно 30 мкл), а также учитывать ошибки пипетирования.
3. Vortex оригинал C. несговорчивый Спора запас. Затем ресуспендируют расчетный объем (со стадии 2.2) исходной C. несговорчивый споровой запаса в стерильной воде в завинчивающейся крышкой трубки микроцентрифужных. Выполните это аэробно в ламинарном потоке. Определить эту смесь разбавленного как "споровой посевного материала."
4. Поместите Спора прививочный материал в водяной бане при 65 ° C и нагревают ее в течение 20 мин.
   Примечание: Этот шаг гарантирует , что только активные C.difficile , споры остаются после термообработки.
5. В капюшоне ламинарного потока, возьмите 50 мкл нагретой споровой посевного материала , поместите его в стерильную пробирку микроцентрифужных, и передать его в анаэробной камере ^23. Используйте этот образец для перечисления спорами.
6. В ламинарном потоке, загрузите оставшуюся подогреваемый спорами инокулята Intгабаритная 1-мл шприц прилагается к стерильной термометру наконечником иглы в желудок через зонд. Использование ручного шприца степпер, чтобы обеспечить точное и быстрое повторение дозирования между мышами. Убедитесь, что игла с принудительным кормлением заполнена споровой посевного материала нагретым до использования.
   Примечание: новая стерильная игла для принудительного кормления с каждой мыши не требуется. Тем не менее, если различные дозы C. спор несговорчивый вводят, новая игла с принудительным кормлением рекомендуется для каждой дозы.
   Примечание: C. несговорчивый споры обладают высокой устойчивостью к традиционным дезинфицирующим средствам. Таким образом, использование спороцидного дезинфицирующего средства, такие как # 62 Perisept спороцидного дезинфицирующие, необходимо. Производитель рекомендует время контакта 2- х мин , чтобы уничтожить C. спор несговорчивый.
7. С принудительным кормлением каждую мышь с 25 мкл споровой посевного материала. Сдерживать каждую мышь мягко схватив животное рыхлой кожей шеи и спины, чтобы иммобилизации голову. Используя указательный палец дополнительно обездвижить голову животного и кудлинить пищевод. Убедитесь в том, что животное не напевать или показать другие признаки бедствия во время сдержанности.
   Примечание: Общий объем дано мышам с помощью желудочного зонда не должна превышать 10 мл / кг веса тела (0,1 мл / 10 г).
8. Поддерживать мышь в вертикальном, вертикальном положении и аккуратно пройти через зонд иглу в сторону рта. Направьте иглу через зонд вдоль крыши рта и медленно продвигать иглу через зонд в пищевод.
   Примечание: Если какое-либо сопротивление встречается, то через желудочный зонд игла может входить в трахею и, следовательно, не должны быть выдвинуты, а удалены и переставлять сразу.
9. После того, как через желудочный зонд игла находится примерно на полпути в пищевод, вводят 25 мкл споровой инокулята нагретого и осторожно снять через зонд иглу из пищевода.
   Примечание: Силовое продвижение зондового иглы может привести к разрыву пищевода или желудка. Поэтому, если сопротивление при продвижении иглы через зонд, То лучше сразу удалить и переместить иглу через зонд.
10. Вернуть животное в клетку и наблюдать его для любого кашля или признаков дыхательной недостаточности, так как это может свидетельствовать о непреднамеренное введение трахеи или аспирации споровой посевного материала с подогревом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши очень восприимчивы к C. несговорчивый после лечения антибиотиками; Поэтому меры предосторожности для предотвращения перекрестного загрязнения между клетками имеет важное значение. Это особенно важно при управлении антибиотические обработке, но и неоспоримые мышей в качестве контрольной группы.
11. После засева всех мышей, поместите оставшиеся подогреваемый спор прививочный материал в стерильную пробирку микроцентрифужных и передать его в анаэробной камере для перечисления спорами.
12. Для перечисления споровой посевного материала нагретым (с шага 2.4), а остальные через желудочный зонд, нагретую споровой посевного материала, делают 1:10 серийные разведения каждого посевного материала в 1X PBS. Рекомендуется сделать и пластина 4 - 5 разбавление (т.е. 10 ^-1 через10 ^-5).
13. С помощью асептической техники, передача 100 мкл каждого последовательного разбавления на отдельной пластине TCCFA.
14. С помощью стерильной L-образный шпатель, равномерно разбавление, примененную к носителю в лунки планшета. Даже распространение разведенного инокулята имеет важное значение для точного подсчета спор.
15. Инкубируйте пластин анаэробно в течение 24 ч при 37 ° С. Через 24 часа C. несговорчивый колониеобразующих единиц (КОЕ) можно перечислить , чтобы получить инфекционный дозу вводили мышам в 25 мкл (0,025 мл) объем (см дополнительный файл "Пример вычислений"). C. несговорчивый колонии плоские и бледно - желтого цвета и имеют неровные края и притертой внешний вид ^24.
    Примечание: Предел обнаружения бактериального подсчета 10 ² КОЕ.

3. Контроль потери веса мыши и клинические признаки болезни в течение инфекции C. несговорчивый

1. взвешиватьnimals до и после лечения антибиотиком 5-дневный цефоперазона, после восстановления 2-дневного отключения антибиотиков (день 0), а затем в течение всего срока эксперимента.
   Примечание: Получение весов на последовательное время каждый день. Веса получен день вызова (день 0) следует использовать в качестве начальной исходной массы для сравнения на протяжении C.difficile , инфекции.
2. Поместите цифровые весы в шкаф биологической безопасности. Поместите стерильную пластиковую мензурку на весы и тарные вес пластикового стакана. Затем, осторожно поднимите мышь на основании хвоста и поместите его в пластиковый стакан.
   1. Поместите стакан обратно на весы. Hover рукой по верхней части стакана, чтобы гарантировать, что мышь не избежать. Это может занять 2 - 3 сек, чтобы получить стабильный вес. Затем, аккуратно поместите мышь обратно в клетку. Запишите этот вес и повторить процесс для каждой мыши в этой клетке.
      Примечание: Крайне важно, чтобы меры предосторожности для предотвращения перекрестного Загрязнителиние между клетками при получении веса. Каждая клетка мышей должна иметь свою собственную пластиковую мензурку для взвешивания. Пластиковые стаканчики должны быть продезинфицированы с спороцидного агентом между каждым использованием и покрывается стерильной алюминиевой фольгой.
3. Монитор оспариваемые животных два раза в день (как минимум) на наличие признаков клинически тяжелой инфекции C. несговорчивый, в том числе вялость, потеря аппетита, диарея и сгорбленной позе.
4. Гуманно эвтаназии животных , которые теряют 20% своего первоначального базового веса тела и / или развиваются тяжелые клинические признаки инфекции C. несговорчивый (перечисленных в пункте 3.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши , которые показывают клинические признаки инфекции C. несговорчивый должны быть взвешены по мере необходимости в ходе эксперимента , чтобы гарантировать , что они не потеряли 20% своего первоначального веса тела базовой линии. В течение ранних моментов времени в эксперименте, это может означать, два раза в день измерения.

4. Бактериальный Перечень C. несговорчивыйот мыши калом и содержимого слепой кишки

Примечание: Перед началом работы убедитесь, что следующие элементы помещаются в анаэробной камере в течение по крайней мере 24 часа: 1x PBS (см Материалы), TCCFA пластины (см Материалы), стерильный L-образный расширитель и стерильные микроцентрифужных трубки и / или ПЦР-планшеты для разведений.

1. Получение образцов для C. несговорчивый Перечисления
   Примечание: Перед получением фекалии или содержимое слепой кишки, весят стерильные пробирки микроцентрифужных в аналитическом масштабе. Регистрируют вес трубы на стороне трубки, округление до четырех знаков после запятой (например, 0,9864 г). Обозначим этот вес как "вес трубки." Каждый собранный образец должен быть помещен в стерильный, взвешивали центрифужную пробирку.
   1. Стерильный коллекция кала мыши
      1. Аккуратно сдерживаться каждую мышь, взявшись за животное рыхлой кожей шеи и спины, чтобы иммобилизации голову. Используйте мизинец, чтобы мягко сдерживать хвост животного, тHUS подвергая ануса. Убедитесь в том, что животное не напевать или показать другие признаки бедствия во время сдержанности.
      2. Держите стерильный, взвесили микроцентрифужных трубки непосредственно под ануса животного. Крайне важно, чтобы труба не вступает в непосредственный контакт с мышью.
         1. Как животное испражняется, соберите фекальный осадок в трубку. Держите трубку при комнатной температуре, пока все образцы фекалий не собираются. Это может занять несколько минут для мыши к дефекации, что требует повторных попыток сбора фекалий.
      3. Взвесить пробирки, содержащие фекалии на аналитическом уровне. Запишите вес трубки, округление до четырех знаков после запятой (например, 1,0021 г). Обозначим полученную массу в качестве «конечного веса трубки."
      4. Проходят фекальных образцов в анаэробной камере для бактериального подсчета непосредственно после сбора кала.
   2. Стерильный коллекция мыши содержимого слепой кишки во время аутопсии
      1. После гуманной эвтаназии СО ₂ удушья с последующим вторичных мер, выполнить вскрытие , чтобы получить слепая кишка ^25. Слепая кишка является большим, форме запятой часть желудочно-кишечного тракта.
      2. Поместите слепую кишку на стерильной пластиковой чашке Петри. Используйте одноразовые, стерильные NO. 10 Скальпель лезвие, чтобы отрезать слепая кишка открыт с глухом конце пакета, чтобы выставить содержимого слепой кишки.
         1. Осторожно извлечь содержимое слепой кишки с применением светового давления с скальпелем и подметание содержимое по направлению к вырезанной части слепой кишки.
            Примечание: Следует соблюдать осторожность, чтобы не нарушить слепой кишки ткани, который будет представлен для гистологической экспертизы.
      3. Поместите содержимое слепой кишки в стерильный, взвешивали микроцентрифужных трубки сразу же после сбора. Только около 10 мг содержимого слепой кишки требуется для бактериального подсчета.
      4. Взвесить пробирки, содержащие содержимое слепой кишки на аналитической SCALе. Запишите вес трубки, округление до четырех знаков после запятой (например, 1,0021 г). Обозначим полученную массу в качестве «конечного веса трубки."
      5. Проходят образцы содержимого слепой кишки в анаэробной камере для бактериального подсчета.
2. Бактериальный Перечень C. несговорчивый
   1. Вычислить конечный вес содержимого (фекалии или слепой кишки) , которые будут перечислены для C. несговорчивый. Выполняется это путем вычитания "конечного веса трубки" от "веса трубы."
   2. Вычислить 1:10 разбавление содержимого в 1X PBS и ресуспендируют соответственно. Для фекальных шариков, используйте кончик пипетки, чтобы аккуратно разрушить осадок в растворе (см дополнительный файл "Пример вычислений").
   3. Анаэробно инкубировать эти образцы ресуспендировали при комнатной температуре в течение 30 мин, что позволяет содержимое осесть.
   4. Сделать серийные разведения для каждого образца в 1X PBS для перечислениярение КОЕ на грамм содержимого (кала или слепой кишки). Выполните это анаэробно.
   5. С помощью асептической техники, передача 100 мкл каждого последовательного разбавления до TCCFA пластин. Используя стерильный L-образный расширитель, распространение разбавления применяется в средствах массовой информации, чтобы равномерно распределить его по всей пластине. Даже распространение разбавления имеет важное значение для точного подсчета колоний.
   6. Инкубируйте пластин анаэробно в течение 24 ч при 37 ° С. В это время, перечислить C.difficile , колонии для получения КОЕ на грамм содержимого (кала или слепой кишки). C. несговорчивый колонии плоские и бледно - желтого цвета и имеют неровные края и притертой внешний вид ^24.
      Примечание: Этот протокол может быть использован для перечисления C.difficile , с другой мышиной содержанием GI, включая подвздошной и ободочной содержание. ПЦР-пластины могут быть использованы для изготовления серийных разведений.

5. Vero Cell цитотоксичности на Количественно C. несговорчивый токсинного Cytotoxiгород

Примечание: Рекомендуется, чтобы этот анализ выполняется после завершения модели мыши на образцах, собранных при аутопсии и хранили при -80 ° С. Асептики клеточной культуры имеют важное значение для предотвращения загрязнения клеток Vero в ходе этого анализа. Этот протокол занимает 2 дня для выполнения. Все фекалии и кишечного содержимого, используемым в этом анализе необходимо хранить в взвешивали, стерильной микроцентрифужных трубки (обозначаемой с "массой трубки", смотрите раздел выше). Вес конечная труба (включая содержимое) измеряется с помощью аналитической шкалы до ближайших четырех знаков после запятой (см раздел выше). Использование многоканальной пипеткой рекомендуется для этого анализа.

Примечание: Перед началом работы убедитесь, что следующие элементы доступны: Vero Клетки, модификации Дульбекко орла средней (DMEM) 1x 10% инактивированной нагреванием эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина СМИ (обозначается как "DMEM 1x СМИ; "см Материалы и дополнительный файл), 0,25%Трипсин-ЭДТА, 1x PBS, 0,4% трипанового синий, 96-луночного культуры клеток с плоским дном пластины, 96-луночного фильтр пластины, Clostridium несговорчивый Токсин А (аликвоты в 3 мкл на 1 мкг / мкл в сверхчистой воды и хранить при температуре -80 ° С), Clostridium несговорчивый Антитоксин, рабочий лист (для расчетов и карт пластины, см дополнительные файлы).

Примечание: Следует соблюдать осторожность во время этого анализа для облучения персонала к C. несговорчивый и его токсина.

1. Деление клеток Vero (день 1)
   1. Предварительно подогревают носитель DMEM, 1x, 0,25% трипсин-ЭДТА и 1X PBS в водяной бане при 37 ° C.
   2. Получают колбу клеток Vero из клеточной культуры инкубатор (37 ° C и 5% CO ₂₎ и поместите его в стерильной капот культуре клеток ламинарного потока. Используйте 70% этанола, чтобы вытирать капот и оборудование перед использованием. Использование серологические пипетки, аспирация носитель из колбы для культуры ткани, чтобы удалить его из клеток Vero и выбросить его в отходы Container.
   3. Промыть клетки Vero с 5 мл 1x PBS (предварительно нагретый) в колбе для культивирования тканей. Аспирируйте PBS и выбросить его в контейнер для отходов.
   4. Добавляют 5 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в колбу с тканевой культурой. Дайте время контакта 2 - 3 мин. За это время наблюдать клетки начинают отрываться поверхности колбы. Осторожно покачайте ткани сторону культуры колбы в сторону, чтобы ослабить клетки Vero.
   5. После того, как время контакта с трипсин-ЭДТА, сразу же добавляют 5 мл DMEM, скорости 1x в колбу с тканевой культурой. Это нейтрализует трипсин-ЭДТА. Используйте этот раствор осторожно смывки неприкрепленные клетки Vero от задней части колбы. Затем, с помощью серологических пипетки перенести эту смесь в 15 мл коническую трубку.
   6. Центрифуга клетки Vero в конической пробирке в течение 5 мин при 180 х г и 25 ° C. Убедитесь в том, что центрифуга правильно сбалансирован. После того, как центрифугирование, наблюдать видимый осадок клеток Vero в нижней части конической трубки. Будьте осторожны, чтобы не DISRУПТ этот осадок. Аспирируйте от супернатанта из коническую трубку и выбросить его.
   7. Ресуспендируют клеток Vero в 3 мл DMEM, скорости 1x.
2. Подсчет клеток Vero
   1. Добавьте 100 мкл суспензии клеток Vero (сделанный на стадии 5.1.7) до 100 мкл 0,4% трипановым синим. Аккуратно перемешать с помощью пипетки раствор вверх и вниз.
   2. Добавляют 10 мкл этой смеси в каждой камере гемоцитометра.
   3. Подсчет количества жизнеспособных клеток в четырех квадрантах гемоцитометра. Мертвые клетки Vero займет трипанового синего и, таким образом, будет окрашен в голубой цвет (эти клетки не должны учитываться). Запишите эти номера в "Vero клеток рабочего листа" при условии.
   4. Суммировать общее число жизнеспособных клеток Vero во всех четырех квадрантах и ​​вычислить среднее значение. Умножаем на коэффициент разбавления, который является 2, так как 100 мкл клеток в общей сложности 200 мкл жидкости.
   5. Умножить на поправочный коэффициент, чтобы дать "; количество клеток / мл "При использовании гемоцитометра, коэффициент коррекции всегда 10 ⁴ Умножение общего объема , чтобы дать." общее количество клеток "..
3. Определение количества лунок , необходимое для каждого эксперимента
   Примечание: Один образец (либо фекалии или кишечного содержимого) требует 24 отдельных скважин, которые должны выполняться в двух экземплярах. В концентрации 10 ⁵ Vero клеток на лунку (общий объем 90 мкл) требуется.
   Примечание: Если желательно , чтобы инкубировать Веро клетки 96-луночные планшеты в течение ночи при 37 ° С, в концентрации 10 ³ Vero клеток на лунку рекомендуется для учета расширенного времени инкубации. Расчеты в пределах ячейки рабочего листа Веро должны быть скорректированы с учетом этого изменения.
   1. Определить количество скважин, которые могут быть использованы на основе количества клеток Vero доступных (со стадии 5.2, использование ячеек рабочего листа Веро, в комплект поставки).
   2. Определить объемСуспензию клеток Веро необходимо для заполнения количество требуемых скважин (на основе количества проб тестируется). Убедитесь в том, что любой дополнительный объем добавляется в учетную запись для пипеткой ошибку (используйте входящий в комплект Vero клеток рабочего листа).
   3. Развести клеточной суспензии Vero (полученного на стадии 5.1.7) в DMEM, скорости 1x, чтобы получить объем, требуемый для эксперимента.
4. Посев Vero клеток в 96-луночный культуральный планшет
   1. Использование клеток Vero взмучивания с шага 5.3.2, использовать пипетку многоканальный для добавления 90 мкл суспензии клеток Vero в каждую лунку 96-луночный культуральный плоским дном пластины.
   2. Инкубируйте планшет с клетками Vero в культуре клеток инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% CO ₂ в течение как минимум 4 часов перед добавлением токсина (образцов) в лунки. Это время инкубации позволит клетки Vero придерживаться нижней части каждой лунки.
5. Создание маточных растворов из образцов (Кал илиКишечные содержимое)
   Примечание: Все образцы должны иметь "вес трубки" и "конечный вес трубки", измеренный с помощью аналитической шкалы. Используйте Vero Cell Рабочий лист для расчетов.
   1. Рассчитывают вес содержимого. Преобразовать г в мг, затем мг до мкл. Высчитать окончательное общее количество мкл раствора, необходимых, чтобы сделать разведение 1:10 в 1X PBS. Вычислить общую сумму 1x PBS, чтобы добавить к образцу.
   2. Добавьте общий объем 1x PBS (рассчитанное выше) к образцу. Выполните это аэробно, и с помощью асептической техники. Для фекальных шариков, используйте кончик пипетки, чтобы аккуратно разрушить осадок в раствор.
   3. Vortex образцы, а затем центрифугировать их в 3522 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Убедитесь в том, что центрифуга правильно сбалансирован. Будьте осторожны, чтобы не нарушать осадок и ресуспендируют образца в раствор.
      Примечание: Во время этапа 5.5.3, если только несколько образцов находятся в стадии обработки, содержимое может быть стерилизованпропуская их через один фильтр 0,22 мкм вместо использования фильтрующей пластины 96-луночного. Некоторые образцы могут потребовать несколько фильтров для стерилизации всего содержимого тома с помощью этой техники.
   4. Стерилизацию образец / PBS смесь, взяв 150 мкл надосадочной жидкости и размещение его на отдельные лунки на фильтровальную пластину 96-луночного. Поместите пластину фильтра надежно в верхней части 96-луночный культуральный плоской нижней пластине так, чтобы содержимое будет просачиваться в этой пластине.
   5. Центрифуга пластина фильтра / ячейки стека культуры пластины на 431 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре. Убедитесь в том, что центрифуга правильно сбалансирован и что / ячейку стека культуры пластины фильтра пластины плотно выровнены и не сместится во время центрифугирования.
      Примечание: Эти отфильтрованные содержание являются 10 ^-1 запас , который будет использоваться в смесительный пластин.
   6. Поместите пластину с отфильтрованных образцов на лед.
6. Создание Разбавление Plate # 1
   Примечание: При разбавлении Плат.е # 1 (DP # 1) потребует 6 скважин на выборку, в том числе положительных (C. несговорчивый токсин типа А) и отрицательные (1x PBS) управления (см DP # 1 макет на ячейке рабочего листа Vero).
   1. Для приготовления положительного контроля ( что C.difficile токсин типа А) для этого анализа, получают 3-мкл аликвоты (1 мкг / мкл) от -80 ° C и добавляют 297 мкл сверхчистой воды, получая конечную концентрацию 0,01 мкг / мкл. Место на льду.
   2. Этикетка скважин с их разведений (10 ^-1 до 10 ^-6) для каждого образца и указать положительный и отрицательный контроль (см DP # 1 макет).
   3. Добавить соответствующее количество 1х PBS в каждую лунку. В 10 ^-1 колодцев, не добавляют PBS. За 10 ^-2 до 10 ^-6 лунки, добавляют 90 мкл 1x PBS.
   4. Добавить соответствующее количество образцов в каждую лунку. В 10 ^-1 лунки, добавляют 100 мкл 10 ^-1 запаса для каждого образца (см Шаг 5.5.7 из фильтра Platд). За 10 ^-2 до 10 ^-6 скважин, делают серийные разведения; начать с принятия 10 мкл из 10 ^-1 лунку и добавить его к 10 ^-2 хорошо. Продолжить серийные разведения к 10 ^-6 разбавления.
   5. Накройте DP # 1 пластина с прозрачной пластиковой липкой печатью и поместите его на льду.
7. Создание Разбавление Plate # 2
   Примечание: Разбавление Plate (DP # 2) потребуется 2 полосы движения из 6 лунок для каждого образца, в том числе положительных и отрицательных контролей (см DP # 2 расположение на листе Vero Cell).
   1. Этикетка скважин с их разведений (10 ^-1 до 10 ^-6) для каждого образца и указать положительный и отрицательный контроль (см DP # 2 макета). Этикетка скважин с именем образца (обозначается как «образец скважин») или образца имени с антитоксина (обозначается как "антитоксина скважин").
   2. Рассчитать количество антитоксина, необходимое для этого анализа. Примечание: Антитоксин является 25x запасРешение, которое должно быть разбавлен 1:25 в 1х PBS. Поместите приготовленный раствор Антитоксин 1x на льду.
   3. Для "пробы скважин," добавить 20 мкл 1x PBS в каждую лунку для всех разведениях (10 ^-1 до 10 ^-6) этого образца. Для "антитоксина скважин" добавить 20 мкл 1x антитоксина в каждую лунку для всех разведениях (10 ^-1 до 10 ⁶⁾ этого образца.
   4. Передача 20 мкл разведенной пробы в скважинах с DP № 1 в указанных скважинах на ДП № 2 для строк 1 - 6 и 7 рядов - 12 (см DP # 2 расположение на листе Vero Cell). Смешайте раствор осторожно пипеткой вверх и вниз.
   5. Накройте DP # 2 с прозрачной пластиковой липкой печатью и позволяют 40 мин инкубации при комнатной температуре. Это Инкубационный позволить Антитоксин связывать и , таким образом , инактивировать и нейтрализовать токсин C. несговорчивый.
   6. После инкубации добавляют 10 мкл смеси из DP # 2 в соответствующие ячейки скважин Vero (см Vero клеточной пластинки расположение на Vэро Cell Рабочий лист). Аккуратно перемешать раствор с помощью пипетки вверх и вниз, следя за тем, чтобы не нарушить клетки Vero, которые прилипают к нижней поверхности лунки.
   7. Инкубируйте клеточной пластинки Vero в течение ночи в инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 ° С и 5% СО _2.
8. Оценка Vero клеток для Округление с помощью светового микроскопа (день 2)
   Примечание: Напомним , что изменения коэффициента разбавления в 10 раз при добавлении образца смеси к клеточной пластинки Веро (например, 10 ^-3 теперь 10 ^-4). Скважины, которые имеют антитоксина настоящий должны иметь практически нет клеток округлением Vero отметил. Клеточная округление Vero (цитотоксичность) будут отмечены в образцах, содержащих токсин C.difficile , . Если цитотоксическую активность нейтрализуется в разведении , содержащей образец и антитоксина, присутствие токсина C.difficile , что приводит к клеточной цитотоксичности Vero подтверждается.
   1. Изучение клеток для закругления Vero с использованием LIGHт микроскопом при увеличении 200X. Для получения образцов скважин ( в том числе положительный контроль), запишите разбавление скважины , которая является последним , чтобы иметь 80% Vero клеток округление отмечено.
   2. Вычислить титр цитотоксическое, который определяется как величина, обратная максимальному разведению, который произвел 80% Vero округление клеток на грамм образца. Например, если наибольшее разведение составляет 10 ^-5, то коэффициент разбавления будет 10 ^-6 для этого образца. Таким образом, журнал [окончательный коэффициент разбавления] / г образца будет войти [10 ^6], что дает ответную титр 6.
      Примечание: Vero клетки должны пройти не менее 3 - 4 переносов и не более 30 -го пассажа перед их использованием в этом анализе ^26.

Результаты

В ходе репрезентативного исследования, 5-недельных мышей C57BL / 6 мышей WT подвергают предварительной обработке с цефоперазона в питьевой воде (0,5 мг / мл) в течение 5 дней и давали 2-дневный промывать с регулярной питьевой водой. Мышей заражали 10 ⁵ спор C. несговорчив?...

Обсуждение

This protocol characterizes the clinical course, including weight loss, bacterial colonization, toxin cytotoxicity, and histopathological changes in the gastrointestinal tract, of antibiotic-treated mice challenged with C. difficile R20291 spores. There are several critical steps within the protocol where attention to detail is essential. Accurate calculation of the C. difficile spore inoculum is critical. This calculation is based on the original C. difficile spore stock enumeration, which sho...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
#62 Perisept Sporidicial Disinfectant Cleaner	SSS Navigator	48027	This product will require dilution as recommended by the manufacturer
0.22 μm filter	Fisherbrand	09-720-3	Alternative to filter plate for indivdiual samples tested in the Vero Cell Assay
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
0.4% Trypan Blue	Gibco	15250-061
1% Peniciilin/Streptomycin	Gibco	15070-063
10% heat inactivated FBS	Gibco	16140-071	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
1 ml plastic syringe	BD Medical Supplies	309628
1x PBS	Gibco	10010-023
2 ml Micro Centrifuge Screw Cap	Corning	430917
96 well cell culture flat bottom plate	Costar Corning	CL3595
96 well filter plate	Millipore	MSGVS2210
Adhesive Seal	ThermoScientific	AB-0558
Bacto Agar	Becton Dickinson	214010	Part of TCCFA plates (see below)
Bacto Proteose Peptone	Becton Dickinson	211684	Part of TCCFA plates (see below)
Cefoperazone	MP Bioworks	199695
Cefoxitine	Sigma	C47856	Part of TCCFA plates (see below)
Clostridium difficile Antitoxin Kit	Tech Labs	T5000	Used as control for Vero Cell Assay
Clostridium difficile Toxin A	List Biological Labs	152C	Positive control for Vero Cell Assay
D-cycloserine	Sigma	C6880	Part of TCCFA plates (see below)
Distilled Water	Gibco	15230
DMEM 1x Media	Gibco	11965-092	Needs to be heated in water bath at 37 °C prior to use
Fructose	Fisher	L95500	Part of TCCFA plates (see below)
Hemocytometer	Bright-Line, Sigma	Z359629
KH2PO4	Fisher	P285-500	Part of TCCFA plates (see below)
MgSO4 (anhydrous)	Sigma	M2643	Part of TCCFA plates (see below)
Millex-GS 0.22 μm filter	Millex-GS	SLGS033SS	Filter for TCCFA plates
Na2HPO4	Sigma	S-0876	Part of TCCFA plates (see below)
NaCl	Fisher	S640-3	Part of TCCFA plates (see below)
Number 10 disposable scalpel blade	Miltex, Inc	4-410
PCR Plates	Fisherbrand	14230244
Plastic petri dish	Kord-Valmark Brand	2900
Sterile plastic L-shaped cell spreader	Fisherbrand	14-665-230
Syringe Stepper	Dymax Corporation	T15469
Taurocholate	Sigma	T4009	Part of TCCFA plates (see below)
Ultrapure distilled water	Invitrogen	10977-015
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	664	Mice should be 5 - 8 weeks of age
Olympus BX43F light microscope	Olympus Life Science
DP27 camera	Olympus Life Science
cellSens Dimension software	Olympus Life Science