JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

Аннотация

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.

To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer.

In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions.

We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer2.

The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.

The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Введение

Photodynamic therapy (PDT) is composed of three major factors: photosensitizers, light, and oxygen. PDT is reported as a promising treatment for various cancers3. When the photosensitizers are administered into the cancer patient, they selectively accumulate in the tumor tissues. When the proper wavelength of light is applied, the highly reactive singlet oxygen and other free radicals lead to tumor cell damage4.

Lung cancer was introduced as one of the first applications for PDT in the early 1980s5. PDT provides several advantages in treating lung cancer. Since PDT is a non-invasive and non-surgical treatment, it is an attractive alternative choice for the patients in whom surgical resection is inappropriate.

There have been many challenges to enhance the cancer-targeting efficacy of the photosensitizers. Increasing photosensitizer accumulation in cancer sites and decreasing accumulation in normal tissues are the identical goals for the cancer-targeting studies. A variety of targeted drug delivery systems, such as polymers, liposomes, and nanoparticles are adopted as photosensitizer carriers6-8. In our previous studies, nanoparticles effectively increased the cancer-targeting abilities of the photosensitizers9,10. Nanoparticles are ideal cancer-targeting carriers since they possess both passive and active targeting abilities. The leaky tumor vessels provide opportunity for nano-sized carriers to accumulate easily in tumors, which is well-known as the enhanced permeability and retention (EPR) effect11,12. The interaction between the nanoparticles and the specific receptors on cancer cells enables active cancer targeting. In this study, we prepared hyaluronic acid-based nanoparticles to interact with CD44, the major hyaluronic acid receptor that is overexpressed on lung cancer cells13.

To maximize the anticancer efficacy, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may permit an increased therapeutic effect. Furthermore, decreased doses of both the photosensitizer and the anticancer drug can diminish adverse effects. We selected hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in the present study. HB is isolated from Chinese medicinal fungus Hypocrella bambuase. Shang et al. reported that HB-based PDT possesses a higher anticancer efficacy when compared to hematoporphyrin derivative-based PDT1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for various cancers, including lung cancer2.

Herein, we compared the anticancer efficacies of photosensitizer (hypocrellin B, HB) solution, photosensitizer-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Примечание: Все протоколы исследования на животных были одобрены Institutional Animal Care и использование комитета Сеульского национального университета Бунданг больницы (BA1308-134 / 072-01) путем.

1. Синтез Гиалуроновая кислота-церамид (HACE)

  1. Солюбилизации 12,21 ммоль гиалуроновой кислоты (HA) олигомера и 9,77 ммоль тетра- н гидроксида -butylammonium (ТБА) в 60 мл бидистиллированной воды (DDW). Смесь перемешивают в течение 30 мин.
  2. Для синтеза DS-Y30 линкер, растворите 8,59 ммоль DS-Y30 керамиды и 9.45 ммоль триэтиламина в 25 мл тетрагидрофурана (ТГФ). Смешать с 8,59 ммоль хлорида 4-chloromethylbenzoyl в ТГФ. Смесь перемешивают в течение 6 ч при 60 ° С.
  3. Растворите синтезированного 8,10 ммоль-ТВА и 0,41 ммоль DS-Y30 компоновщика в смеси ТГФ и ацетонитрила (4: 1, об / об). Перемешивают в течение 5 часов при 40 ° С.
  4. Удаление примесей путем фильтрации с агентом фильтра, и устранить органический растворитель испарением в вакууме. Очищают продукт с применением диализной мембраны (молекулярная масса отсечки: 3,5 кДа) и лиофильной сушке.

2. Подготовка Наночастицы

  1. Растворите 1 мг НВ и 1 мг паклитаксела в 0,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и смешивают с 0,5 мл DDW вихрем смешивания в течение 5 мин. Затем, солюбилизации HACE в этой смеси с помощью вихревого перемешивания в течение еще 5 мин.
  2. Для устранения растворителя при нагревании при 70 ° С в течение 4 ч при слабом токе газообразного азота.
  3. Ресуспендируют пленки, состоящей из HACE, HB и паклитаксел с 1 мл DDW. Фильтр с шприцевой фильтр (размер пор 0,45 мкм), чтобы удалить неинкапсулированной наркотики.

3. In Vitro фототоксичности

  1. Усвоение наночастиц в линиях клеток рака легких
    1. Подготовка среды RPMI-1640, содержащих 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и 1% (вес / об) пенициллин-стрептомицина.
    2. Семенной клеток А549 в 24-луночные планшеты для культивирования клеток при плотности 1 × 10 5 клеток / лунку (трехкратном повторе для каждогогруппа). Инкубируют в течение 24 ч при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО 2 воздуха и 95%.
    3. После прикрепления клеток, удаления среды и промыть клетки путем добавления 1 мл фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    4. Растворите наночастиц в PBS до конечной концентрации 2 мкМ / мл НВ. Затем, инкубировать клетки с 1 мл PBS, пустых NPs, HB-NPs или HB-P-NPs в каждую лунку в течение 4 часов в темноте.
    5. Удалить весь раствор и промыть клетки путем добавления 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз. Добавить свежую культуральную среду.
  2. Жизнеспособность клеток для анализа
    1. Поместите культуральный планшет под волокном PDT (с 1 см расстояния от волокна до PDT скважины). Носите лазерные защитные очки и освещают клетки с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) в темноте в течение различных периодов времени: 0, 5, 10, 20, 30 и 40 сек (0, 2, 4 , 8, 12, и 16 Дж / см 2). Затем, инкубировать клетки в течение 24 ч в темноте.
    2. Аспирируйте средних и мыть клетки, добавляя 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз.
    3. Добавьте 10 мкл цитотоксичность мерного раствора в каждую лунку. Инкубируют в темноте в течение 2 часов.
    4. Измеряют поглощение при 450 нм с использованием микропланшет-ридера.
  3. Микроскопический анализ
    1. Поместите культуральный планшет под волокном PDT (с 1 см расстояния от волокна до PDT скважины). Носите лазерные защитные очки и освещают клетки с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) в темноте при 0, 20 или 40 сек (0, 8, или 16 Дж / см 2). Затем, инкубировать клетки в течение 24 ч в темноте.
    2. Аспирируйте средних и мыть клетки, добавляя 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз.
    3. Добавляют 50 мкл аннексина V-FITC и 50 мкл 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 1,5 мкг / мл). Слегка встряхните планшет и инкубируйте его в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте.
      Примечание: Используйте аннексина V-FIТС из комплекта флуоресцентного микроскопа.
    4. Промывают клетки путем добавления 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз. Держите клетки в свежей PBS. Определение апоптоза клеток с помощью световой микроскопии при 100-кратном увеличении.
  4. сортировка флуоресценция активированных клеток (FACS) анализ
    1. Поместите культуральный планшет под волокном PDT (с 1 см расстояния от волокна до PDT скважины). Носите лазерные защитные очки и освещают клетки с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) при 0, 20 или 40 сек (0, 8, или 16 Дж / см 2). Затем, инкубировать клетки в течение 24 ч в темноте.
    2. Аспирируйте средних и мыть клетки, добавляя 1 мл холодного PBS. Повторите этап промывки еще раз.
    3. Ресуспендируют клеток в 1 мл 1 × буфера для связывания (развести 1 часть 10 - кратного буфера для связывания, 0,1 М HEPES / NaOH (рН 7,4), 1,4 М NaCl и 25 мМ CaCl 2 до 9 частей дистиллированной воды) и передачи в количестве 100 мкл раствора образца до 5-млкультура трубки.
    4. Добавьте 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл пропидийиодидом (PI). Аккуратно вихревой трубки и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) в темноте. Добавить 400 мкл 1 × буфера для связывания.
      Примечание: Используйте аннексина V-FITC и PI из комплекта флуоресцентного микроскопа.
    5. Определение апоптотических клеток с помощью FACS 14. Лазерные возбуждения линии ПИ и аннексина V-FITC являются 488 нм и 635 нм соответственно. Измерение флуоресценции PI и аннексина V-FITC при 610 ± 20 нм и 660 ± 20 нм, соответственно. Собрать полученные клетки на цитометр потока на 10000 событий.

4. В естественных условиях противораковый эффективность в опухоли мышей

  1. Рак легких индуцированных модель мыши
    1. Готовят 1 × 10 6 клеток A549 в 0,1 мл среды RPMI-1640; держать его на льду.
    2. Обезболить мышей с IP-инъекции ксилазина и смеси tiletamine и zolazepam (1: 2, 1 мл /кг). Подтвердите надлежащее обезболивание, осторожно щипать небольшой складки кожи мыши. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
      Примечание: Если не наблюдается никакого движения, животное достаточно наркозом, чтобы начать эксперименты.
    3. Вводят клетки подкожно в левый фланги BALB / C мужской голых мышей (6 - 7 недель, 20 - 22 г).
    4. Продолжайте наблюдать мышей, пока они не начинают двигаться по клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое перенес операцию на компании других животных, пока он не полностью восстановилась. Держите мышей под конкретного патогена (SPF) условиях.
    5. Измерьте размер опухоли циркулем каждый день. Рассчитать объем опухоли (мм 3), (длина × ширина 2) / 2. Когда размер опухоли достигает приблизительно 200 мм 3 по объему, начать эксперимент.
  2. Исследование эффективности противоопухолевых
    1. Случайным образом разделить мышей на 4 группы (n = 10 в каждой группе).
    2. Обезболить мышей с IP-инъекции ксилазина и смеси tiletamine и zolazepam (1: 2, 1 мл / кг). Подтвердите надлежащее обезболивание, осторожно щипать небольшой складки кожи мыши. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
      Примечание: Если не наблюдается никакого движения, животное достаточно наркозом, чтобы начать эксперименты.
    3. Растворите наночастиц в PBS до конечной концентрации 2 мг / мл НВ. Вводят PBS, свободный HB, HB-NPS или HB-P-NPS через хвостовую вену (2 мг / кг в качестве HB) дважды в дни 0 и 7.
    4. Продолжайте наблюдать мышей, пока они не начинают двигаться по клетке.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое не прооперированы в компании других животных до полноговыздоровел. Держите клетки темные и при определенных условиях SPF.
    5. 24 ч после каждой инъекции, анестезию мышей с IP-инъекции ксилазина и смеси tiletamine и zolazepam (1: 2, 1 мл / кг). Подтвердите надлежащее обезболивание, осторожно щипать небольшой складки кожи мыши. Используйте ветеринара мазь для глаз, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
      Примечание: Если не наблюдается никакого движения, животное достаточно наркозом, чтобы начать эксперименты.
    6. Поместите сайт опухоли под волокна PDT (с 1 см расстояния от волокна до ФДТ опухоли). Носите очки лазерной безопасности, выключите выключатель, и осветить опухоль с помощью лазера PDT (630 нм, 400 мВт / см 2) в течение 500 сек (200 Дж / см 2) дважды в дни 1 и 8.
    7. Продолжайте наблюдать мышей, пока они не начинают двигаться по клетке. Не оставляйте животное без присмотра, пока он не пришел в сознание достаточное для поддержания грудины лежачее. Не возвращать животное, которое имеет undergonе хирургии в компании других животных, пока полностью не выздоровел.
    8. Держите клетки в условиях SPF. Поддерживать клетки в темноте в течение 24 ч после лазерной обработки.
    9. Визуально контролировать объем опухоли и изменения в опухоли ежедневно. Измерьте размер опухоли с суппортами, и рассчитать объем , как и (длина × ширина 2) / 2 (мм 3). Сфотографируйте опухолевых сайтов каждый день, чтобы проверить наличие поверхностных опухолей изменений после ФДТ.
    10. На 16-й день, пожертвовать пять мышей в группе терминальными анестезии с использованием изофлуран.
    11. С помощью пинцета и ножниц, вырезать наружную оболочку и подвергать опухоли 15. Осторожно собрать их. Закрепить их в 10% раствор формалина, встраивать их в парафин, и окрашивают их гематоксилином и эозином (H & E) для гистологического анализа 16.
    12. Через 45 дней мониторинга, пожертвуйте оставшихся мышей терминальными анестезии с использованием изофлуран.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы подготовили как HB-NPS и HB-P-NPS с методами, упомянутыми выше. Средние диаметры HB-NPs и HB-P-NPs были 220,9 ± 3,2 нм и 211,9 ± 1,6 нм, соответственно.

Жизнеспособность клеток в клетках А549 после 4 ч инкубации с PBS, пустыми NPs, HB-NPs и HB-P-NPs с последующим облучен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Самым важным шагом в данном исследовании, заключается в выборе правильных лазерных условий: длины волны, мощности и времени облучения. Надлежащая длина волны света, подходящей для конкретного фотосенсибилизатора необходимо для ФДТ. Мы использовали 630-нм лазер , который был подходящим ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Это исследование было поддержано грант №. 14-2014-017 из Фонда SNUBH Research.

Авторы признательны Дж Патрик Баррон, почетный профессор Токийского медицинского университета и адъюнкт - профессор Сеульского национального университета Бунданг больницы для его про боно редактирование этой рукописи.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
oligo hyaluronic acidBioland Co., Ltd._
DS-Y30 (ceramide 3B; mainly N-oleoyl-phytosphingosine)Doosan Biotech Co., Ltd._
adipic acid dihydrazideSigma AldrichA0638
N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimideSigma Aldrich39391
4-(chloromethyl)benzoyl chlorideSigma Aldrich270784
Tween 80Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.T0546
syringe filterSartorius Stedim Biotech GmbH1776215 mm, RC, PP, 0.45 µm
triethylamineSigma AldrichT0886
Mini-GeBAflex tubesGene Bio-Application Ltd.D070-12-100
PaclitaxelTaihua Corporations_
RPMI-1640Gibco Life Technologies, Inc.11875
Penicillin–streptomycinGibco Life Technologies, Inc.15070
Fetal bovine serumGibco Life Technologies, Inc.16140071
Celite (Filter agent)Sigma Aldrich6858See step 1.4

Ссылки

  1. Shang, L., Zhou, N., Gu, Y., Liu, F., Zeng, J. Comparative study on killing effect of esophageal cancer cell line between hypocrellin B-photodynamic therapy and hematoporphyrin derivative-photodynamic therapy. Chin J Cancer Prev Treat. 12, 1139-1142 (2005).
  2. Huisman, C., et al. Paclitaxel triggers cell death primarily via caspase-independent routes in the non-small cell lung cancer cell line NCI-H460. Clin Cancer Res. 8 (2), 596-606 (2002).
  3. Dolmans, D. E., Fukumura, D., Jain, R. K. Photodynamic therapy for cancer. Nat Rev Cancer. 3 (5), 380-387 (2003).
  4. Pass, H. I. Photodynamic therapy in oncology: mechanisms and clinical use. J Natl Cancer Inst. 85 (6), 443-456 (1993).
  5. Sutedja, T. G., Postmus, P. E. Photodynamic therapy in lung cancer. A review . J. Photochem. Photobiol. 36 (2), 199-204 (1996).
  6. Peng, C. L., Shieh, M. J., Tsai, M. H., Chang, C. C., Lai, P. S. Self-assembled star-shaped chlorin-core poly(epsilon-caprolactone)-poly(ethylene glycol) diblock copolymer micelles for dual chemo-photodynamic therapies. Biomaterials. 29 (26), 3599-3608 (2008).
  7. Chen, B., Pogue, B. W., Hasan, T. Liposomal delivery of photosensitising agents. Expert Opin Drug Deliv. 2 (3), 477-487 (2005).
  8. Lee, S. J., et al. Comparative study of photosensitizer loaded and conjugated glycol chitosan nanoparticles for cancer therapy. J Control Release. 152 (1), 21-29 (2011).
  9. Chang, J. E., et al. Anticancer efficacy of photodynamic therapy with hematoporphyrin-modified, doxorubicin-loaded nanoparticles in liver cancer. J. Photochem. Photobiol. 140, 49-56 (2014).
  10. Chang, J. E., Cho, H. J., Yi, E., Kim, D. D., Jheon, S. Hypocrellin B and paclitaxel-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles for targeted photodynamic therapy in lung cancer. J. Photochem. Photobiol. 158, 113-121 (2016).
  11. Wang, A. Z., Langer, R., Farokhzad, O. C. Nanoparticle delivery of cancer drugs. Annu. Rev. Med. 63, 185-198 (2012).
  12. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  13. Penno, M. B., et al. Expression of CD44 in human lung tumors. Cancer Res. 54 (5), 1381-1387 (1994).
  14. Wilkins, R., Kutzner, B., Truong, M., Sanchez-Dardon, J., McLean, J. Analysis of radiation-induced apoptosis in human lymphocytes: Flow cytometry using Annexin V and propidium iodide versus the neutral comet assay. Cytometry. 48 (1), 14-19 (2002).
  15. Bannas, P., et al. Validation of nanobody and antibody based in vivo tumor xenograft NIRF-imaging experiments in mice using ex vivo flow cytometry and microscopy. J Vis Exp. (98), e52462(2015).
  16. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).
  17. Lam, S. Photodynamic therapy of lung cancer. Semin Oncol. 21 (6 Suppl 15), 15-19 (1994).
  18. Simone, C. B. 2nd, et al. Photodynamic therapy for the treatment of non-small cell lung cancer. J Thorac Dis. 4 (1), 63-75 (2012).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Cancer Research118Nanoparticle549BALB C Nude Mouse

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены