JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Mechanical stress can induce the chondrogenic differentiation of stem cells, providing a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. We present a protocol to induce the chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells (ASCs) using centrifugal gravity (CG). CG-induced upregulation of SOX9 results in the development of chondrogenic phenotypes.

Аннотация

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes differentiated from stem cells using cytokines. Unfortunately, cytokine-induced chondrogenic differentiation is costly, time-consuming, and associated with a high risk of contamination during in vitro differentiation. However, biomechanical stimuli also serve as crucial regulatory factors for chondrogenesis. For example, mechanical stress can induce chondrogenic differentiation of stem cells, suggesting a potential therapeutic approach for the repair of impaired cartilage. In this study, we demonstrated that centrifugal gravity (CG, 2,400 × g), a mechanical stress easily applied by centrifugation, induced the upregulation of sex determining region Y (SRY)-box 9 (SOX9) in adipose-derived stem cells (ASCs), causing them to express chondrogenic phenotypes. The centrifuged ASCs expressed higher levels of chondrogenic differentiation markers, such as aggrecan (ACAN), collagen type 2 alpha 1 (COL2A1), and collagen type 1 (COL1), but lower levels of collagen type 10 (COL10), a marker of hypertrophic chondrocytes. In addition, chondrogenic aggregate formation, a prerequisite for chondrogenesis, was observed in centrifuged ASCs.

Введение

Дефекты в суставном хряще не заживают естественным образом. Следовательно, трансплантации стволовых клеток была предложена в качестве перспективного подхода для ремонта нарушенного хряща. Тем не менее, этот метод требует как приобретение достаточного количества стволовых клеток и индукции этих клеток к дифференцировке хондрогенное. Костный мозг (ВМ) широко используется в качестве источника стволовых клеток, но изоляция клеток из ВМ имеет два основных недостатка: инвазивность и недостаточная урожайность. Из-за своей легкости приобретения, жировая ткань является предпочтительным источником стволовых клеток. Предыдущие исследования показали возможность выделения стволовых клеток из жировой ткани и вызывая хондрогенное дифференцировки в этих клетках с использованием цитокинов, таких как TGF & beta ; 1-1, 2. Эти методы являются эффективными, но дорогими.

В качестве альтернативы меньшей стоимости на цитокины, механическое напряжение, может быть использован дляиндуцируют хондрогенный дифференциации. Механическая нагрузка играет важную роль в поддержании здоровья суставном хряще 3, и это может вызвать хондрогенное фенотипы в различных клетках. Например, гидростатическое давление вызывает хондрогенное фенотипы в синовиальной оболочке , полученных клеток - предшественников с помощью МАР - киназы / JNK пути 4, и механическое сжатие вызывает хондрогенез в человеческих мезенхимальных стволовых клеток (МСК) с помощью повышающей регуляции генов chondrocytic 5. Кроме того, напряжение сдвига способствует экспрессии хондрогенезе связанных с внеклеточным матриксом (ECM) в человеческих ПКЦ 6. Центробежная сила тяжести (CG), легко наносится и под контролем механического напряжения генерируется путем центрифугирования, может вызывать дифференциальную экспрессию генов в клетках 7. Например, в клетках карциномы эпителия легких, экспрессия интерлейкина (IL) -1B позитивно регулируется с помощью центрифугирования 8. Therefore, как экспериментально индуцибельной механических напряжений, CG может быть использован для индукции chondrocytic экспрессии генов в стволовых клетках. Тем не менее, остается неясным, может ли CG вызвать хондрогенный дифференцировки стволовых клеток.

В этом исследовании мы обнаружили, что CG индуцирует повышающую регуляцию SOX9, мастер-регулятор хондрогенезе, в человеческих ИСС, что приводит к избыточной экспрессии генов chondrocytic. Кроме того, мы сравнили эффекты CG на хондрогенезе с теми TGF- 1, фактор роста наиболее часто используется , чтобы вызвать в пробирке хондрогенез в стволовых клетках.

протокол

Этот протокол исследования был одобрен этическими комитетами католического университета Кореи (KC16EAME0162) и осуществляется в соответствии с руководящими принципами NIH. Все ткани были получены с письменного информированного согласия.

1. Центробежные силы тяжести Загрузка и пеллетах Культура

  1. Клеточные культуры и урожай
    1. Культура ИСС (Р2-Р3, см список материалов) в модифицированной среде низкой глюкозы Дульбекко Eagle (DMEM-LG), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S) при 37 ° C в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    2. Когда клетки достигают 80% сплошности, отбрасывать среды и промыть клетки с 5 мл 1х фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
    3. Добавить 1 мл PBS , содержащего 1 мМ ЭДТА и инкубировать в течение 2 мин при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    4. Нажмите на культуральную пластину осторожно, добавить 4 мл свежей среды, передают клеткамконическая трубка 15-мл, и центрифуга клетки при 250 х г в течение 2 мин при комнатной температуре (RT).
  2. Центробежная сила тяжести нагрузки
    1. После центрифугирования (этап 1.1.4), удалить супернатант, не нарушая гранул и ресуспендируют осадок в 10 мл DMEM-LG с добавлением 10% FBS. Граф клеток с использованием гемоцитометра.
    2. Для CG нагрузки, передача 2,5 × 10 5 клеток в новую коническую пробирку и центрифугировать 15 мл при 2400 х г в течение 15 мин.
  3. Пелле культура
    1. Сразу же после центрифугирования, аспирация супернатант и добавляют 500 мкл определенной среде хондрогенный дифференцировки (МЧР, DMEM с высоким глюкозы с добавлением 1% FBS, 1% ITS + премикс, 100 нМ дексаметазона, 1x MEM несущественные аминокислотного раствора, 50 мкг / мл L-пролина, и 1% пенициллина / стрептомицина). Добавить 50 мкг / мл свежеприготовленного L-аскорбиновой кислоты 2-фосфата при каждой смены среды. В качестве положительного контроля, вызывают хондрогенный differentiatiна в uncentrifuged клетках путем добавления МЧР, содержащий 10 нг / мл TGF- 1.
    2. Поместите неполностью закрываютс крышкой , пробирки , содержащие гранулы в стоячем положении и инкубировать при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    3. Изменение носителя через день в течение 3-х недель.
  4. Micromass культура
    1. Сразу же после центрифугирования (этап 1.2.2; 2400 & bull; g в течение 15 мин), аспирата супернатант и ресуспендируют осадок в 10 мкл МЧР.
    2. Чтобы сформировать Micromass, поместите ресуспензированной клетки в центре лунки 24-луночного планшета.
    3. Через 2 ч, осторожно добавляют 1 мл CDM к колодцу, пипеткой к стенке пластины, чтобы избежать срыве Micromass. В качестве положительного контроля, выполнить Micromass культуру с uncentrifuged клеток путем добавления CDM, содержащий 10 нг / мл TGF- 1.
    4. Выдержите Micromass при 37 ° С в увлажненном инкубаторе , содержащем 5% CO 2.
    5. Изменение среды эвERy день в течение 3-х недель.

2. обратной транскриптазы-полимеразной цепной реакции (RT-PCR) для обнаружения транскрипционные повышающую регуляцию хондрогенный Дифференциация Маркеры

  1. На 14-й день, используйте пипетку для переноса сфероидами гранул в новую 1,5-мл пробирку и промойте их в 1x PBS.
  2. Извлечение общей РНК из гранул с использованием гуанидина тиоцианата-фенол-хлороформ метод 9 экстракции.
  3. Синтеза кДНК из 2 мкг тотальной РНК с использованием обратной транскриптазы в соответствии с протоколом производителя (инкубировать при 42 ° С в течение 1 ч, а затем инактивации фермента при температуре 70 ° С в течение 5 мин).
  4. Выполните ПЦР с использованием праймеров , специфичных для хондрогенными маркеров дифференцировки 10.

3. Окрашивание для обнаружения сверхэкспрессии хондрогенный Дифференциация маркерных белков

  1. Парафин-встраивание гранулы клеток
    1. На 21-й день,использовать пипетку для сбора сфероидами гранул и мыть их с 1x PBS.
    2. Закрепить сфероидами гранул путем погружения в 4% параформальдегида в течение 24 ч.
      Внимание: параформальдегид очень токсичен. Избегать попадания в глаза, на кожу или слизистые оболочки. Сведение к минимуму воздействия и избегать вдыхания во время приготовления. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
    3. Выбросьте закрепитель и промыть гранулы клеток деионизированной водой (DW).
    4. Поместите один слой марли на кассету и передавать неподвижные гранулы с помощью пипетки. Покрытие гранул путем складывания марлю и закройте крышку кассеты.
    5. Высушить гранул.
      1. Погружают гранулы в 70% этаноле (EtOH) в течение 5 мин при комнатной температуре.
      2. Погружают гранул в 80% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
      3. Погружают гранул в 95% этанола в течение 5 мин при комнатной температуре.
      4. Погружают гранул в 100% EtOH в течение 5 мин при комнатной температуре. Повторите дважды.
      5. Погружают гранул в 100% ксилола в течение 15 мин при комнатной температуре. Повторить Twiсе.
    6. Встраивание фиксированных гранул клеток в парафин при температуре 56 ° С в пресс-форме; гранулы могут быть встроены в парафин с использованием специализированных систем автоматизированной обработки тканей.
    7. Вырезать 5 мкм срезы толщиной от залитой в парафин клеточного осадка с помощью роторного микротома.
    8. Поплавок секции в 50% этанола, а затем передавать их на водяной бане при 50 ° C с использованием слайд.
    9. Поместите плавающие разделы на слайдах.
  2. Safranin O и Альциановый голубое окрашивание
    1. Увлажняет секции парафина.
      1. Погрузите слайды в ксилоле в течение 15 мин. Повторите дважды.
      2. Погрузитесь слайдов в 100% EtOH в течение 5 мин. Повторите дважды.
      3. Погрузитесь слайдов в 90% этанола в течение 5 мин.
      4. Погрузитесь слайдов в 80% этанола в течение 5 мин.
      5. Погрузитесь слайдов в 70% этанола в течение 5 минут, а затем промойте их в 1x PBS.
    2. Пятно регидрировали секций с 1% -ным раствором Safranin O и 3% Альциановый синий для30 минут.
    3. Выбросьте окрашивание раствора и промойте участки с DW.
    4. Пятно секции с раствором гематоксилин / эозином (контрастное) в течение 1 мин.
    5. Выбросьте окрашивание раствора и промойте участки с DW.
    6. Поместите каплю монтажа среды на покровным после удаления остаточной воды. Осторожно поместите слайд (ячейка стороной вниз) на покровное содержащей монтажную среду.
    7. Разрешить слайды высохнуть в течение 2-3 ч при комнатной температуре.
    8. Захват изображений с использованием светлого поля микроскопа (автоматизированный прямой микроскоп, 50X и 200X).
  3. иммунофлюоресценции
    1. Увлажняет секции, как описано в разделе 3.2.1.
    2. Погрузитесь слайдов в цитрат натрия буфера (10 мМ цитрат натрия, 0,05% Tween 20, рН 6,0), а затем поддерживать их при температуре к югу от кипячения в течение 10 минут с использованием микроволновой печи.
    3. Охладить слайды в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем промойте их с водопроводной водой.
    4. Инкубируйте слайды в 3%H 2 O 2 (в 1X PBS) в течение 15 мин, а затем промыть их проточной водой в течение 15 мин 11.
    5. Блок слайды с блокирующим буфером (10% нормальной козьей сыворотки в PBS) в течение 1 ч.
    6. Аспирируйте блокирующий раствор, а затем применить первичное антитело, разбавленное с 5% нормальной козьей сыворотки на слайдах.
    7. Инкубируйте слайды в течение ночи при температуре 4 ° С.
    8. Вымойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут каждый.
    9. Инкубируйте слайдов в флюорохром-конъюгированные вторичного антитела, разбавленного 5% нормальной козьей сывороткой в ​​течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
    10. Вымойте слайды три раза в 1x PBS в течение 5 минут каждый в темноте.
    11. Инкубируйте слайдов с использованием DAPI (1 мкг / мл) в течение 10 мин, а затем промыть их два раза в 1X PBS в течение 5 мин каждый.
    12. Поместите каплю монтажа среды на покровным после удаления остаточной воды. Осторожно поместите слайд (ячейка стороной вниз) на монтажной среде.
    13. Разрешить слайды высохнуть в течение 2-3ч в темноте при комнатной температуре.
    14. Визуализируйте слайды с помощью флуоресцентной микроскопии (Rhod: 594 нм, DAPI: 340 нм; 60X и 200X увеличение) 12.

Результаты

Центробежная сила тяжести вызывает избыточную экспрессию хондрогенными маркеров дифференцировки в жировой ткани стволовых клеток.

Для того, чтобы определить степень центробежной силы тяжести, которая является подходящей для индук?...

Обсуждение

Стволовости состояние клеток является очень важным для CG-индуцированной избыточной экспрессии SOX9. В нашем исследовании, экспрессия SOX9 может быть вызвано CG в начале пассажей ИСС (2-3), но не позже пассажей ИСС. Сообщалось , что, во время культивирования, ИСС не содержат CD34 + клеток до 3 -х про...

Раскрытие информации

We declare that we have no conflicts of interest associated with this work.

Благодарности

This research was supported by a grant of the Korea Health Technology R&D Project through the Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), funded by the Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (grant number: HI14C2116) and by Research Fund of Seoul St. Mary's Hospital, The Catholic University of Korea.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Plasticware
100 mm DishTPP93100
60 mm DishTPP93060
50 mL Cornical TubeSPL50050
15 mL Cornical TubeSPL50015
10 mL Disposable PipetteFalcon7551
5 mL Disposable PipetteFalcon7543
ASC Culture Media Materials
DPBSLife Technologies14190-144
DMEM Low glucoseLife Technologies11885-084growth base media
Penicilin StreptomycinSigma AldrichP43331%
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000-04410%
PBS/1 mM EDTALife Technologies12604-039
Chondrogenic Differentiation Media Materials
DMEM High glucoseLife Technologies11995chondrogenic differentiation base media
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Life Technologies11140-050
DexamethasoneSigma AldrichD2915100 nM
Penicilin StreptomycinLife TechnologiesP43331%
Fetal Bovine SerumLife Technologies16000-0441%
Ascorbate-2-phosphateSigma AldrichA896050 μg/mL
L-prolineSigma AldrichP560750 μg/mL
ITSBD3543521%
Human TGFβ1Peprotech100-2110 ng/mL
Materials
18 mm Cover GlassSuperiorHSU-0111580
4% ParaformaldyhydeTech & InnovationBPP-9004
Tween 20BIOSESANGT1027
Bovine Serum AlbuminVector LabSP-5050
Anti-Collagen II antibodyabcam ab347121:100
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugateMolecular ProbeA-110371:200
DAPIMolecular ProbeD1306
Prolong gold antifade reagentInvitrogenP36934
Slide Glass, CoatedHyun Il Lab-MateHMA-S9914
TrizolInvitrogen15596-018
ChloroformSigma Aldrich366919
IsoprypylalcoholMillipore109634
EthanolDuksan64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kitThermo ScientficK1622
i-Taq DNA PolymeraseiNtRON BIOTECH25021
UltraPure 10x TBE BufferLife Technologies15581-044
loading starDyne BioA750
AgaroseSigma-Aldrich9012-36-6
1 kb (+) DNA ladder markerEnzynomicsDM003
Human adipose-derived stem cells (ASCs)Catholic MASTER Cells

Ссылки

  1. Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells. Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).
  2. Erickson, G. R., et al. Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).
  3. Sah, R. L., et al. Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression. J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).
  4. Sakao, K., et al. Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure. Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).
  5. Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress. Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).
  6. Alves da Silva, M. L., et al. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).
  7. Maeda, S., et al. Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress. Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).
  8. Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression. Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).
  9. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).
  10. Lorenz, T. C. Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies. J Vis Exp. (63), e3998 (2012).
  11. Jang, Y., et al. UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways. J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).
  12. Wu, Y. L., et al. Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths. J Cell Sci. 119, 2797-2806 (2006).
  13. Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. Regulation of the chondrogenic phenotype in culture. Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).
  14. Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6. Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).
  15. Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene. Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).
  16. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).
  17. Chen, J., et al. Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds. Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).
  18. Janzen, V., et al. Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a. Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).
  19. Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model. J Cell Sci. 113, 1161-1166 (2000).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

120SOX9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены