JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает генерацию мышиных опухолей цистопластики у самок C57BL / 6J и мониторинг роста опухоли.

Аннотация

Этот протокол описывает генерацию опухолей мочевого пузыря у самок C57BL / 6J мышей с использованием мышиных клеток рака мочевого пузыря линии MB49, который был модифицирован секретируют человеческого простат-специфического антигена (ПСА), а также порядок подтверждения имплантации опухоли. Короче говоря, мышей анестезируют с помощью инъекционных препаратов и сделаны лежать в положении лежа на спине. Моча освобождено из мочевого пузыря и 50 мкл поли-L-лизин (PLL) медленно закапывают со скоростью 10 мкл / 20 с помощью катетера 24 G IV. Он остается в мочевом пузыре в течение 20 мин с помощью укупоривая катетера. Катетер удаляют и ФАПЧ освобождаемые мягкое давление на мочевой пузырь. За этим следует закапывания мышиной линии клеток рака мочевого пузыря (1 х 10 5 клеток / 50 мкл) со скоростью 10 мкл / 20 с. Катетер закупоривают для предотвращения преждевременной эвакуации. Через 1 ч мышей возродил с лекарственным средством реверсирования, и мочевой пузырь освобождается. Медленная скорость закапывания важно,так как это уменьшает пузырно-мочеточниковый рефлюкс, который может вызывать опухоли происходить в верхних мочевых путей и в почках. Клеточная линия должна быть хорошо ресуспендировали уменьшить слипание клеток, так как это может привести к неравномерному размеров опухоли после имплантации.

Этот метод вызывает опухоли с высокой эффективностью. Рост опухоли контролировали секреции мочевой PSA. Мониторинг ПСА маркером является более надежным, чем ультразвук или флуоресцентных изображений для обнаружения присутствия опухолей в мочевом пузыре. Опухоли у мышей обычно достигают максимального размера, что негативно влияет на здоровье около 3 - 4 недель, если не лечить. Контролируя рост опухоли, можно дифференцировать мышей, которые были вылечены от тех, которые не были успешно имплантировали опухоли. Только с анализа конечной точки, последняя может быть ошибочно предполагается, что были вылечены с помощью терапии.

Введение

Цель этого метода заключается в создании мышиный Ортотопическая опухолей мочевого пузыря и следить за имплантированных опухолей настолько точно, насколько это возможно, так что у мышей без имплантации опухоли не думали, были вылечены при анализе конечной точки. В целом, способ, показанный уменьшит потребность в большом количестве мышей для экспериментального анализа и обеспечения большей точности при определении терапевтических результатов.

Развитие ортотопической модели рака важно, так как имплантировать опухолевые клетки подкожно не перепросматривать окружающую среду клинического заболевания или способствовать развитию терапевтических стратегий. Архитектура мочевого пузыря позволяет инстилляции рака мочевого пузыря терапии непосредственно в мочевой пузырь с минимальным количеством системных эффектов. Таким образом, животные модели, которые Повторим эту среду, такие как ортотопической, имеют важное значение для оценки новых методов лечения. Выводы, сделанные из любой экспериментальной установки являются dependenт при ограничениях модели.

Несколько методов было разработано для производства ортотопической опухолей мочевого пузыря у мышей. Они полагаются на повреждения гликозаминогликаны слой мочевого пузыря, что позволяет опухолевые клетки для имплантации. Методы , используемые включают электрокоагуляции, что приводит к одной точке повреждения в стенке мочевого пузыря, что приводит к развитию опухоли на одном участке в мочевом пузыре 1,2. Тем не менее, вероятность успеха имплантации опухоли с использованием электрокоагуляции является функция зависит от оператора колеблется от 10 - 90%, и она включает в себя опасность, что стенка мочевого пузыря будет пробита, что приводит к развитию опухолей, развивающихся в брюшной полости. Химическое прижигание осуществляется с использованием нитрата серебра, который повреждает мочевой пузырь стенки 3. Аналогичным образом , кислота использовалась , чтобы привести к повреждению стенки мочевого пузыря 4. Трипсин был также использован , чтобы повредить мочевой пузырь а также 5. Эти методы могут привести к развитию более чем одной опухолью в мочевом пузыре.Кроме того, существует опасность серьезного повреждения мочевого пузыря, если химические вещества остаются в контакте со стенкой мочевого пузыря слишком долго. Метод , разработанный Ninalga и др. использует положительно заряженный поли-L-лизин (PLL) 6 молекул обволакивать стенки мочевого пузыря; Это позволяет отрицательно заряженные опухолевые клетки, чтобы прилипнуть к гликозаминогликанов слоя мочевого пузыря. Этот метод обычно приводит к более чем одной опухолью , развивающейся в мочевом пузыре, но имплантации опухоли на 80 - 100% 4,7. С технической точки зрения это также самый простой процедуры для выполнения. Для того, чтобы гарантировать, что опухоли, которые развиваются достаточно даже по размеру, важно, что опухолевые клетки не группируются в крупных комков перед имплантацией.

Для оценки терапевтической эффективности, то лучше всего выполнить это исследование на мышах с довольно аналогичного размера опухолей. Таким образом, хорошая система обнаружения, которая может количественно оценить размер опухоли вскоре после имплантации имеет важное значение. Существует несколько стратегий имеют пчелыN используется для оценки опухоли. Они включают в себя магнитно - резонансной томографии (МРТ) 8-10, флуоресценцию 11, биолюминесценции 12,13, ультразвук 14 и иммуноферментного анализа (ИФА) 15,16. В то время как МРТ и УЗИ не требуют модификации опухолевых клеток, существует необходимость в чувствительной аппаратуры и контрастных агентов для МРТ. В флуоресцентные-,-люминесцентных и ELISA-анализы, основанные требуют модификации опухолевых клеток, чтобы выразить маркерные белки, которые могут быть обнаружены с помощью этих методов. Для люминесценции, подложка необходима для обнаружения активности люциферазы; Таким образом, есть дополнительный шаг, и увеличение стоимости. Оба люминесценции и флуоресценции требуют специального оборудования. Для получения флуоресценции, зеленый флуоресцентный белок (GFP), циклизации, которая катализирует молекулярным кислородом, требуется. Таким образом, выражение GFP может быть переменной в пределах массы опухоли в зависимости от доступа кислорода, что делает это довольно ненадежным маркером 17. Модификация мышиной линии клеток рака мочевого пузыря MB49 секретируют человеческого простат - специфического антигена (ПСА) 15,16 в качестве суррогатного маркера является другая стратегия. Эти маркеры также обеспечивают альтернативные средства, подтверждающие наличие опухоли при завершении эксперимента, что делает их альтернативу иммуногистохимии. Это исследование сообщает метод ФАПЧ имплантации ортотопической опухоли и представляет сравнение систем обнаружения опухолей, а именно ELISA, флуоресценция, и ультразвуковой визуализации.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все животное работа придерживается руководящих принципов Institutional Animal Care и использование комитета (IACUC) по использованию животных и обработки (номер протокола 084/12) в Национальном университете Сингапура.

1. Рост MB49-PSA клеток Эрлиха и измерение PSA Секретирование

  1. Поддержание мышиного рака мочевого пузыря клетки MB49-PSA 15 в полном Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) , дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 ммоль / л L-глутамина, и 0,05 мг / мл пенициллина-стрептомицина в термостате при температуре 37 ° С и 5% СО 2. Добавить 200 мкг / мл гигромицину B для поддержания давления отбора PSA-секретирующих клеток.
  2. Для определения секреции PSA, пластина 1 х 10 6 клеток в культуре пластины 6-луночного и инкубировать при 37 ° С в присутствии 5% СО 2 в течение 48 ч.
  3. Через два дня, собирают супернатант для определения уровня ПСА.
    1. С помощью пипетки Пастера, перенесите вирernatant в 15 мл центрифужную пробирку.
    2. Центрифуга в течение 5 мин при 250 мкг для удаления плавающих клеток и мусора. Если анализ ПСА проводится в другой день, хранить супернатант при - 30 ° С в 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Если нет, переходите к следующему шагу немедленно.
    3. Определить концентрацию PSA с использованием человеческого свободных PSA ELISA набор 7.
  4. Перечислим высевания клеток.
    1. С помощью пипетки Пастера, промыть клетки осторожно с 1 мл DMEM. Отберите и полностью удалить средства массовой информации.
    2. Добавить 1 мл свежей среды, и осторожно соскрести с клеточным скребком, чтобы вытеснить клетки из колодца.
    3. Передача клетки микроцентрифужных трубки и повторно приостанавливать их тщательно, чтобы обеспечить одной клеточной суспензии.
    4. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и 0,4% -ным раствором трипанового синего. Подсчитывают живые клетки (которые не занимают красителя) с использованием гемоцитометра.
  5. Вычислить выражение PSA в нгПСА / мл среды / 10 6 клеток. Выражение PSA клеток MB49-PSA для имплантации у мышей составляет 80 - 120 нг / мл / 10 6 клеток.

2. Определение чувствительности измерений ПСА с помощью ELISA и анализа в реальном времени ПЦР

  1. Пластина клеток MB49-PSA в полной среды DMEM в культуральной пластины 6-луночного с различными количествами родительских клеток MB49 таким образом, что существует не более 1 × 10 6 клеток на лунку (т.е., 10 0, 10 1, 10 2, 10 3, 10 4, 10 5 и 10 6 клеток MB49-PSA культивируют 10 6, 10 5, 10 4, 10 3, 10 2, 10 1, 10 или 0 MB49 клетки, соответственно).
  2. Через день, собирают супернатант для определения уровня ПСА, как описано в пункте 1.3. Определить концентрацию PSA с использованием человеческого свободных PSA ELISA набор 7.
  3. Извлечение РНК из клеток.
    1. лизироватьклетки непосредственно в пластине путем добавления 1 мл реагента для экстракции РНК.
    2. Выдержите в течение 5 мин при комнатной температуре и переносят Клеточный лизат в микроцентрифужных трубки. Добавить 0,2 мл хлороформа и вихревые образцы энергично в течение 15 с. Выдержите их в течение 3 мин при комнатной температуре.
    3. Центрифуга образцов при 12000 х г в течение 15 мин при температуре 4 ° С. Аккуратно перенести верхнюю водную фазу (0,5 мл) в чистую пробирку, не нарушая интерфазе.
    4. Добавить 0,5 мл изопропилового спирта. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Центрифуга образцов при 12000 х г в течение 10 мин при температуре 4 ° С. Удалить супернатант полностью, не тревожа осадок РНК в нижней части трубы.
    5. Промыть гранулу один раз с помощью 1 мл 75% -ного этанола. Центрифуга при 7500 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить весь этанол и позволяют гранулы высохнуть на воздухе в течение 10 мин.
    6. Развести РНК в 30 мкл нуклеазы без воды. Выдержите в течение 5 мин при 60 ° С, чтобы увеличить такlubility.
    7. Количественной оценки РНК путем измерения оптической плотности с использованием ультрафиолетового (УФ) спектроскопии при 260 нм (А260). Для оценки чистоты РНК, измеряют поглощение при 280 нм (А280) и вычислить отношение A260 / A280, которое должно быть выше 1,6.
  4. Реверс-транскрибировать кДНК из 2 мкг РНК.
    1. Готовят реакционную смесь на лед и перенести его на 0,2 мл пробирки.
    2. Кратко центрифуге трубки, чтобы спина вниз содержимое и устранить пузырьки воздуха.
    3. Загрузить пробирки в амплификатор и выполнить обратную транскрипцию при следующих условиях: 60 мин при 37 ° С, а затем 5 мин при 95 ° С. После того, как бег завершается, сохранить образцы кДНК при температуре 4 ° С.
    4. Храните образцы при температуре - 30 ° С в течение длительного хранения.
  5. Выполнение в режиме реального времени ПЦР-анализа для PSA и цитоплазматический бета-актина. Бета-актин используется для нормализации образцов. Выполнение анализа на 100 нг обратной транскрипции РНК в PLA 96-луночногот.е. Пробирной все образцы в трех экземплярах. Выполните 40 циклов со следующими параметрами: 2 мин при 50 ° С, 10 мин при 95 ° С, 15 с при 95 ° С для денатурации и 1 мин при 60 ° C. Установить нижний предел обнаружения при порога цикла (КТ) 35; Таким образом, любой образец со значением CT за 35 считается не обнаружено.

3. Поддержание туморогенности клеточной линии MB49-PSA

Примечание: продолженный рост в пробирке приводит к потере туморогенности. Для поддержания онкогенность, клеточная линия MB49-ПСА пассировать через мышь по крайней мере один раз в 2 года.

  1. Клетки.
    1. Урожай экспоненциально растущих клеток, очищая их осторожно стерильный клеточным скребком. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и 0,4% -ным раствором трипанового синего. Количество живых клеток с использованием гемоцитометра. Не имплантировать, если более 20% клеток мертвы.
    2. Подсчитайте количество живых клеток требуется (1 х 107 клеток / мл) и передавать их на 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Повторное приостановить осадок клеток в DMEM пустой носитель. Повторите для стирки три раза, чтобы удалить все следы FBS до имплантации.
    3. Держите клеточной суспензии на льду, пока мыши не будут готовы к имплантации.
  2. Имплантат опухолевых клеток подкожно у мышей на спинном фланге.
    1. Обезболить длиной от 4 до 6-недельного возраста C57BL6 / J мышь, используя смесь кетамина анестетиков и медетомидин (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно) вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
    2. Бритье правый фланг, чтобы разоблачить кожу.
    3. Используя пару щипцов, поднимите кожу , чтобы отделить его от подлежащей мышцы и вводят по 0,1 мл суспензии клеток (1 × 10 6 клеток) подкожно иглой 24 G. При удалении иглы, зажать место инъекции в течение 5 до 10 с, так что опухолевые клетки делаютне истекают из места инъекции.
    4. Возроди мышь с подкожной инъекции атипамезола (1 мг / кг) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
  3. Монитор роста опухоли каждые два дня путем измерения диаметра опухоли с использованием калибров. Объем опухоли рассчитывали по формуле V = (AB 2) / 2, где "а" самый длинный размер и "б" перпендикуляр ширина, как в мм.
  4. Когда объем опухоли составляет по меньшей мере 50 мм 3 (примерно 7 дней), эвтаназии мышь с CO 2. Акцизный опухолевой массы с парой стерильных пинцетов и ножниц в асептических условиях и поместить в DMEM.
  5. В культуральный планшет 6-луночный, фарша опухоль на мелкие кусочки с помощью стерильных скальпелей. С помощью 1 мл шприца в качестве "пестик" для дальнейшей дезагрегации опухоли.
  6. Добавьте 3 мл полной среды DMEM и поддержания клеток в инкубаторе при температуре 37 ° С и 5% СО 2.
  7. После того, как клетки придерживаться Platе (от одного до двух дней), удалите средства массовой информации, мусор и, не прилипшие клетки аспирационных осторожно стерильной пипетки Пастера. Промыть дважды с DMEM. Будьте осторожны, чтобы не беспокоить клетки.
  8. Добавить 1 мл DMEM и сбора клеток путем соскабливания их с клеточным скребком. Для выбора и расширения отдельных колоний, подсчет клеток с помощью гемоцитометра и пластины 1 клетка на лунку в культуральной пластины с 96-луночного. Культуры клеток в DMEM с 200 мкг / мл гигромицина при 37 ° С и 5% CO 2.
  9. Изменение средств массовой информации и антибиотик каждые 4 - 5 дней. Монитор клетки, пока они не находятся на уровне 80-90% сплошности. Re-пластины клетки на 24-луночный планшет для культивирования с помощью пипетки вытеснить клетки из колодца.
  10. После того, как клетки в культуральную пластину 24-луночного являются сливающийся, смещать их путем соскоба с клеточным скребком и пластинчатые их в культуральный планшет 6-луночного.
  11. Экран различные клоны для секреции PSA, как описано в шаге 1. Крио-сохранить клон с самым высоким PSA секретиона и использовать его для будущих экспериментов мыши.

4. Имплантация Опухоль

Примечание: Каждая мыши имплантируют с 1 × 10 5 клеток MB49-PSA в 50 мкл DMEM пустой носитель в мочевом пузыре. Из-за мертвого пространства в катетере, всегда готовят дополнительный объем (по крайней мере, в количестве 100 мкл на мышь дополнительных). Альтернативный подход будет использовать воздух , наполненный шприц , как описано Касману и др. 5 , а не заполненный шприц.

  1. Клетки.
    1. За один день до имплантации, когда клетки примерно 80% сплошности, пассаж MB49-PSA опухолевые клетки в полной среде DMEM среде (с добавлением 10% FBS, 2 ммоль / л L-глутамина, 0,05 мг / мл пенициллина-стрептомицина, и 200 мкг / мл гигромицину в) при 37 ° с и 5% сО 2 при соотношении разделенного 1: 2.
    2. В день процедуры, сбора клеток путем соскабливания их осторожно стерильный клеточным скребком. Смешайте равные объемы клеточной суспензии и0,4% трипанового синего раствора. Количество живых клеток с использованием гемоцитометра. Не имплантировать, если более 20% клеток мертвы.
    3. Подсчитайте количество живых клеток требуется (2 × 10 6 клеток / мл) и передавать их на 15 мл центрифужную пробирку. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин при 4 ° С и отбросить супернатант. Повторное приостановить осадок клеток в DMEM пустой носитель. Повторите для стирки три раза, чтобы удалить все следы FBS до имплантации.
    4. Держите клеточной суспензии на льду, пока мыши не будут готовы к имплантации.
  2. Дайте 4- до 6-недельного возраста самка C57BL / 6J мышей акклиматизации в течение одной недели до процедуры. Все животное работы должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности для поддержания стерильных условий.
    1. Взвесить каждую мышь и вводят анестезию (75 мг / кг кетамина и 1 мг / кг медетомидин) внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела. Массой тела должна составлять от 17 до 22 г. Подтвердите обезболивание путем наблюдения не не RESPONSE после схождения крайнем случае.
    2. Для идентификации, отметьте ухо с помощью ушного удар.
    3. Вводят раствор или соединение натрия лактат Гартмана внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела каждые 1 - 2 ч для гидратации.
    4. Нанесите мазь стерильной глазной для обоих глаз с использованием стерильного ватный шарик, так как моргание рефлекс теряется под наркозом и глаза высыхают. Повторное применение в случае необходимости.
    5. Положите мышей в положении лежа на спине на бумажные полотенца на верхней части теплового пакета (активируется при контакте с воздухом) для поддержания температуры тела и ленты задние ноги вниз.
  3. С помощью пальца нанесите мягкое давление на нижней области живота и сбора мочи из мочевого пузыря в микроцентрифужных пробирку 1,5 мл. Этот пример служит базисной величины мочевого ПСА.
  4. Вывод стерильную поли-L-лизин (PLL) в 1 мл шприц и прикрепить внутривенный катетер 24 калибра, с иглой стилет удалены. Нанесите смазку на кончике катетера и иновERT катетер через уретру в мочевой пузырь с помощью щипцов для руководства катетеризацию. Остановитесь, когда ощущается сопротивление. Примечание: Исследователи должны обсудить с их ветеринарным персоналом о необходимости использования смазочной гель с анестетиком для внутрипузырные инстилляции и использования после процедуры анальгетиков.
  5. Закапывание 50 мкл ФАПЧ медленно, со скоростью 10 мкл каждые 20 секунд, чтобы избежать пузырно-мочеточниковый рефлюкс 18. Оставьте катетер в мочевом пузыре в течение 20 мин с пробкой для предотвращения выхода потока.
  6. Через 20 минут удалите катетер и освободить мочевой пузырь любого содержания, слегка нажав на нижнюю область живота. С помощью пустого шприца емкостью 1 мл, промойте все оставшиеся содержимое из катетера.
  7. Смешайте клетки MB49-PSA тщательно пипеткой и вывести их в 1 мл шприц. Прикрепите катетер и нанесите смазку. Закапывание 50 мкл 1 × 10 5 клеток с медленной скоростью 10 мкл каждые 20 сек. Заменить пробку накатетер. Дайте мышей контрольной группы по 50 мкл физиологического раствора.
  8. Через 1 ч, удалите катетеры и освободить мочевой пузырь любого содержимого. Удалите ленту на задних лапах и поместите мышей на их вентральной сторон. Возродить мышей подкожно инъекционного препарата реверсирования (1 мг / кг атипамезола) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
  9. Монитор мышей, пока не наблюдается моторики. Возвращение мышей в их клетки.
  10. После завершения протокола обнаружения опухоли (разделы 5, 7 или 8), усыпить мышей использованием CO 2. Обнаружение опухоли Посмертное описано в разделе 6.

5. Мониторинг роста опухоли с ELISA

Примечание: наличие опухоли и рост контролируется у мышей путем измерения секреции ПСА в моче. Исследователи должны проконсультироваться со своим ветеринарным персоналом по мониторингу состояния здоровья животных и благополучия имплантации после опухоли и гуманные конечные точки.

  1. Есть два метода для сбора мочи у мышей.
    1. Сбор мочи в течение ночи, помещая одну мышь в индивидуальной метаболическую клетку предназначенной для отделения мочи от фекального материала. Если установка не имеет охлаждение, добавить ингибитор протеазы (100 мкл) в пробирку для сбора мочи, чтобы предотвратить деградацию PSA в течение ночи. Тем не менее, количество доступных метаболические клетки ограничивает полезность этого метода сбора мочи.
    2. Там, где это технически невозможно использовать клетей метаболические (например, в ABSL2 комнатах), собирают мочу пятна с помощью пальца, чтобы оказывать давление на нежную нижней абдоминальной области в то время как мыши под наркозом, как описано в шаге 4.2.1. Обычно это делается до того, как терапия закапывают. По нашему опыту, по крайней мере, 150 мкл мочи можно собрать через 1 ч после анестезии.
  2. Немедленно поместите собранную мочу на льду. Гематурия может быть виден со второй недели после имплантации опухоли. Высоко гемолизированные образцы могут повлиять на анализ ELISA. Поэтому, мочадолжны быть размещены на льду и обрабатываются быстро после сбора.
  3. Центрифуга трубки мочи при 6700 х г в течение 5 мин при 4 ° С для удаления клеток и мусора.
  4. Для того, чтобы нормализовать разницу в диуреза между мышами, аликвоты мочи в новые пробирки и хранить их при температуре -30 ° C до выполнения анализов для PSA с использованием набора ELISA 7 и креатинин с использованием набора для анализа 7. Даже если мыши не производят PSA, существует низкий уровень неспецифического связывания обнаруженных с помощью ELISA. Для образцов , чтобы считать положительным, порог должен быть установлен при значениях больше , чем у нормальных мышей + 3 стандартных отклонений (SD) 15.

6. Определение Опухоль присутствия с ПЦР в реальном времени

  1. По окончании, рассекают брюшную полость мыши и найдите мочевого пузыря. Акцизный мочевого пузыря и поместите его в криопробирку. Замораживание немедленно в жидком азоте.
  2. Извлечение РНК гомогенизацией ткани в РНК ЕхПИДействие реагента.
  3. Выполнение обратной транскрипции и ПЦР в реальном времени анализ ПСА, как описано выше в разделе 2.

7. Мониторинг роста опухоли с флуоресцентной томографии

  1. Добавьте 1 х 10 7 MB49-PSA клетки с ближней инфракрасной флуоресцентного красителя 19.
  2. Re-пластины и урожай меченых клеток на дни 4, 7, 11, 14, 18, и 21 , чтобы проверить , если клетки сохраняют жизнеспособность и флуоресценции с помощью проточной цитометрии 20.
  3. Имплантат меченые клетки MB49-PSA у мышей пузырями, как описано выше в разделе 4.
  4. Мониторинг роста опухоли с использованием системы флуоресценции изображений каждые два дня.
  5. В день обработки изображений, взвешивают и анестезию мышей с использованием смеси кетамина анестетиков и медетомидин (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно) вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
  6. Бритье области живота, чтобы подвергать кожу.
  7. Место мышей в камере формирования изображения и приобрестиИзображения баллонах с использованием программного обеспечения, поставляемого с системой визуализации.
  8. Возродить мышей подкожно инъекционные развороту препарата (1 мг / кг атипамезола) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.

8. Мониторинг роста опухоли с Высокочастотный ультразвуковой визуализации

  1. Имплантаты опухоли у мышей, как описано выше в разделе 4.
  2. Каждые два дня, контролировать рост опухоли с помощью ультразвуковой визуализации.
  3. В день обработки изображений, взвешивают и анестезию мышей с использованием смеси кетамина анестетиков и медетомидин (75 мг / кг и 1 мг / кг, соответственно) вводили внутрибрюшинно в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.
  4. Бритье области живота, чтобы подвергать кожу.
  5. Привить 100 мкл стерильного 0,9% физиологического раствора в мочевой пузырь с помощью внутривенного катетера 24 калибра. Солевой будет растягиваться мочевого пузыря и улучшают видимость во время ультразвуковой визуализации.
  6. Поместите мышь на ультразвуковой платформе и применять токопроводящий гель для лАуэр живота.
  7. Опустить карманный зонда к коже и приобрести в В-режиме изображения мочевого пузыря на платформе 21 формирования изображения.
  8. Возродить мышей подкожно препарата реверсирования инъекционного (1 мг / кг Атипамезол) в количестве 0,1 мл на 10 г веса тела.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

было обнаружено секреции PSA из клеток MB49 изменяется в зависимости от питательной среды. MB49-PSA выращивают в DMEM средах , так как это приводит к увеличению секреции PSA (рис 1А). Для того, чтобы определить чувствительность к PSA ELISA и ПЦР в реальном времени, различные чи...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Наиболее важные шаги в протоколе: 1) успешно поддерживая туморогенности клеточной линии; 2) обеспечение секреции измеримое ПСА до имплантации опухолевых клеток у мышей; 3) получение суспензии одноклеточных для имплантации так, чтобы уменьшить изменение размера опухоли; и 4) прививать кл?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

This work was funded by a grant from the National Medical Research Council of Singapore (NMRC/CIRG/1335/2012) awarded to Professor Kesavan Esuvaranathan.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
MB49-PSA cellsN/AN/Aref (Wu QH, 2004)
RPMI 1640 mediaHyCloneSH30027.01 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) mediaBiowestL0102
Fetal Bovine Serum (FBS) South AmericanBiowestS1810
Fetal Bovine Serum (FBS) South American, PremiumBiowestS181B
Fetal Bovine Serum (FBS)HyCloneSH30088.03 
L-glutamineBiowestX0550
Penicillin-StreptomycinBiowestL0022
Hygromycin BInvitrogen10687-010
free PSA (Human) ELISA kitAbnovaKA0209
TRIzol Reagent for RNA extraction Ambion15596026
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase InhibitorApplied Biosystems4374967
TaqMan Universal PCR Master MixApplied Biosystems4304437
TaqMan Gene Expression Assay – Mouse ActbApplied Biosystems4331182Mm00607939_s1
TaqMan Gene Expression Assay – Human KLK3Applied Biosystems4331182Hs00426859_g1
C57BL/6J female miceIn Vivos4 - 6 wk old
Anesthesia (75 mg/kg Ketamine and 1 mg/kg Medetomidine)Local pharmacy
Reversal drug (1 mg/kg Atipamezole)Local pharmacy
Ear punchElectron Microscopy Sciences72893-01
Hartmann's solution or Compound sodium lactateB Braun
Ophthalmic ointment - Duratears sterile ocular lubricant ointmentAlcon
Heat pack - HotHands handwarmersHeatmax Inc
Introcan Certo IV catheterB Braun425130024 G x 3/4″
Aquagel Lubricating jellyLocal pharmacy
Poly-L-lysine solution, 0.01%,SigmaP4707
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailRoche4693159001
Quantichrom Creatinine Assay KitBioAssay SystemsDICT-50 
Fluorescent dye - VivoTrack 680Perkin ElmerNEV12000 
RNAlater-ICE Frozen Tissue Transition SolutionAmbion4427575
NameCompanyCatalog numberComments
Equipment and Software
7500 Realtime PCR SystemApplied Biosystems
7500 Software v2.3Applied Biosystems
Metabolic CageTecniplast Vertical type rack for 12 cages
BD FACSCanto I system BD Biosciences
BD FACSDiva software v7BD Biosciences
IVIS SpectrumCT in vivo imaging system Caliper Life Sciences 
Living Image Software v3.1Caliper Life Sciences 
Vevo 2100 imaging system VisualSonics 

Ссылки

  1. Gunther, J. H., et al. Optimizing syngeneic orthotopic murine bladder cancer (MB49). Cancer Res. 59, 2834-2837 (1999).
  2. Dobek, G. L., Godbey, W. T. An orthotopic model of murine bladder cancer. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).
  3. Chade, D. C., et al. Histopathological characterization of a syngeneic orthotopic murine bladder cancer model. Int Braz J Urol. 34, 220-226 (2008).
  4. Chan, E. S., et al. Optimizing orthotopic bladder tumor implantation in a syngeneic mouse model. J Urol. 182, 2926-2931 (2009).
  5. Kasman, L., Voelkel-Johnson, C. An orthotopic bladder cancer model for gene delivery studies. Journal of visualized experiments : JoVE. , e50181(2013).
  6. Ninalga, C., Loskog, A., Klevenfeldt, M., Essand, M., Totterman, T. H. CpG oligonucleotide therapy cures subcutaneous and orthotopic tumors and evokes protective immunity in murine bladder cancer. J Immunother. 28, 20-27 (2005).
  7. Tham, S. M., Ng, K. H., Pook, S. H., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Tumor and Microenvironment Modification during Progression of Murine Orthotopic Bladder Cancer. Clin Dev Immunol. , 865684(2011).
  8. Chin, J., Kadhim, S., Garcia, B., Kim, Y. S., Karlik, S. Magnetic resonance imaging for detecting and treatment monitoring of orthotopic murine bladder tumor implants. J Urol. 145, 1297-1301 (1991).
  9. Kikuchi, E., et al. Detection and quantitative analysis of early stage orthotopic murine bladder tumor using in vivo magnetic resonance imaging. J Urol. 170, 1375-1378 (2003).
  10. Sweeney, S. K., Luo, Y., O'Donnell, M. A., Assouline, J. Nanotechnology and cancer: improving real-time monitoring and staging of bladder cancer with multimodal mesoporous silica nanoparticles. Cancer nanotechnology. 7, 3(2016).
  11. Tanaka, M., et al. Noninvasive detection of bladder cancer in an orthotopic murine model with green fluorescence protein cytology. J Urol. 170, 975-978 (2003).
  12. Jurczok, A., Fornara, P., Soling, A. Bioluminescence imaging to monitor bladder cancer cell adhesion in vivo: a new approach to optimize a syngeneic, orthotopic, murine bladder cancer model. BJU Int. 101, 120-124 (2008).
  13. Newton, M. R., et al. Anti-interleukin-10R1 monoclonal antibody in combination with bacillus Calmette--Guerin is protective against bladder cancer metastasis in a murine orthotopic tumour model and demonstrates systemic specific anti-tumour immunity. Clin Exp Immunol. 177, 261-268 (2014).
  14. Patel, A. R., et al. Transabdominal micro-ultrasound imaging of bladder cancer in a mouse model: a validation study. Urology. 75, 799-804 (2010).
  15. Wu, Q., Esuvaranathan, K., Mahendran, R. Monitoring the response of orthotopic bladder tumors to granulocyte macrophage colony-stimulating factor therapy using the prostate-specific antigen gene as a reporter. Clin Cancer Res. 10, 6977-6984 (2004).
  16. Luo, Y., Chen, X., O'Donnell, M. A. Use of prostate specific antigen to measure bladder tumor growth in a mouse orthotopic model. J Urol. 172, 2414-2420 (2004).
  17. Coralli, C., Cemazar, M., Kanthou, C., Tozer, G. M., Dachs, G. U. Limitations of the reporter green fluorescent protein under simulated tumor conditions. Cancer Res. 61, 4784-4790 (2001).
  18. Biot, C., et al. Preexisting BCG-specific T cells improve intravesical immunotherapy for bladder cancer. Sci Transl Med. 4 (137), 137ra172(2012).
  19. Swirski, F. K., et al. A near-infrared cell tracker reagent for multiscopic in vivo imaging and quantification of leukocyte immune responses. PLoS One. 2, 1075(2007).
  20. Jozwicki, W., Brozyna, A. A., Siekiera, J., Slominski, A. T. Frequency of CD4+CD25+Foxp3+ cells in peripheral blood in relation to urinary bladder cancer malignancy indicators before and after surgical removal. Oncotarget. , (2016).
  21. Walk, E. L., McLaughlin, S. L., Weed, S. A. High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes. J Vis Exp. , e52718(2015).
  22. Rooks, V., Beecken, W. D., Iordanescu, I., Taylor, G. A. Sonographic evaluation of orthotopic bladder tumors in mice treated with TNP-470, an angiogenic inhibitor. Academic radiology. 8, 121-127 (2001).
  23. Folin, O., Morris, J. L. On the determination of creatinine and creatine in urine. JBC. 17, 469-473 (1914).
  24. Dykman, L. A., Bogatyrev, V. A., Khlebtsov, B. N., Khlebtsov, N. G. A protein assay based on colloidal gold conjugates with trypsin. Anal Biochem. 341, 16-21 (2005).
  25. Shi, H. W., et al. Joint enhancement strategy applied in ECL biosensor based on closed bipolar electrodes for the detection of PSA. Talanta. 154, 169-174 (2016).
  26. Ma, H., et al. Electrochemiluminescent immunosensing of prostate-specific antigen based on silver nanoparticles-doped Pb (II) metal-organic framework. Biosensors & bioelectronics. 79, 379-385 (2016).
  27. Kavosi, B., Salimi, A., Hallaj, R., Moradi, F. Ultrasensitive electrochemical immunosensor for PSA biomarker detection in prostate cancer cells using gold nanoparticles/PAMAM dendrimer loaded with enzyme linked aptamer as integrated triple signal amplification strategy. Biosensors & bioelectronics. 74, 915-923 (2015).
  28. Lu, Y., et al. Cross-species comparison of orthologous gene expression in human bladder cancer and carcinogen-induced rodent models. Am J Transl Res. 3, 8-27 (2010).
  29. Gong, Z., et al. Establishment of a Novel Bladder Cancer Xenograft Model in Humanized Immunodeficient Mice. Cellular physiology and biochemistry : international journal of experimental cellular physiology, biochemistry, and pharmacology. 37, 1355-1368 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Cancer Research119

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены