Количественное Бактериальный гистидинкиназа Автофосфорилирование Использование Nitrocellulose Анализ на связывание

Резюме

We report and demonstrate an optimized nitrocellulose binding assay that can be used to quantify autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Our method has several advantages over traditional SDS-PAGE based techniques, providing a valuable alternative for characterizing these important proteins.

Аннотация

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their involvement in two-component signal transduction, a ubiquitous system through which bacteria sense and respond to environmental stimuli. Two-component signaling features autophosphorylation of a histidine kinase, followed by phosphotransfer to the receiver domain of a response regulator protein, which ultimately leads to an output response. Autophosphorylation of the histidine kinase is responsive to the presence of a cognate environmental stimulus, thereby giving bacteria a means to detect and respond to changes in the environment. Despite their importance in bacterial biology, histidine kinases remain poorly understood due to the inherent lability of phosphohistidine. Conventional methods for studying these proteins, such as SDS-PAGE autoradiography, have significant shortcomings. We have developed a nitrocellulose binding assay that can be used to characterize histidine kinases. The protocol for this assay is simple and easy to execute. Our method is higher throughput, less time-consuming, and offers a greater dynamic range than SDS-PAGE autoradiography.

Введение

Адаптивная реакция имеет решающее значение для выживаемости бактерий. В целях выявления и реагирования на изменения в окружающей среде, бактерии используют систему стимула-отклика, известную как сигнализации двухкомпонентной. ^1,2 В типичной системе двухкомпонентной, гистидин - киназы обнаруживает родственным стимул, autophosphorylates его законсервированный остаток гистидина, а затем передает фосфат к консервативному остатка аспартата на области приемника белка регулятора ответа. ³ Это событие вызывает изменение активности регулятора ответа, который стимулирует нисходящую эффект. ^4,5 Таким образом, бактерии способны чувствовать и адаптироваться к изменениям в местной среде. Некоторые системы сигнализации двухкомпонентные отклоняются от этого архетипа. В некоторых случаях, сенсорная область гистидин-киназы представляет собой автономный белок, который непосредственно обнаруживает сенсорный вход и изменяет активность киназы посредством белок-белкового взаимодействия. ^{6 - 8} Тем не менее, фондamental процесса и в целом роль системы остается неизменной. Двухкомпонентный сигнализации является повсеместно распространенной системы стимул-отклик, который имеет важное значение для выживаемости бактерий, и гистидинкиназ играют критическую роль в трансдукции сигнала. ⁹

Несмотря на важность гистидинкиназ к бактериальной биологии, они остаются слабо охарактеризован. Это происходит из-за присущей нестабильности фосфогистидину, а также отсутствие практического метода для измерения аутофосфорилирование. Фосфогистидину более лабильны, чем фосфосерин, фосфотреонина и фосфотирозином. ¹⁰ Таким образом, методы, которые обычно используются для анализа Ser / Thr / Tyr киназ не применимы для гистидинкиназ. ¹¹ В пробирке анализы для изучения гистидинкиназ были в значительной степени ограничены SDS-PAGE авторадиографии. ^12,13 В этом методе [γ- ³² P] -АТФ инкубируют с киназой, и фосфорилирование киназы анализируют с помощью Polэлектрофорез yacrylamide гель (ПААГ) с последующим авторадиографии геля. Этот метод может быть использован для контроля киназы аутофосфорилирование, а также phosphotransfer от киназы к регулятору ответа. Тем не менее, этот метод имеет значительные недостатки. PAGE на основе анализы низкую пропускную способность и отнимает много времени. Такие ограничения не способствуют характеризации белка и его установления кинетических параметров. Альтернативный метод исследования гистидинкиназ, который был опубликован в последнее время использует фосфогистидину антитела для выявления аутофосфорилирование. ¹⁴ В то время как этот метод имеет то преимущество , что различие между 1-фосфогистидину и 3-фосфогистидину, в зависимости от используемой аппаратуры для обнаружения, этот метод не может предложить большой динамический диапазон или высокий верхний предел обнаружения. Таким образом, существует потребность в более короткой, менее трудоемким, и более чувствительного анализа, который может быть использован для изучения этих важных белков.

Здесь мы описываем и demonstrate тщательно разработанной нитроцеллюлозный анализа связывания , который может быть использован для количественного аутофосфорилирование очищенных бактериальных гистидинкиназ в пробирке. Этот анализ является более высокая пропускная способность и меньше времени, чем анализы, основанные на страницах. Метод также использует Черенкова для фосфогистидину количественной оценки, которая предлагает высокий верхний предел обнаружения и большим динамическим диапазоном. Анализ может быть использован для определения кинетических параметров гистидинкиназ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Внимание: Этот протокол требует соответствующей подготовки в области использования и обращения с радиоактивными материалами. Пожалуйста, используйте необходимые средства индивидуальной защиты при проведении этого анализа, в том числе бета-радиационной защиты. Радиоактивные отходы должны быть обработаны тщательно, поскольку образуются большие объемы отходов, во время промывки фазы эксперимента. Убедитесь в том, что отходы хранятся в вертикальном контейнере, таком как большое ведро или бутылку, которая не будет легко опрокинуть или разлитой. После того, как эксперимент будет заключен, тщательно передать все жидкие отходы, чтобы соответствующим образом маркированы контейнеров с радиоактивными отходами. Обращайтесь со всеми материалами с осторожностью, и держать счетчик Гейгера поблизости, чтобы контролировать рабочее пространство на предмет загрязнения.

Примечание: Этот протокол представляет собой пересмотренный вариант ранее сообщенным анализа из нашей группы. ¹⁵ Стабильность фосфогистидину в H ₃ PO ₄ должны быть испытаны для любого неохарактеризованной гистидинкиназа предшествующего уровня с использованием этого метода. Фосфогистидину улИспытание способности было описано ранее. ¹⁵ Отрицательный контроль , который не содержит киназы должны быть включены. Это необходимо для того , чтобы вычесть фоновый сигнал из каждого образца, а также обеспечить [γ- ³² P] -АТФ достаточно вымывают из мембраны.

1. Приготовление реагентов и материалов

1. Очищают гистидинкиназ из бактериальной культуры перед использованием этого анализа.
   1. Очищают с гистидинкиназа (ген ID 1189383) из Vibrio parahaemolyticus (EB101, АТСС 17802) для развития этого анализа. Клонирование киназы в выражение вектора пет-23aHis-ТРВ с использованием NdeI и сайты рестрикции XhoI и осуществлять сайт-направленного мутагенеза для получения мутантного построить Vp1876 D499A.
   2. Преобразование плазмиды в E.coli BL21 (DE3) pLysS, и роста клеток в ТБ средах при температуре 37 ° С. Внесение дополнительных культур с ампициллином (100 мкг / мл) и хлорамфеникол (34 мкг / мл), и расти при перемешивании(250 оборотов в минуту) до OD ₆₀₀ , равной 0,6.
   3. Индуцируют экспрессию белка с помощью IPTG до конечной концентрации 25 мкМ, и расти культур в течение ночи при 16 ° С. Урожай клеток путем центрифугирования (5000 XG), лизировать путем обработки ультразвуком и центрифугу для удаления клеточного мусора (18 000 XG).
   4. Очищают His-меченый киназы с использованием Ni-NTA агарозы. Подтвердить чистоту с помощью SDS-PAGE. Оптимизация очистки для каждого белка, и подтвердить чистоту перед использованием этого анализа.
2. Готовят 25 мМ H ₃ PO ₄ промывочного раствора. К 1 л дистиллированной деионизированной воды, добавляют H ₃ PO ₄ до конечной концентрации 25 мМ. Значение рН этого раствора составляет примерно 2,0. Поместите 25 мМ H ₃ PO ₄ на льду.
3. Подготовка 13x маточного раствора 325 мМ H ₃ PO _4, который будет использоваться для гашения киназной реакции. Значение рН этого раствора составляет примерно 1,5. Поместите 325 мМ H ₃ PO ₄ на льду.
   Примечание: H ₃ PO ₄ При конечной концентрации 25 мМ в достаточной степени гасит реакцию, а также помогает блокировать радиоактивно меченого фосфата, который не связан с гистидина от связывания с нитроцеллюлозные мембраны.
4. Приготовьте 4x реакционный буфер исходного раствора , содержащего 160 мМ Трис-HCl рН 8,0, 600 мМ KCl, 16 мМ MgCl _2, и 40% глицерина.
5. Количественно гистидин концентрации киназы методами установлено концентрации белка (Bradford, UV-Vis и т.д.). ^16,17 Подготовить гистидинкиназа раствора с концентрацией , которая в 4 раза желаемой конечной концентрации. Для того, чтобы получить адекватный сигнал, чтобы конечная концентрация белка в реакции в идеале должна быть не менее 5 мкМ.
6. Приготовьте 4x радиоактивно меченных [γ- ³² P] -АТФ раствора с соответствующей концентрации 4x немеченного ATP и меченым: немеченого отношение к эксперименту.
   Примечание: Количество [γ- ³² P] -АТФ , которые должны быть включены в эту смесь, зависит от того , насколько [^7; - ³² Р] -АТФ в конечном счете будет замечена для каждой реакции. Мы получили адекватный сигнал с конечной концентрации в диапазоне от 0,1 - 5 мкКи на реакцию. Важно, что меченый: немеченого отношение АТФ поддерживаться постоянным для всех реакций в данном эксперименте. Серийные разведения должны быть сделаны, когда несколько концентрации АТФ необходимо, так как это хорошо держать помеченный: немеченого постоянное соотношение АТФ во всех концентрациях. Конечные концентрации АТФ, как правило, в диапазоне от 10 мкм до по меньшей мере 1 мМ, и каждая концентрация должна быть проанализирована в трех повторностях для получения достоверных кинетических данных.
7. 96- хорошо дот-блот аппарат
   1. Вырезать 8 см х 12 см кусок нитроцеллюлозной мембраны (размер 0,2 мкм пор).
   2. Позиция нитроцеллюлоза в дот-блот аппарат, гарантируя, что мембрана подходит таким образом, что аппарат герметизируется, и все скважины полностью покрыты мембраной. Если собрана правильно, не должно быть никакой утечки воздуха, когда вакуум заявлСВУ.
   3. Для сбора фильтрата, подключите устройство к вторичной стороне рукавов колбу. Из штока клапана, соединить достаточное трубки таким образом, что устройство может быть удобно использовать без опрокидывания вторичной колбы.
   4. Подключение вторичной боковой рукоятки флягу к источнику аспиратор / вакуума.
   5. Проверьте, что устройство полностью герметична путем подачи вакуума к устройству. Если устройство правильно собран, сильный вакуум будет присутствовать во всех лунках. Все соединения труб могут быть завернуты в Parafilm или Саран завернуть, чтобы обеспечить герметичное уплотнение.
   6. По желанию, для проверки вакуума пипеткой по 100 мкл реакционного буфера в одну лунку. Вакуум должен быть достаточно сильным, чтобы сделать всю жидкость через скважину и на мембрану.
   7. Выключите вакуум, пока все образцы не будут готовы к пятнистый на мембране.

2. Реакция Инициирование и закалка

1. Смешивание компонентов реакции
   1. До INITIвания, подготовить все четыре компонента реакции , как 4x растворов: реакционного буфера (смотри раздел 1.4), гистидинкиназа (1.5) [гамма- ³² Р] -АТФ (1.6), и DDH ₂ O.
   2. Смешайте равные объемы реакционного буфера, гистидин - киназы, и DDH ₂ O. Разрешить эти компоненты реакции уравновешивают при комнатной температуре в течение короткого промежутка времени (10 мин).
      Примечание: Конечный объем реакционной смеси зависит от того, эксперимент зависит от времени, фермент-зависимого, или субстрат-зависимой. Зависимые от времени реакции должно быть больше, поскольку несколько аликвот взяты из той же реакции и гасили в желаемый момент времени. Объем реакционной смеси будет зависеть от количества точек требуемого времени. Анализ оптимизирован для каждого пятна на нитроцеллюлозную мембрану, чтобы содержать 30 мкл реакционной смеси. Таким образом, если 10 временных точек желательны, то объем реакционной смеси должна быть не менее 300 мкл (больший объем, такие, как 330 мкл было бы предпочтительным в случае каких-либо ошибок при использовании пипеток).Фермента и субстрата, зависящих от экспериментов требуют меньших реакционных объемов. Объем реакционной смеси для этих экспериментов могут быть как 30 мкл, поскольку это окончательный объем, который будет на нитроцеллюлозной мембране.
   3. Для инициирования реакции, добавьте один объем [γ- ³² P] -АТФ раствора к реакционной смеси и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. Трек истекшее время реакции с таймером и позволить реакции протекать в течение желаемого времени.
   4. Для гашения реакции, добавьте 1/13 от общего объема реакционной охлажденного льдом 325 мМ H ₃ PO ₄ к реакционной смеси и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз. В качестве альтернативы, добавьте аликвоты реакции до 325 мМ H ₃ PO _4.
      Примечание: конечная концентрация H ₃ PO ₄ должна составлять 25 мм , чтобы в достаточной степени гасят реакцию. Например, добавьте 2,5 мкл 325 мМ H ₃ PO ₄ до 30 мкл реакции, или добавить 30 мкл реакции до 2,5 мкл 325 мМ H ₃ PO <к югу> 4. Окончательное значение рН реакции составляет приблизительно 4,0. Такая концентрация H ₃ PO ₄ была проверена и подтверждена для гашения реакции киназы в этом буфере без ухудшения фосфогистидину.
      1. Например, смешать 7,5 мкл 4x реакционного буфера, 7,5 мкл 4x гистидинкиназа и 7,5 мкл DDH ₂ O. Инициирование реакции с 7,5 мкл [γ- ³² P] -АТФ. Реакцию гасят 2,5 мкл 325 мМ H ₃ PO _4.
   5. Сразу же место закаленных реакции на льду, пока все реакции не было прекращено.
      Примечание: Для достижения максимальной эффективности, то целесообразно, чтобы инициировать одной реакции каждые 15 или 20 с, пока все реакции инициируются, и как только желаемое время реакции прошло, гасят одной реакции, через каждые 15 или 20 секунд, пока все не останавливали. Для тех, кто с помощью анализа в первый раз, более длительный интервал может быть более управляемым.

3. Зрительные оF закаленной Реакции на нитроцеллюлозных

1. Запустить вакуум на 96-луночного дот-блот аппарат
   1. Поместите предварительно собранный 96-луночного точечный аппарат блот (раздел 1.7) во вторичный контейнер. Этот контейнер должен быть достаточно большим для устройства, чтобы быть легко разобран, так как устройство и мембрана будет радиоактивным после использования.
   2. Применение вакуума в 96-луночный дот-блот аппарат.
   3. После того, как устройство находится под вакуумом, тщательно пипеткой погашенной реакции непосредственно на нитроцеллюлозные мембраны в каждую лунку. Повторите, пока не будут загружены все реакции на мембране. Так как связывающая способность нитроцеллюлозы (75 - 110 мкг / см ²⁾ , больше , чем количество гистидинкиназа , что пятнистый, то можно предположить , что почти все киназы связывается с мембраной , когда загружен правильно.
      Примечание: В зависимости от используемого устройства, необходимо соблюдать осторожность, чтобы не проколоть нитроцеллюлозы. Заметим, что все реакции имеет контакт с гое нитроцеллюлозы. Легко для некоторых или всех реакции прилипать к стенкам скважины, а не достигают нитроцеллюлозы.
   4. Промыть лунки 100 мкл охлажденного льдом 25 мМ H ₃ PO _4. Это позволит любой объем реакционной смеси, что, возможно, захваченный в скважине для достижения мембраны, обеспечивая полную загрузку всех реакций. Разрешить весь объем течь через мембрану.
2. Устройство разборки и переноса нитроцеллюлозные мембраны
   1. Тщательно разобрать аппарат перед выключением вакуума. Советуйте, что и аппарат и нитроцеллюлозную мембрану радиоактивны в это время. Не удаляйте компоненты аппарата из второго контейнера в это время.
   2. С помощью пинцета, тщательно передачи нитроцеллюлозную мембрану из устройства к контейнеру приблизительно 200 мл 25 мМ охлажденного льдом H ₃ PO _4. Поместите крышку на этом контейнере, как мытье будет Radioactive. В это время, вакуум может быть отключен.

4. нитроцеллюлозы Обработка

1. Нитроцеллюлоза стиральная
   1. Поместите контейнер с промывной мембраной на качалке. Дайте мембрану осторожно встряхните в течение 20 мин.
   2. Через 20 мин, осторожно переливать использовали промывочный раствор в большое ведро , чтобы использовать для временного хранения отходов. Добавить 200 мл охлажденного льдом 25 мМ H ₃ PO ₄ к мембране и повторите.
      Примечание: По крайней мере три 20 мин отмывки необходимо удалить фон [γ- ³² P] -АТФ сигнала от мембраны. После третьей промывки, проверить используемое промывочный раствор для излучения со счетчиком Гейгера. Продолжить промывание мембраны, как описано выше, пока сигнал не присутствует в моющем растворе.
2. Нитроцеллюлоза сушки
   1. После того, как мембрана в достаточной степени промывают, позволяют мембраны на короткое время высохнуть на воздухе. Как правило, это занимает 5 минут или меньше.

5. Воздействие хранения люминесцентным экраном

Примечание: Этот раздел является необязательным. Подвергая мембрану на фосфорный экран является полезным в том, что она позволяет для визуализации интенсивности меченного киназы в каждом месте на мембране. Относительная интенсивность этих пятен, прямо пропорционально количеству фосфорилированного гистидинкиназа в каждом месте. Интенсивность может быть определена количественно с помощью программного обеспечения для обработки изображений, и эти результаты можно сравнить с тем, полученные от секции 7. Кроме того, этот шаг позволяет для контроля качества. Аномалии видели в этом сканирование может объяснить противоречивые результаты, полученные из сцинтилляционного подсчета.

1. подготовки экрана люминофором
   1. Перед подвергая мембраны к фосфорный экран для хранения, обнажить люминесцентный экран с белым светом в течение не менее 5 мин. Это гарантирует, что любое остаточное изображение, которое может удерживаться на экране стирается.
   2. Убедитесь, что экран чисти сухой. При необходимости, аккуратно очистите экран с чистящим раствором люминесцентного экрана, утвержденным изготовителем экрана, и вытереть насухо.
2. Препарат нитроцеллюлозную мембрану
   1. Тщательно оберните сухой нитроцеллюлозную мембрану в тонкой полиэтиленовой пленкой для предотвращения остаточной влаги от повреждения экрана люминофор. Убедитесь в том, что нет никаких морщин или пузырьков.
3. Воздействие на фосфорный экран
   1. Поместите обернутый нитроцеллюлозную мембрану в экран кассеты для хранения люминофора, поместите экран лицевой стороной вниз на мембрану, и закройте кассету. Не открывайте кассету или переместить мембрану, пока не наступит время для сканирования люминесцентный экран, поскольку мембрана сдвиг во время экспозиции вызывает двойной или смазанный изображение, которое будет захвачен.
   2. Защиту в течение не менее 4 ч, или до тех пор, как предполагает производитель, люминесцентный экран.
   3. После того, как экспозиция завершена, сканирование люминесцентный экран и захватить изображение с помощью сканера люминофора.

6. Подготовка нитроцеллюлозной мембраны для сцинтилляционного анализа

1. Понсо S окрашивание и Обесцвечивание
   1. Кратко погружать нитроцеллюлозную мембрану в Ponceau S красящим раствором (0,1% Ponceau S (вес / объем) в 5% уксусной кислоты) в течение 1 - 2 мин. Влажный всю мембрану с пятном до начала Обесцвечивание.
   2. Декантируйте избыток Ponceau S из мембраны.
   3. Промыть мембрану с DDH ₂ O , пока только пятна от гистидинкиназа окрашиваются. Обратите внимание, что эта процедура будет работать только тогда, когда все пятна содержат обнаруживаемые количества белка.
      Примечание: Этот шаг необходим, чтобы подтвердить, что киназа связывается с нитроцеллюлозы, и что белок нагрузка даже во всех точках. Она также позволяет пятнистая киназа быть легко вырезать из мембраны.
2. Вырезка пятна
   1. Используя ножницы, вырезать каждую точку на нитроцеллюлозной мембране. Не надо резать совершенно Алонг край окрашенного пятна; если мембрана была в достаточной степени промывают, фон из-за разного размера из вырезанных пятен будет незначительным. Важно только, чтобы вырезать все место для каждой реакции.
   2. Использование щипцов, тщательно передать каждую точку в сцинтилляционные флаконы. Ни один сцинтиляционной не требуется , поскольку ³² P легко обнаруживается с помощью Черенкова.
      Примечание: В качестве альтернативы, пятно можно вырезать с помощью заостренный пробки мотылька. Удалите каждую точку из нитроцеллюлозы с пробковым буром и столкнуть ее в сцинтилляционный флакон с булавкой. С помощью этого метода, мембрана не должна быть прикоснулся, дальнейшее сведение к минимуму радиационного облучения.
3. Определение CPM / пмоль [γ- ³² P] -АТФ раствора
   1. Пятно несколько разведений [γ- ³² P] -АТФ раствора (раздел 1.5) на 1 см х 1 см квадраты нитроцеллюлозы. Кратко воздух сухой.
   2. Использование щипцов, тщательно передачи каждый квадрат в сцинтилляционныхфлаконах. Ни один сцинтиляционной не требуется. Эти образцы будут использованы для получения стандартной кривой для определения CPM / пмоль раствора АТФ.

7. сцинтилляционного анализа

1. Загрузить все сцинтилляционных ампул в сцинтилляционные счетчик кассет. Загрузка кассеты в сцинтилляционного счетчика.
2. Выполнить программу сцинтилляционного подсчета для измерения CPM для каждого флакона. Эти данные, вместе с CPM / пмоль радиоактивно меченого АТР смеси (из раздела 6.3), можно использовать для расчета количества фосфорилированной гистидинкиназа присутствует в каждом месте, и таким образом скорость автофосфорилировании. ^18,19

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Представитель набор данных был создан с участием изображение , снятое с люминофором томографа (рис 1), Понсо S пятно нитроцеллюлозной мембраны (рисунок 2), а также данные сцинтилляционного счета (рисунок 3). На фиг.3А показаны кинети...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Анализ связывания нитроцеллюлозный мы описали имеет много преимуществ по сравнению с ранее используемыми методами для характеризации гистидинкиназ. По сравнению с традиционными SDS / PAGE на основе авторадиографии, наш метод более высокую пропускную способность и меньше времени. Нитроц...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphoric acid	VWR	AAAA18067-AP	For quenching reactions and washing nitrocellulose
Tris base	RPI	T60040-5000.0	Tris-HCl pH 8.0, for kinase reaction buffer
Potassium chloride	RPI	P41000-2500.0	For kinase reaction buffer
Magnesium chloride	RPI	M24000-500.0	For kinase reaction buffer
Glycerol	RPI	G22020-4000.0	For kinase reaction buffer
5'-ATP	Promega	E6011	Kinase substrate
[γ-32P]-5'-ATP	Perkin Elmer	NEG002Z250UC	6,000 Ci/mmol
96-well dot blot apparatus	Bio-rad	1706545	For spotting reactions
Nitrocellulose	Whatman	32-10401396-PK	For spotting reactions
Ponceau S	Sigma aldrich	P3504-50G	For staining nitrocellulose