Прижизненные микроскопии и Тромб индукция в мочке из безволосой мыши

Резюме

Модель уха безволосой SKH1-Hr ^ч мыши позволяет прижизненную флуоресцентную микроскопию микроциркуляции и фототоксической индукции тромба без предварительного хирургического препарата в исследуемом микрососудистом русле. Таким образом, ухо безволосой мыши является отличным в естественных условиях модели для изучения сложных взаимодействий в процессе образования тромба, микрососудистой эволюции тромба, и тромболизис.

Аннотация

Тромботический осложнения сосудистых заболеваний являются одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в промышленно развитых странах. Из - за сложные взаимодействия между клеточными и не-клеточными компонентами крови во время образования тромба, надежные исследования физиологии и патофизиологии тромбоза могут быть выполнены только в естественных условиях. Таким образом, эта статья представляет собой модель уха в безволосых мышей и фокусируется на анализе в естественных условиях микроциркуляции, образования тромбов и развития тромбов. С помощью прижизненной флуоресцентной микроскопии и внутривенного (IV) применения соответствующих флуоресцентных красителей, повторяющийся анализ микроциркуляции в предсердии легко может быть выполнен без необходимости хирургической подготовки. Кроме того, эта модель может быть адаптирована для исследований в естественных условиях различных проблем, включая заживление ран, реперфузионного повреждения, или ангиогенеза. Таким образом, ухо безволосых мышей является идеальной моделью для в ЛьвовО исследовании микроциркуляции кожи в физиологических или патофизиологических условиях и для оценки его реакции на различное системное или местное лечение.

Введение

Целью данной статьи является описание методики прижизненной микроскопии, приложенной к ушной раковине безволосой мыши для прямого наблюдения и анализа микроциркуляции, образования тромбов и эволюции тромба. При скорости падения 1 в 1000, венозный тромбоз по-прежнему является частой причиной заболеваемости. Несмотря на то, диагностика, профилактика, стратегии и методы лечения были разработаны в последние годы, одна треть венозного тромбоза проявляется как эмболии легочной артерии ^1. Артериальный тромбоз играет важную роль в сердечно-сосудистых заболеваниях, которые являются наиболее частой причиной смерти в промышленно развитых странах. Артериальный тромбоз на основе разрыва атеросклеротических бляшек участвуют в инфарктах, мезентериальных инфарктах и ​​апоплексии. Каждая операция предоставляет субэндотелиальную структуру для компонентов крови, изменяет динамику кровотока и удерживающая пациента. В эндопротезе хирургии нижних конечностей, органы тransplantation и тромбоз лоскута хирургии являются частыми причинами осложнений. тромбоз микрососудов, в частности, часто приводит к необратимым повреждениям, из-за отсутствия клинических симптомов. Точно так же, микрососудистых тромбозов играет решающую правило в нескольких заболеваний, в том числе тромботической тромбоцитопенической пурпуры, сепсис, диссеминированного внутрисосудистого свертывания, антифосфолипидного синдрома и хронической венозной недостаточности, среди других.

Несколько новых препаратов для лечения и профилактики тромбоза были разработаны в последние годы, но антиагреганты и антикоагулянты до сих пор имеют побочные эффекты, отсутствие антагонистов, и имеют длительные эффекты продолжительности. Эти недостатки приводят к проблемам в неотложной медицинской помощи. Таким образом, необходимы дополнительные исследования, чтобы раскрыть сложные процессы , которые происходят во время тромбоза, что вряд ли может быть смоделировано в лабораторных условиях .

Голая SKH1-Hr ^час мыши была обнаружена в 1926 году в зоопарке в Лондоне.Из-за генный дефект на хромосоме 14, животное теряет шерсть после постнатального дня 10. Это делает хорошо кровоснабжение предсердия доступного для прижизненной микроскопии сосудов. Средняя толщина уха составляет 300 мкм. Она состоит из двух слоев дермы, которые отделены друг от друга хряща. На выпуклой спинной стороне хряща, 3 сосудистых пучков ввести мочку. Апикальные сосудистые дуги и базальные шунты соединяют три пачки. Венул имеют диаметры в диапазоне от 200 мкм (базальной) и 10 мкм (апикальный). Мелкоячеистые капилляры окружают пустые фолликулы волосы ^2. Анатомия голой SKH1-Hr ^часа мышей делает предсердие мощной и экономически эффективной модель для исследования тромбоза.

протокол

Все эксперименты в естественных условиях (7221.3-1-006 / 15) были проведены в соответствии с немецким законодательством о защите животных и Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных (Институт лабораторных животных ресурсов, Национальный исследовательский совет).

1. Общие Keeping животных

1. Выполните эксперименты с самцам мышей ^ч SKH1-Hr в возрасте от 4 до 6 недель. Использование животных с весом от 20 до 25 г.
2. Хранить животное в патогена объекта и в стандартных условиях от 24 до 26 ° C и примерно 60% относительной влажности, с устойчивым доступом к воде и пищи неограниченных объявлений.
3. Продолжайте до пяти самцов животных в одной клетке. Обеспечить подстилку и обогащение материала во корпусе животных для их благополучия.

2. предварительная договоренность о животных

1. Взвесь мышь и загрузить соответствующее лекарственное средство (например, каннабиноиды, 5 мг / кг веса тела (м.т.)) в шприц инсулина. Администрирование препарат за 30 мин до индукции тромба.
2. Удерживая шею мыши между большим пальцем и указательным пальцем и хвостовой частью мыши с мизинцем, растянуть животное и вводят лекарственное средство внутрибрюшинно (IP) в левый нижний квадрант живота. Положите животное обратно в клетку в течение 15 мин.
3. Подготовка анестезии кетамином (90 мг / кг м.т.) и ксилазина (25 мг / кг веса тела). 15 мин до индукции тромба, анестезию мыши. Поместите мышь в клетке, слегка потянуть за хвост и впрыснуть анестетиков внутрибрюшинно инсулиновый шприц.
4. Положите мышь обратно в клетку до начала анестезии. Для проверки достаточной анестезии, зажать хвост с пинцетом.
5. Нагрузка 0,05 мл размороженной флуоресцеина изотиоцианат-меченого декстрана (FITC-декстрана, 5%, 150 кДа) в инсулиновый шприц. При заполнении шприца, убедитесь, что пузырьки воздуха не остаются, потому что даже небольшой intravenouslу (IV) -administered пузырьки воздуха могут привести к летальному исходу для животного.
6. Поместите наркозом мыши на нагревательной пластине в положении лицом вниз. Регулировка нагрева пластины до 37 ° C.
7. Поместите глазную мазь на роговице мыши. Дезинфекция кожи и использовать стерильные инструменты.
8. Вышивание две шовных материалов из полипропилена 7/0 в краниальный и каудальный край правого уха. Поместите стежки как можно ближе к краю , и как проксимально к основанию , насколько возможно (фиг.).
9. Сдвиг мыши дорсальной позиции. Закрепить все ноги на платформу acrylglass с помощью скотча. Крюк шовного материала под передними зубами и поместите голову в сгибание, придерживаясь шовного материала к acrylglass с клейкими полосками.
10. Транслоцироваться животное на платформе под стереоскопическим операции. Используйте 16X увеличение.

3. Подготовка левой яремной вены и инжекции FITC-декстрана

Примечание: Для микрофонаroscopy правого уха, подготовить левую яремную вену.

1. Используя скальпель, создать 5-мм разрез в коже на левой стороне шеи в кранио-каудальном направлении. Проанализируйте подкожную ткань с microforceps и microscissors. Либо перевязать сосуды пересечения с полиэфирной 8/0 швами или с электрокоагуляции.
2. Освободить вены от его адвентиции с помощью microforceps и microscissors, не касаясь судна.
3. Используйте подготовленный инсулиновый шприц для инъекции флуоресцентного красителя. Осторожно возьмите стенку сосуда с microforceps, без прокалывания вены. Проникнуть Надуваемые стенки сосуда с шприц и вводят FITC-декстран внутривенно.
4. Остановить кровотечение после снятия шприца с помощью ватного тампона. Избегайте крови и окрасить загрязнение уха.

4. Позиционирование правого уха прижизненной флуоресцентной микроскопии

1. Передача животное на нагревательной плите до acrylglass сonstruction с прорезью для нагревательной плиты и 0,5 см высоты плоскости для позиционирования уха.
2. Закрепить животных лицевой стороной вниз на нагревательной пластине с помощью скотча. Поместите относительно сильный и выпуклого хряща у основания уха рядом с 0,5 см высоты плоскости для уха (рис 1B) , так что апикальная часть уха может быть расположена на плоской плоскости.
3. Добавьте одну каплю при комнатной температуре 0,9% NaCl в acrylglass плоскости для того, чтобы расположить ухо. Поместите правое ухо, с заранее подготовленные швы на вогнутой вентральной стороне, обращенной вниз, на каплю 0,9% NaCl. Используя ватные тампоны, впитывать капли NaCl и пусть капиллярные силы прикрепить плоскость уха к acrylglass.
4. Лента швы на acrylglass, чтобы зафиксировать положение уха.
5. Добавьте одну каплю 0,9% NaCl при комнатной температуре к выпуклой спинной стороне уха. Осторожно положить одну покровные (0,5 см диаметра) на ухе, не сжимая базальные сосуды, входящих тысе ухо. Используя ватные тампоны, удалить как можно больше NaCl, как это возможно из-под покровным, чтобы минимизировать расстояние между покровным и целевым ухом сосудами.

5. витальных флуоресцентной микроскопией и тромбов Индукционная правого уха

1. Регулировка прижизненной флуоресцентного микроскопа для FITC-декстран визуализации (450 - 490 нм; FT: 510; LP: 520). Используйте переменную 100 Вт ртутной лампы в качестве источника света. Подключение высокого разрешения, черно-белая ПЗС-камеры на DVD-рекордер.
2. Передача животных на acrylglass, содержащей нагревательную пластину с фиксированным похищены ухом к столу прижизненного флуоресцентного микроскопа.
3. Используя 20X увеличение (20X / 0.95 числовой апертуры) и интенсивность света 20%, поиск венозного сосуда 50 - 60 мкм в диаметре и с антероградным кровотоком 400 - 600 мкм / с.
4. Добавьте одну капли воды комнатной температуры на покровный для воды погружения 63x magnificatioп цель (63X / 0.95 числовой апертуры). Используйте шприц с канюлей диаметром 1 мм и поместите каплю на цели микроскопа. Добавить достаточно воды, чтобы связаться с покровным и целью с каплей воды.
5. Сразу же после нанесения капли воды, начать запись судна в течение 20 с 20% -ной интенсивности света для измерения в автономном режиме потока диаметра и крови.
6. Начало тромба индукции через 5 мин после инъекции FITC-декстрана. С этой целью повысить интенсивность света до 100%.
7. Во время индукции тромба, закрыть отверстие микроскопа в течение 2 с в течение 30-х лет, чтобы проверить поток крови. В случае возникновения кровотока, откройте диафрагму снова. В случае остановленного потока крови, наблюдать за судном в течение 30 сек.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Судно классифицируется как окклюзировано если поток замирает в течение 30 секунд или более, или если кровь течет ретроградно. Если прямоходящий поток крови начинается снова, полностью открыть диафрагму и Contin ие индукции тромба до окклюзии сосуда происходит, как описано выше. Во время ранней индукции тромба, гарантировать, что время, когда отверстие было закрыто, чтобы проверить поток крови как можно короче, чтобы поддерживать почти непрерывный эпи-освещение. Позже, во время роста тромба, судно перфузии с меньшим флуоресцентным красителем, так что можно наблюдать непрерывно.
8. Выбор и закупорить 5 судов в ухо. Ограничение времени индукции тромба под микроскопом приблизительно 1 ч после инъекции FITC-декстрана.

6. Последующая деятельность

1. Выполните закрытие раны шеи с помощью чрескожного полипропилена 6/0 швов.
2. Во время восстановления после анестезии, положить мышь обратно в клетку и согревать животное с помощью инфракрасного света.
3. Передача записанных данных с DVD-рекордера программного обеспечения, позволяющего измерение диаметра сосудов и скорости кровотока.

_title "> 7. Осмотр левого уха

1. Пусть животное восстановить и устранить все вводили FITC-декстрана в течение 48 часов.
2. Перезапустите шаги, описанные выше, на этот раз готовит правую яремную вену и левое ухо.

8. Ткань Asservation

1. После того, как прижизненная флуоресцентной микроскопия левого уха, пробы 0,5 мл крови из вены ретробульбарного сплетения глаза с использованием стеклянного капилляра. Осторожно проникнуть во внутренний угол глазной с завинчивания движениями, пока венозную кровь не течет через капилляр. Собрать зонд в пробирку крови этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА).
2. После забора крови, принести в жертву животное путем инъекции 500 мг / кг веса тела кетамина в хвостовую вену.
3. Граф клеток крови с помощью гематологического анализатора для количественной оценки лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов, гемоглобина, и гематокрита.
4. Центрифуга оставшейся крови ЭДТА при 2500 XG и комнатной температуре в течение 10 мв. Пипетке и заморозить плазму крови для дальнейших исследований.
5. Используя ножницы, разрезать предсердия и зафиксировать их в 4% -ном формалине для гистологического исследования.

Результаты

Эффекты каннабиноидов лечения на тромбообразование

После инъекции 0,05 мл FITC-декстрана, фототоксические индукции тромба приводит к повреждению эндотелия и образованию пристеночного тромба (фиг.2 и 3). В настоящем иссле?...

Обсуждение

Есть несколько важных шагов для успешной индукции тромба в мочке уха мышей ^ч SKH1-Hr. Для устранения неполадок, соответствующие этапы протокола, указаны в скобках.

условия Экзаменационные идеальны у молодых животных в возрасте 4 - 6 недель и с низким ороговения эпидерм...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
SKH-1/hr mice	Charles River	477	can be purchased from other vendors
standard laboratory food	ssniff Spezialdiaeten	V1594-0	can be purchased from other vendors
operation stereomicroscope	Leica	M651/M655	can be purchased from other vendors
intravital microscope	Zeiss	Axiotech Vario 100	can be purchased from other vendors
objective (20X/0.95)	Zeiss	20x/0,50 W; Plan-NEOFLUAR	can be purchased from other vendors
objective (63X/0.95)	Zeiss	63x/0,95 W; ACHROPLAN	can be purchased from other vendors
black and white CCD-camera	Pieper	FK 6990 IQ-S	can be purchased from other vendors
DVD-recorder	Panasonic	DMR-EX99V	can be purchased from other vendors
sodium chloride	Braun	5/12612055/1011	can be purchased from other vendors
Ketamine 10%	Bela pharm	F3901-6	can be purchased from other vendors
Xylazine 2%	Bayer	6293841.00.00	can be purchased from other vendors
FITC-dextran 5%	Sigma	46945-100MG-F	can be purchased from other vendors
dexapanthenol 5% eye ointment	Bayer	6029009.00.00	can be purchased from other vendors
formaldehyde 4%	Sigma	HT501128-4L	can be purchased from other vendors
DMSO	Sigma	472301	can be purchased from other vendors
coverslips 5 x 5 x 1 mm	Menzel	L4339	can be purchased from other vendors
Adhesive strips	Leukosilk	4683400	can be purchased from other vendors
centrifuge	Beckman Coulter	CLGS 15	can be purchased from other vendors
hematology analyzer	Sysmex	KX-21 A6980	can be purchased from other vendors
EDTA-blood tube	Sarstedt	201,341	can be purchased from other vendors
cotton swabs	Sanyo	604-A-1	can be purchased from other vendors
infrared light	Beurer	5/13855	can be purchased from other vendors
single use synringe	Braun	2020-08	can be purchased from other vendors
insulin syringe	Braun	9161502	can be purchased from other vendors
disposable hypodermic needles	Braun	465 7640	can be purchased from other vendors
end-to-end capillary	Sarstedt	19,447	can be purchased from other vendors
heating plate	Klaus Effenberg	OP-T 185/03	can be purchased from other vendors
scissors 14.5 cm	Aesculap	BC259R	can be purchased from other vendors
needle Holder	Aesculap	BM081R	can be purchased from other vendors
microforceps	Aesculap	BD331R	can be purchased from other vendors
microscissors	Aesculap	OC496R	can be purchased from other vendors
scalpel 21	Dahlhausen	11.000.00.511	can be purchased from other vendors
Prolene 7-0	Ethicon	XNEH7470	can be purchased from other vendors
Prolene 6-0	Ethicon	XN8706.P33	can be purchased from other vendors
electrocautery	Servoprax	H40140	can be purchased from other vendors
acrylglass pad			integrated heating, 0.5 cm high plane